Реферат: Аппаратура для современной жидкостной хроматографии - текст реферата. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Реферат

Аппаратура для современной жидкостной хроматографии

Банк рефератов / Химия

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Реферат
Язык реферата: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Архив Zip, 154 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникального реферата

Узнайте стоимость написания уникальной работы

А ппаратура для современной жидкостно й хроматографии АППАРАТУРА ДЛЯ ВЭЖХ В современной жидкостной хроматографии используют п риборы самой различной степени сложности — от наиболее простых систем, собранных из минимально необходимого количества блоков, до комплектны х хроматографов, снабженных мини-компьютерами, которые контролируют заданные рабочие пара метры, формируют градиент подвижной фазы, управляют различными дополнительными устройствами (автоматический ввод 1-пробы, коллектор фр акций и др.) и проводят обработку полу чаем ых данных. Комплектные приборы с высокой степенью автоматизации обычно обеспечивают высокую производительность и точность результатов, что о собенно важно в производственных условиях для контроля качества проду кции. Однако самостоятельная сборка хроматографа из отдельных блоков д ает возможность легко модифицировать прибор в зависимости от поставле нной задачи и более эффективно использовать имеющееся оборудование. Рис. 1.1. Принципиальная схема жидкостного хроматографа: 1 — сосуд для подвижной фазы; 2 — насо с; 3 — манометр; 4 — фильтр; 5 — демпфер; 6 — термостат; 7 — инжектор; 8 — колонка; 9 — детектор; 10 — самописец На рис. 1.1 предс тавлена принципиальная схема современного жидкостного хроматографа. П ри необходимости этот продетой прибор может быть снабжен различными до полнительными устройствами. 1.1. НАСОСЫ Современные н асосы для жидкостной хроматографии представляют собой прецизионные устройства, обеспечивающие постоянную пода чу растворителя в колонку и способные создавать давле ния до нескольких десятков мегапаскалей. Производительность насосов н аходится в диапазоне от 1 мкл/мин (микроколоночная и капиллярная хромато графия) до 25— 100 мл/мин (препаративная хроматография). Насосы для ВЭЖХ должны удовлетворять следующим основным тр ебованиям. 1. Химическая и нертность материалов по отношению к подвижной фазе. Металлические дета ли насоса, контактирующие с подвижной фазой, обычно изготавливают из нер жавеющей стали, а уплотнения— из высокоинертных нерастворимых материа лов (как правило, на основе фторопласта или полиимидов). Нержавеющая стал ь не является полностью инертным материалом и коррози рует под действием сильных оснований, некоторых солей и слабой хлороводородной кислоты, которая часто присутствует в виде при меси в галогеносодержащих растворителях. Для особых случаев эти детали изготавливают из более стойких материалов — титана, специальных сплавов и ли керамики. Некоторые уплотнения разрушаются под действием отдельных растворителей (чаще всего хлорированных углеводородов), поэтому необхо димо строго соблюдать рекомендации, изложенные в инструкции к насосу. 2. Достаточно в ысокое рабочее давление. Необходимое рабочее давление определяется со противлением используемых колонок и скоростью потока и может колебать ся в весьма широких пределах. Можно считать, что давление 15— 20 МПа достато чно для решения большинства аналитических задач. Однако лучше иметь нас ос с полутора— двукратным запасом подавлению, так как при этом существе нно облегчаются условия его работы, особ енно уплотнений и клапанов. В данном случае стабильность потока подвижн ой фазы будет сохраняться значительно дольше, чем у насоса, работающего при давлениях, близких к предельным. 3. Высокая стаб ильность скорости потока. Точность поддержания скорости потока в колон ке во многом определяет результаты как качественного, так и количествен ного анализа. Для основных вариантов ВЭЖХ нестабильность потока не долж на превышать 0,5— 1%. В эксклюзионной хроматографии при анализе молекулярн о-массового распределения полимеров требования еще выше— 0,1— 0,3%. Кроме т ого, весьма желательно, чтобы насос не давал пульсации потока и имел малы й рабочий объем для быстрой смены растворителя в режиме градиентного. эл юирования. Все насосы для ВЭЖХ делятся на две группы: постоянного расхода и постоянного давления. Главными достои нствами насосов постоянного давления являются высокая производительн ость и отсутствие пульсации. Наиболее совершенной конструкцией насосо в этого типа является насос с пневмоусилителем, принципиальное устройс тво которого показано на рис. 1.2. Поршень 1 большого диаметра, приводимый в д ействие газом, поступающим по штуцеру 2, связан с поршнем 3 меньшего диамет ра, который через систему клапанов 4 осуществляет подачу жидкости из рез ервуара в колонку. Для быстрого перезаполнения насоса обратный ход порш ня происходит под действием давления газа, поступающего через штуцер 5. М аксимальное давление, развиваемое таким насосом, зависит от отношения п лощадей поршней и входного давления газа. В известном насосе фирмы «Хаск ел», используемом для упаковки колонок, оно достигает 100 МПа. Основной недостаток насосов постоянного давления — изменение расхода подвижной фазы при изменении сопротивления системы. Сопротивление колонки может повыситься из-за загрязнения входного фил ьтра, насадки или предколоночного фильтра. Оно меняется с изменением вяз кости растворителя, происходящим при колебаниях температуры и практич ески всегда наблюдающимся при градиентном элюировании. Поэтому насосы данного типа постепенно вытесняются насосами постоянного расхода и применяются, главным образом, в препаративной хро матографии и для набивки колонок. Рис. 1.2. Схема насоса постоянного давления 1— поршень воздушного цилиндра; 2, 5 — штуцеры подачи воздуха; 3 — поршень насоса;4 — клапа ны Рис. 1.3. Схема поршневого насоса постоянного расхода: 1 — электродвигатель; 2 — эксцентрик ; 3 — поршень; 4 — уплотнение; 5 — цилиндр; 6 — входной кла пан; 7 — выходной клапан; 8 — возвратная пружина Насосы постоянного расхода разделяются на две основн ые группы: шприцевые и возвратно-поступательные. Шприцевые насосы, как с ледует из их названия, по конструкции представляют собой шприц достаточ но большой вместимости, в котором электродвигатель через силовую перед ачу перемещает поршень, выдавливающий растворитель с постоянной скоро стью. После прохождения всего рабочего объема шприца поток прерывается для перезаполнения поршня. Из-за этого недостатка и сложности изготовле ния уплотнений большого диаметра шприцевые иасосы средней производите льности (до 5— 10 мл/мин) практически вышли из употребления. Однако в связи с быстрым развитием микроколоночной хроматографии, в которой расход под вижной фазы сравнительно невелик, конструкторы насосов вновь возвраща ются к этой системе, важными достоинствами которой являются высокая точ ность, беспульсационная подача растворителя и отсутствие клапанов. Вид имо, в ближайшем будущем можно ожидать значительного увеличения выпуск а шприцевых насосов малой производительности. Возвратно-поступательные насосы используют в ВЭЖХ наиболее ши роко, так как они удовлетворяют большинству требований. Практически еди нственный их принципиальный недостаток — пульсация потока, для сглажи вания которой применяют специальные демпфирующие устройства, описанны е ниже. Менее существенны недостатки — нарушение нормальной работы кла панов за счет их загрязнения механическими примесями в подвижной фазе и образование паровых пробок во время такта всасывания при работе с раств орителями, имеющими высокое давление паров (пентан, метиленхлорид и др.). Д анные насосы выпускают двух типов: поршневые, или плунжерные, и мембранн ые, или диафрагменные. В обоих случаях прокачивание растворителя происх одит за счет возвратно-поступательного движения поршня или мембраны в п олости, ограниченной шариковыми клапанами. В мембранных насосах поршень перемещается в полости с маслом, вызывая знакопеременн ые изгибы мембраны, укрепленной на другой стороне полости. Достоинством данных насосов является отсутствие контакта растворителя с уплотнение м поршня. При этом существенно снижаются требования к материалу уплотне ния поршня, а продукты его эрозии не могут засорить клапаны насоса. Изменение производительности насоса осущест вляется либо изменением рабочего объема цилиндра (посредством огранич ения хода поршня), либо изменением частоты перемещения поршня. Второй сп особ обеспечивает более точную подачу растворителя, особенно при низки х расходах. В насосах с об ычной круглой формой эксцентрика продолжительность тактов всасывания и нагнетания одинакова, что приводит к достаточно высокому уровню пульс ации потока. Конструкторам удалось заметно снизить пульсацию за счет ис пользования эксцентриков специально рассчитанной сложной формы, котор ые обеспечивают резкое сокращение протяженности такта всасывания. При окончании такта нагнетания происходит быстрее перезаполнение насоса и сразу же начинается новый цикл. Высокая стабильность потока достигнута также при существенном уменьшении рабочего объема насоса с одновремен ным увеличением частоты движения поршня (до 50 Гц). В этом случае растворит ель подается маленькими порциями, бы стро следующими друг за другом. Недостатком о писанных систем является повышенная склонность к образованию паровых пробок при работе с легкокипящими растворителями, поэтому в некоторых к онструкциях введено специальное регулирование продолжительности пер езаполнения насоса. Очень часто для сниж ения пульсации используют насосы с двумя и даже с тремя головками и разл ичные системы электронного регулир ования. Уровень пульсации у простого насоса с одной головкой составляет около 9%; применение двух головок, работающих в противофазе, снижает его пр имерно до 3%. Наиболее сложные насосы с тремя головками и специально рассч итанной формой кулачка при малом рабочем объеме обеспечивают подачу ра створителя почти без пульсации с неравномерностью не более 0,2%. По последн им данным, применение схем электронного регулирования с обратной связь ю позволяет снизить эту величину вдвое. При давлениях выше 10— 15 МПа начинает проявляться сжимаемость некоторых растворителе й, что приводит к уменьшению скорости потока. Поэтому многие насосы снаб жают специальными системами поправки на сжимаемость подвижной фазы. Достоинством поршневых насосов является возможность легко изменять пр оизводительность за счет использования сменных головок с иным диаметр ом поршня. Смена головки занимает не более нескольких минут. Ко многим моделям насосов выпускаются сменн ые головки для препаративной хроматографии с производительностью до 25 — 50 мл/мин, а некоторые конструкции имеют до трех сменных головок. Большинство современных насосов снабжено указателями и ограничителям и нижнего и верхнего пределов рабочего давления. Давление в хроматограф ической системе является исключительно важным параметром, и его необхо димо контролировать. Для этой цели обычно используют указатель давлени я с проточными тензодатчиками. Объем датчиков очень мал, поэтому не возн икает затруднений при замене растворителя в градиентном элюировании. О граничители давления автоматически отключают насос при выходе давлени я из установленного диапазона, что существенно повышает безопасность р аботы. Ограничитель верхнего предела также очень полезен для предотвра щения порчи колонок с некоторыми сорбентами , которые могут разрушиться при превышении допустимого для них рабочего давления. Одним из последних до стижений является новая конструкция насосной системы, разработанная ф ирмой «Хьюлет Пакард» (США) для жидкостного хроматографа модели 1090. В этой весьма сложной системе разделены функции точного дозирования жидкости и создания необходимого давления, что в частности, устраняет влияние сж имаемости жидкости на точность подачи. Блок дозирования представляет с обой сдвоенный шприцевой насос с вместимостью каждого шприца 110 мкл, с шаг овым электродвигателем и переключающим клапано м. Когда один шприц подает растворитель, другой заполн яется. Объем, соответствующий одному «шагу» электродвигателя, составля ет 7 нл. В конце цикла направление хода поршней меняется и одновременно срабатывает быстродействующий клапан, переключа ющий направление потоков жидкости. Процесс переключения занимает всего 50 мс. Давление, создаваемо е шприцевым насосом, не превышает 0,6 МПа. В приборе могут быть установлены три таких блока, что позволяет работать в режиме градиентного элюирован ия с тремя растворителями. Из блоков дозирования, управляемых микропроц ессором, растворители поступают в смеситель вместимостью 9 мкл, затем в диафрагменный насос, работающий с ча стотой 10 Гц по обычной схеме и создающий давление до 44 МПа, и далее в демпфе р малого объема. В описанной системе дост игнуты поистине уникальные характеристики: при скорости потока от 1 мкл/ мин до 5 мл/мин нестабильность потока составляет менее 1%, а воспроизводимо сть результатов в режиме градиентного элюирования лучше 1%. Такие параме тры позволяют успешно работать с колонками любых типов, применяемыми в а налитической ВЭЖХ. Разнообразие констру кционных решений, направленных на стабилизацию расхода растворителя, п ривело к тому, что ассортимент возвратно-поступательных насосов, выпуск аемых различными фирмами мира, весьма широк. В то же время не существует н асоса, имеющего наивысшие эксплуатационные характеристики для всех во зможных областей применения. Хотя наиболее сложн ые и дорогие модели, естественно, дают наи лучшие резул ьтаты, но для их эксплуатации требуется, высокая квалификация оператора и обслуживающего персонала. Так, в насосе с тремя головками вероятность засорения клапана значительно выше, а отыскать засоренный клапан гораз до труднее, чем в насосе с одной головкой. Поэтому такие насосы следует пр именять только при необходимости наивысшей точности подачи растворите ля, например в эксклюзионной хроматографии полимеров. Можно считать, что в большинстве вариантов ВЭЖХ вполне удовлетворительную работу обеспе чит насос с двумя головками, оптимизированной фор мой эксцентрика и регулированием расхода путем изменения частоты ходо в поршня. 1 .2 У СТРОЙСТВА ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ ГРАДИЕНТА Назначение ус тройства для формирования градиента — изменять в ходе анализа состав растворит еля таким образом , чтобы его элюирующая с ила постоянно увеличивалась в соответствии с выбранным законом. Это дол жно обеспечить элюирование из колон ки как слабо, так и сильно удерживающихся веществ с хорошим разделением в виде узких пиков правильной формы и за относительно короткое время ана лиза. Устройства для формирования градиента могут быть простыми по конс трукции или сложными в зависимости от того, какой вид градиента требуетс я, как часто он используется, какой насос имеется в наличии и т.д. Простейший вид градиента — ступенчатый, для его осуществ ления на вход насоса устанавливают многоходовой кран, которым последов ательно подают в насос растворители от самого слабого до самого сильног о, через выбираемые исследователем интер валы времени, поворачивая кран. Такой вид градиента может быть легко авт оматизирован, если к крану добавить поворачивающее его устройство и сое динить его с таймером. Недостаток ступенчатого градиента — резкие откл онения нулевой линии детекторов, когда до кюветы доходит граница нового растворителя, а также трудность проведения количественного анализа. Близким к такому ступенчатому градиенту является используемый в хроматографе «Милихром». Он формируется в. насосе по принципу «коктейля », несмеши вающиеся сло и заранее приготовленных растворов разной элюир ующей силы последовательно набирают в шприц насоса от самого сильного до самого слабого. В шприце насоса фор мируется, таким образом, многоступенчатый градиент. Рис. 1.4. Схема устройства для создани я градиента низкого давления с двумя сообщаю щимися сосудами и кранами: 1 — кран; 2 — камера смешения; 3 — магнитная мешалка; 4 — к насосу; А и Б — слабый и сильный растворители Объем каждого слоя и его элюирующая сил а подбираются исследователем экспериментально, на каждый новый анализ градиент набирается снова. При наборе слоев в шприц и при их подаче в коло нку границы слоев размываются, это уменьшает резкость ступенек градиен та и приближает его к градиенту с плавным профилем. Одно из простых устройств для создания плавного градиента изображено н а рис. 1.4. Оно представляет собой систему с двумя сообщающимися сосудами к онической формы. Когда все-краны открыты, уровни в сосудах с растворител ями А и Б одинаковы. По мере расходова ния растворителей в насос будет попадать смесь, содержащая все больше ра створителя Б и все меньше— растворителя А. Меняя форму сосудов, их объем и подачу насоса, можно получить градиенты разной формы. Экспоненциальные градиенты можно получить с использованием приспособ ления, сделанного из шприца (рис. 1.5). В шприц набирают определенный объем сл абого растворителя А. Этот объем можно менять, передвигая поршень шприца . Если включить подачу насоса, сначала на колонку будет подаваться раств оритель А, который затем будет по экспоненциальному заколу смешиваться с более сильным растворителем Б. Форму получаемого градиента можно меня ть, подбирая концентрации растворов А и Б, вместимость камеры шприца и ск орость подачи растворителя насосом. Рассчитанное на высокое давление у стройство аналогичной конструкции может быть установлено между насосо м и инжектором. Оно также позволяет получить экспоненциальный градиент. Его преимущество — возможность создания градиента для микроколонок с одним насосом, так как при этом вместимость насоса и подводящих трубок н е искажает и не задерживает начала градиента. Недостаток приведенных устройств для формирования градиента — сложность работы с ними, низкая воспроизводимость, трудность подгото вки многих смесей раство рителей, невозможность т очного формирования градиента заданной формы, а ценность в том, что в затруднительных случаях с помощью относительно несл ожных самодельных устройств удается решить задачи, принципиально нере шаемые изократически. Устройство для фор мирования градиента произвольной формы делятся на две большие группы: у стройства формирования градиента при низком давлении (на входе в насос) и при высоком давлении (на выходе из двух или более насосов). Обе группы им еют преимущества и недостатки. Появление и развитие новых приспособлен ий, методов работы и вариантов ВЭЖХ позволило уменьшить недостатки обои х вариантов устройств формирования градиента и не дало окончательного преимущества ни тому, ни другому. Система формирования градиента при высоком давлении изображена на рис. 1.6 (часть с истемы до инжектора). Как видно из рисунка, программатор 6 управляет шагов ыми двигателями насосов, подающими растворители А и Б в постоянно ме няющемся по выбранному исследователем закону соотно шении. Растворители поступают в динамический (иногда с татический, менее эффективный) смеситель с магнитной мешалкой, смешиваю тся и подаются на инжектор и колонку. Как видно из схемы, по сравнению с из ократической система усложняется и, следовательно, стоит дороже: добавл яются второй насос, программатор и смеситель, ряд электрических и гидравлических линий. Если потребуется градиент из тр ех или четырех растворителей, то для этой схемы будут н еобходимы дополнительно еще 1 или 2 насоса. Рис. 1.5. Схема устройства для создания градиента низкого давления с испо льзованием шприца: 1 — кран ; 2 — шприц; 3 — поршень шприца; 4 — камера смешения; 5 — магнитная мешалка; 6 — к насосу; А и Б — слабый и сильный растворители Рис. 1.6. Схема устройства для создани я градиента высокого давления: 1 — к инжектору; 2 — смеситель; 3 — магнитная мешалка; 4 — нас ос для подачи растворителя А; 5 — насос для подачи раств орителя Б; 6 — программатор; А и Б — слабый и сильный растворители Рис. 1.7. Схема устройства с клапанами для создания градие нта низкого давления: 1 — к инжектору; 2 — смеситель; 3 — магнитная мешалка; 4 — насос; 5,6 — клапаны; 7 — программатор; А и Б — слабый и сильный растворители Схема формирования градиента при низком давлении представлена на рис. 1.7. Управление градиентом также возложено на программатор, однако управля ет он не насосом, а двумя электромагнитными клапанами, открывая или закр ывая тот или другой по заданной программе. Этим обеспечивается поступле ние на вход насоса 4 смеси растворителей А и Б в заданном соотношении. Смес ь перемешивается в клапанной системе, подводящих линиях, поршневых каме рах и окончательно становится однородной в смесителе. На первы й взгляд кажется, что система эта проще и лучше предыдущей: клапанная система стоит, очевидно, дешевле дополнительного насоса. О днако клапанная система, работающая при некотором разрежении, из-за слож ной геометрии и в условиях смешивания при этом двух растворителей, содер жащих растворенные газы, при обычной дегазации ра ботает с постоянными отказами. Образовавшиеся при смешивании пузырьки налипают в клапанах и поршневых камерах, насос перестает подавать растворитель. Это особенно характерно для обр ащенно-фазных и буферных растворов, широко применяющихся в ВЭЖХ. Сложно не только провести глубокую дегазацию, но и. предохранять дегазированны е растворители от контакта с воздухом, приводящему к растворению газов. Стоимость сло жных дегазирующих устройств в сумме со стоимостью клапанной системы пр имерно уравнивают цену приборов, работающих с градиентом высокого и низкого давления. Однако если у исследователя воз никает необходимость в градиенте из трех или четырех р астворителей, прибор с градиентом низкого давления п ри прочих равных условиях окажется дешевле. Таким образом, суммируя преимущества и недостатки устройств для создан ия градиента высокого и низкого давления, можно сделать следующие вывод ы. Устройство для создания градиента высокого давления продето и стабиль но в работе, не требует особой дегазации растворителей, легко перестраив ается для препаративной, полумикро- и микроколоночной работы. Оно может работать с относи тельно дешевыми насосами с шаго вым двигателем и одним плунжером, работающими по циклу : медленная подача — быстрое перезаполнение. Оно может иметь встроенные в насосные линии и не вызывающие особых проблем непроточные манометры, демпферы большого объема, колонки со специальными сорбентами, «полирую щими» один или оба растворителя, — все это не сказывается на воспроизво димости и точности градиента. Устройство для создания градиента низкого давления должно обязательно иметь наде жную систему глубокой дегазации, без которой стабильная работа невозмо жна. Это может быть или система дегазации продувк ой растворителей непрерывным током гелия в процессе р аботы (большой ток вначале, и медленный для поддержания дегазированного состояния); расход гелия при этом значителен. Можно использовать систему динамической дегазации растворителей при их прохождении через полупр оницаемые фторопластовые трубки из полимера особого сорта, находящиес я в вакууме; она стоит довольно дорого, но позволяет избежать расхода гел ия и получить растворители, из которых удалено более 99% растворенных газо в. Устройство для создания градиента низкого давления должно работать с насосами, всасывающими и подающими растворители; их невозможно использ овать для микроколоночной и трудно — для препаративной работы большой производительности. Программаторы град иента создаются, как правило, на базе персональных микроЭВМ с объемом па мяти от 48 до 64 К. Запись программ градиента ведется на гибких дисках или же с использованием кассет и магнитофонов. При работе с более старыми модел ями требуется ежедневный набор программ оператором. Если для создания г радиента и управления им используют микро-ЭВМ с достаточно большим объе мом памяти и возможностью гибкого программирования с использованием я зыка БЭЙСИК, часто эту же ЭВМ используют и для обработки полученных хром атограмм. Смесители представляют собой к амеру небольшой вместимости из нержавеющей стали с помещенной внутрь м агнитной мешалкой, привод которой находится снаружи. Для однородности п еремешивания в некоторых моделях используют двойную камеру с двумя маг нитными мешалками от одного привода. Объем таких смесителей обычно сост авляет 1— 1,5 мл. Если смешение осуществляется неэффективно, растворитель в колонку и далее в детектор поступает негомогенный. Это приводит к нару шению хроматографического процесса в колонке и заметно увеличивает шу мы детектора. Если хроматографист забыл включить в сеть магнитную мешал ку, негомогенность состава растворителя и шумы детектора достигают мак симального значения. Статические смесители, представляющие собой каналы сложной формы, предназначенные для смешения за счет столкновения потоков, менее эффективны. Для препара тивной работы требуются смесители со значительно большей вместимостью , рассчитанные на работу с большими подачами растворителей. Для микрокол оночной ВЭЖХ с градиентом растворителя необходим микросмеситель вмест имостью менее 100 мкл; попытка использовать смеситель на 1— 1,5 мл приводит к сильному искажению формы градиента. Это легко понять, так как расход )астворителя при работе с микроколонками ди аметром 1 мм составляет 30 мкл/мин. Ра створитель в большом смесителе будет-(аменен новым за 30— 50 мин. 1 .3 ИНЖЕК ТОРЫ Инжекторы для ввода пробы должны обеспечивать ввод проб от 0,1 мкл до нескольких миллили тров (соответственно в микро- и препаративных колонках) с высокой во с производимосгью при давлениях до 30— 50 МПа. Раз мывание пробы в инжекторе должно быть минимальным. Инжекторы должны раб отать при повышенных температурах и в среде активных растворителей и ре агентов, при этом их уплотнения должны быть механически прочными. Было предложено большое число конструкций ин жекторов разных типов, многие из которых из-за сложности изготовления, и ненадежности работы, высокой стоимости не получили широкого распростр анения. Рассмотрим типы инжекторов, используемых в ВЭЖХ. Простейшим является инжектор с остановкой потока («ст оп флоу»). Он включает кран для перекрывания потока перед инжектором и тр ойник, к которому подсоединены колонка, подводящий растворитель капилл яр и заглушка (рис. 1.8). Когда нужно ввести пробу, останавливают насос, перек рывают кран, отворачивают заглушку, набирают пробу в микрошприц, вводят иглу до рупора в фильтр колонки, наносят пробу, вынимают микрошприц, заво рачивают заглушку, открывают кран и включают насос. Поток растворителя в ымывает пробу в колонку. Инжектор прост по конструкции, легко может быть изготовлен самостоятельно. Недостатки: много ручных операций при работ е, нестационарность потока растворителя дает ложный пик и затрудняет то чные количественные измерения удерживания, эффективности и других пар аметров. 1 — заглушка; 2 — корпус инже ктора; 3 — колонка; 4 — кран для остановки потока; 5 — под ача растворителя от насоса Рис. 1.9. Схема работы петлевого инжектора: а — заполнение петли пробой; б — ввод пробы на колонку 1— к петле; 2 — к насосу; 3 — к колонке; 4 — ввод пробы ; 5, 6 — сброс избытка пробы; 7 — петля Ин жектор с резиновой мембраной по конструкции похож на предыдущий, в нем н е используют кран остановки потока растворителя и на месте заглушки зажимается упругая резиновая мемб рана. Ввод пробы осуществляют микрош прицем, рассчитанным на работу в герметичных условиях при высоких давле ниях. Пробу вводят в поток растворит еля без его остановки путем прокалывания мембраны, введения микрошприц а до упора иглы в фильтр колонки и нанесения пробы. Инжектор прост по конструкции и легко может быть изготовл ен. Рис. 1.8. Инжектор с остановкой потока растворителя: Основной недостаток — наличие резиновой мембраны, которая на бухает в растворителях, теряет герметичность при многих проколах, выдел яет в поток растворителя ингредиенты, дающие ложные пики и повышающие фо н и шумы детектора. Частицы мембраны, выкрашивающиеся при проколах, загр язняют входной фильтр колонки, создают эффект «памяти». Выбор для мем б раны марки резины, наиболее устойчивой к данному растворителю, использование мембран многослойных с наружными слоями из фторполимеров или из металлической фольги позволяет уменьши ть, но не исключить эти недостатки. Микрошприцы высокого давления также дороги, более трудно промываются и менее надежны, чем обычные. Этот тип ин жектора также используют в основном для учебных целей. Наибольшее распространение имеют петлевые инжекторы (пет левые краны). Пробу вводят в петлю заданной вместимости при давлении, бли зком к атмосферному, с помощью микрошприца или шприца. Затем поворотом к рана петля сообщается с линией подачи растворите ля от насоса и входом колонки, проба вымывается из петли и попадает в колонку. Схема работы одного из петлевых инжекторов предс тавлена на рис. 8.9. В положении «заполнение петли» поток растворителя от н асоса идет непосредственно в колонку, а петля соединяется с линиями «сбр ос» и «ввод пробы» и находится при атмосферном давлении. В этом положени и петля промывается чистым растворителем с помощью шприца вместимость ю 2— 5 мл от остатков предыдущей пробы, затем с помощью микрошприца в петлю вводится определенный объем пробы. Проба может в водиться либо с полным заполнением петли, либо с ее частичным заполнение м. Первый способ является предпочтительным при количе ственном анализе и позволяет получить наиболее воспроизводимые резуль таты анализа. Он требует для полного заполнения петли подачи в нее объем а пробы, в 5— 6 раз превышающего вместимость петли. Это необходимо для полн ого вытеснения из петли растворителя пробой. Частичное заполнение петл и удобнее, так как позволяет, не меняя петли вместимостью, например, 50 мкл, в водить пробы от 1 до 40 мкл. При этом объем пробы, попадающий в петлю, не долже н превышать примерно 4/5 вместимости петли. Так как объем пробы, попадающий в петлю в этом случае, не точно равен тому, который подан микрошприцем (та к как часть пробы остается в подводящих каналах от конца микрошприца до начала петли), то точность количественного анализ а в этом случае будет ниже, чем при полном заполнении пе тли. Ясно представлять, что происходит пр и заполнении петли, очень важно для выбора наилучшего способа работы с и нжектором того или иного типа. Почему при полном заполнении петли нужно вводить 4— 5 объемов пробы? Почему при частичном заполнении нельзя вводи ть больше 80% от вместимости петли? Это связано с гидродинамикой заполнени я петли и иллюстрируется рис. 8.10. Из схемы видно, что из-за трения у стенок пе тли остается исходный растворитель, а передний фронт приобретает форму «языка». Если при частичном заполнении петли подать объем, равный вмести мости петли или близкий к нему, часть «языка» выйдет за пределы петли в сл ив и не попадет в колонку. Точно так же при полном заполнении петли, не выт еснив весь растворитель от стенок, невозможно получить воспроизводимы х результатов анализа. В канале 3 остается часть пр обы, которая не попадает в колонку при частичном заполнении петли. Ясно, что чем она меньше, тем лучше для работы. У инжекторов разной конструк ции эта часть пробы может быть от нескольких десятых долей микролитра до 7 — 15 мкл. Рис. 1.10. Схема размывания пробы при заполнении петли: 1 — игла микрошприца; 2— уплотнение иглы ; 3 — канал с пробой, не попадающей в колонку; 4 — петля; 5 — «язык» фронта пр обы — j ЮЛ. 1 2 3 4 5 Петлевые инжекторы обычно могут работать при давлениях до 49— 70 МПа, однако срок их службы значительно удлиняется, если прижим трущихс я деталей уменьшается так, чтобы герметичность сохранялась до 35 МПа. Это р азумно, так как очень редко работа проводится п ри давлениях выше 35 МПа. Если это все же нужно, то увеличить давле ние нажимных пружин можно очень быстро и просто за несколько минут. Петлевые инжекторы делятся на имеющие внешнюю и внутреннюю петли. Внешние петли представляют собой обычно куски капилля ра определенной вместимости, которые можно легко заме нить. Внутренние петли представляют собой каналы определенной вместим ости, выполненные в теле инжектора. Как правило, вместимость внутренних петель мала (0,06— 10 мкл), и инжекторы такого типа предназначаются для микрок олоночной ВЭЖХ. Смена такой внутренней петли— это, как правило, достаточ но сложная разборка с заменой узла инжектора на новый, имеющий другой об ъем канала. Поэтому для упрощения работы иногда такие инжекторы снабжаю т несколькими внутренними петлями, которые по желанию могут находиться в рабочей или запасной позиции. Есть инжекторы, которые могут перестраив аться от варианта работы с внутренней петлей к работе с внешней петлей. Н екоторые инжекторы снабжаются устройствами для фильтрования вводимых образцов. Существуют пневматические или электрические приводы к инжек торам, позволяющие вводить пробу по команде от микропроцессора. Приобретая инжектор, всегда следует внимательно ознакомиться с особен ностями его конструкции: какой мертвый объем до петли, какое сечение кан алов, при какой температуре и давлении инжектор может работать, какие пе тли можно с ним использовать. Учитывая, что выходят из строя пластмассов ые детали уплотнения, нужно их приобрести заранее, так же как и конусные м уфты, накидные гайки и капилляры для изго товления разных петель. Кроме ручных инжекторов, существуют многочисленные конструкции полнос тью автоматических инжекторов, которые в соответствии с заданной прогр аммой могут вводить от 20 до 100 и более образцов. Они обеспечивают выполнени е всех циклов ввода пробы: промывку петли, заполнение, ввод пробы автомат ически. При этом последовательность анализа образцов и число вводов одн ой и той же пробы могут быть заданы. Они довольно дороги, как правило, треб уют линии сжатого воздуха для работы и высококвалифицированного обслу живания. Поэтому их применение оправдано только в тех случаях, когда нео бходимо анализировать большое количество идентичных проб. Наконец, следует упомянуть об инжекторах-насосах, способных по команде п одать на колонку пробу определенного объема и остановиться. Их применен ие полностью оправдано, когда нужно многократно подавать на препаратив ную колонку воспроизводимо и без размывания один и тот же образец. С испо льзованием такого насоса, управляемого микропроцессором коллектора фр акций, можно легко собрать автоматическую препаративную изократическу ю систему, стоящую очень недорого. 1 .4 ДЕТЕК ТОРЫ ДЛЯ ВЭЖХ Детекторы для ВЭЖХ должны фиксировать изменение ка к их-либо свойств растворителя, выходящег о из колонки, связанное с наличием в нем анализируемых веществ. Это может быть вменение оптических свойств элюента (в ИК-, УФ- или видимой области), е го показателя преломления, способности флюоресцировать, электропровод ности, способности окисляться или восстанавливаться , диэлектрической проницаемости и т.д. Детекторы подразделяются на селективные и универсальные. Селективные детекторы способны зафиксировать элюирование интересующих исследова теля веществ, обладающих специфическими свойствами, на фоне многих друг их компонентов, такими свойствами не обладающих. Эти детекторы (флюоресц ентный, электрохимический и др.) находят широкое применение в анализе сл едовых количеств лекарственных препаратов в био логических образцах, микропримесей, биогенных аминов. Универсальные де текторы должны реагировать на элюирование любых веще ств вне зависимости от того, обладают они какими-то особыми свойствами и ли нет. Такие детекторы находят широкое применение в органической химии , нефтехимии, фармацевтической, химической, медицинской промышленности, биологических науках. Какими же свойств ами должен обладать идеальный детектор для ВЭЖХ? Он не должен вызывать размывания зоны пика, выходящего из колон ки, и ее уширения. Должен иметь высокую чувствительнос ть и отклик на прохождение вещества, который можно предсказать. Образец не должен разлагаться, проходя через детектор. Изменения температуры, ск орости потока и состава растворителя не должны влиять на работоспособн ость детектора. Отклик детектора на количество вещества должен быть линейным, и линейный диапазон должен быть широким. Детектор должен быть простым и удобным в работе и обсл уживании. Детектор при прохождении вещества должен давать не только количественную информацию, но и качественную, по дтверждающую состав или строение вещества. Отклик дет ектора должен появляться при прохождении через кювету любого вещества, этот отклик не должен зависеть от растворителя, он должен быть быстрым. Детекторы, используемые для ВЭЖХ, конечн о, далеко не в полной мере обладают свойствами идеального детектора. Так их , приближающихся по характеристикам к идеальным детекторам, как пламенно-ионизационный или по теплопроводности в газовой хроматографии, в ВЭ ЖХ нет. Однако имеющийся ассортимент детекторов позволяет выполнять мн огие интересные работы, причем этот ассортимент постоянно пополняется новыми разработками. Какие же характеристики детекторов нужно принимать во внимание, подбир ая подходящий для данной задачи детектор? Эти характеристики следует подразделять на те, которые связан ы с самой конструкцией детектора, и на те, которые зависят от свойств раст ворителя, анализируемого вещества. Кажд ый детектор характеризуется определенным шумом, который для разных типов детекторов выражается в разных единицах. Его об ычно определяют производители детекторов условиях, к огда он минимален. Чем меньше шум у детектора по сравнению с другим таког о же типа, тем лучше использованные конструкционные элементы, более удач ная схема, лучше регулировка. Разница в шуме у разных детекторов одного т ипа может составлять порядок и даже больше (по данным фирм-производителе й). Другая о чень важная величина — это дрейф нулевой линии, который определяется смещением нулевой линии в процессе работы детектора з а определенный отрезок времени после прогрева. Эта величина также может иметь разницу у детекторов одного типа более чем на порядок. Вместимость кюветы детектора является фактором, наряду с ее геометрией (размывающей или неразмывающей), определяющим, на сколько могут быть размыты пики, попадающие в нее из колонки. Вместимост ь кюветы должна быть не более 0,1 объема первого пика, который представляет интерес для исследователя (например, если первый такой пик выходит в объеме 30 мкл, вместимость кюветы не до лжна превышать 3 мкл). Это особенно существенно для экспресс-анализов методом ВЭЖХ, выполняемых на коротк их (3— 5 см) колонках, заполненных сорбентом зернением 3 мкм. В ажно это и длЯг-микроко лонок диаметром 2, 1 мм и менее. Исказить пик может также недостаточное быстродействие детектора (этот недостаток наиболее часто встречается у детекторов старо й разработки); если это так, то более ранние пики будут ш ире и ниже их реальной формы. Однако быстродействие более чем 0,1 с (кроме пр ямой стыковки детектора с ЭВМ) также бесполезно, ввиду того что быстроде йствие самописцев и интеграторов обычно составляет 0,3— 0,4 с отклика на 90% ш калы. Нелишне отметить, что использование самописца с медленным отклико м приводит к такому же эффекту. Линейный динамический диапазон, характеризующий диапазон концентраци й, в котором отклик детектора пропорционален концентрации, у детектора д олжен быть широким (желательно более 10 5 ), для того чтобы из одного анализа можно было определять как осн овные компоненты, так и примеси, содержащиеся в следовых количествах. Наконец, если детектор работает в градиентном режиме или в условиях, не и сключающих некоторого изменения окружающей температуры, очень большое значение имеет нечувствительность детектора к флуктуациям температур ы, скорости потока и изменению состава растворителя и стабильность его о тклика вне зависимости от изменения этих условий. 1 .4.1 Фото метры для работы в ультрафиолетовом и видимом диапазонах Фотометры, работающие в УФ-диапазоне, пожалуй, являютс я наиболее широко распространенными и популярны ми детекторами в ВЭЖХ. Это связано с их относительно ни зкой стоимостью, надежностью работы лампы (до 6000 ч и более), нечувствительн остью к изменению температуры и состава растворителя. Принципиальная схема простейшего УФ-фотометра представлена на рис. 1.11. Ис точником УФ-излучения в нем является ртутная лампа низкого или среднего давления, имеющая интенсивные линейчатые спектры, из которых лучи с опре деленной длиной волны вырезаются с помощью фильтров. Ртутная лампа низк ого давления около 90% энергии излучает при 254 нм, что дает возможность исклю чить фильтры. Иногда с ее помощью возбуждают излучение фосфорного экран а при 280 нм, которое используют как вторую длину волны. Другие лампы в сочет ании с фильтрами и (иногда) блоками питания позволяют работать при 206, 214, 229, 254, 280, 313, 334, 365 нм и более (т.е. в видимой области). Стоимость таких ламп, блоков питания к ним и фильтров определяет, имеет ли смысл использовать их или ж е перейти к спектрофотометрическому детектору. Большое значение имеет, конечно, срок службы таких ламп, который за метно различается от 300— 500 ч (что близко к сpoкy службы дейтериевой лампы спе ктрофотометра) до 5000— 6000 ч — этим также определяют преи мущества перед спектрофотометром. Нередко стоимость такого «сложного» фотометрического детектора с полным набором фильтров, ламп, блоков пита ния не меньше, а больше стоимости спектрофотометрического детектора. Рис. 1.11. Принципиальная схе ма УФ-фотометра с фильтрами: 1 — фотоприемник; 2 — рабочая микрокювета; 3 — фильтр; 4 — ртутная лампа; 5 — микрокювета сравнения Следует отмет ить, что очень многие органические вещества достаточно интенсивно погл ощают при 254 нм. Это все ароматические и полиароматические соединения, гет ероциклические соединения, вещества, содержащие в своем составе гетеро атомы, карбонильную группу и многие другие. Во всех этих случаях примене ние простейшего дешевого и надежного УФ-фотометра целиком оправдано. Чу вствительность этого прибора достигла 0,001— 0,0002 е.о.п. на всю шкалу, а характе ристики по шумам и дрейфу заметно улучшились. Поя вились в продаже для них и полные комплекты кювет от ми кроколоночных (0,5 — 2 мкл) до препаративных (с длиной оптического пути 0,1 — 0,5 мм). Выпускаются УФ-фотометры, при ближающиеся к спектрофотометрам. В них, в качестве источника излучения в монтирована дейтериевая лампа с широким спектром от 190 до 360 нм, вместо доро гого монохроматора используют фильтр. Если набор нужных длин волн невел ик, стоимость такого фотометра с набором фильтров заметно ниже, чем спек трофотометра. 1 .4.2 Спектрофотометрические детекторы Если в упрощенной схеме фотометра лампу заменить на та кой источник излучения, который может излучать монохроматический свет любой требуемой длины волны без применения фильтров, это и будет схемой спектрофотометрического детектора для ВЭЖХ. Описания достаточно сложн ых оптических схем такого источника излучения можно найти в большинств е руководств по ВЭЖХ. С помощью таких схем из широкого, непрерывного спек тра излучения дейтериевой лампы (190— 360 нм) и лампы видимого света (длина во лны более 360 нм) с использованием голографической решетки вырезается бол ее или менее узкая полоса УФ- или видимого излучения. Это излучение и попа дает в сравнительную и рабочую кюветы, которые далее работают по той же с хеме, по которой устроен фотометр. Различия между разными конструкциями спектрофотометрических детекторов вызываются более или менее удачным и оптическими схемами, более узким или широким пучком монохроматическо го света, лучшей или худшей воспроизводимостью «повторной установки то й же длины волны. Различают также УФ-спектро-фотометрические детекторы, использующие в качестве источника излучения только дейтериевую лампу, и работающие в УФ-и видимом диапазонах — они дополнительно оснащаются л ампой видимого света. Характеристики разных спектрофотометров так же, как фотометров, могут з аметно различаться по шумам, дрейфу нулевой линии, максимальной чувстви тельности — эта разница может составить более одного порядка. Особенно большая разница между старыми моделями менее удачной разработки, оптич еские и электронные блоки которых из-за длительной работы состарены и уж е не обеспечивают паспортных характеристик, и новыми моделями последни х разработок. Это следует учитывать, особенно в тех случаях, когда достижение максимально возможной чувствит ельности только и позволяет решить поставленную зада чу. Если такая задача не ставится, нет смысла гнаться за рекордными показ ателями спектрофотометра, а лучше выбрать более дешевую модель, но в бол ее полной комплектации. Основная труднос ть при работе со спектрофотометрами — это относительно короткий срок с лужбы довольно дорогих дейтериевых ламп. Он составляет обычно 300— 700, редк о 1000 ч, после чего шумы резко возрастают и лампу необходимо менять. Если спектрофотометр предполагается установ ить и эксплуатировать в условиях атмосферы, содержащей пары органическ их веществ, воды, пыли (например, в производственных лабораториях), целесо образно приобрести спектрофотометр, чувствительная оптическая схема к оторого герметично защищена от вредного влияния загрязнений атмосферы . Этому же способствует регулярная замена осушителя, обычно силикагеля, помещаемого внутри спектрофотометра. Необходимо укомплектовать спектрофотометр запасными де йтериевыми лампами, запасными кварцевыми окнами и про кладками для кюветы (прокладки часто одноразового использования), микро колоночной и препаративной кюветами, если такие режимы работы могут пон адобиться. Спектрофотометр по своим хара ктеристикам приближается к универсальным и селективным детекторам (в з ависимости от выбранной длины волны). При длинах волн, близких к 190 нм, он по зволяет детектировать сахара, жиры, сложные и простые эфиры, ПАВ полиокс иэтиленгликолевого ряда и другие вещества, практически не поглощающие УФ-излучения при 210 нм и выше — здесь он приближаетс я к универсальному детектору. Некот орые спектрофотометры оснащены добавочными устройствами, которые позв оляют записать (остановив поток растворителя в момент прохождения пика через кювету) ультрафиолетовый спектр пика, соответствующего данному в еществу. Такая возможность часто представляется начинающим очень зама нчивой. Однако следует учитывать, что УФ-спектр са м по себе не очень информативный. Можно поступить проще, собрав препарат ивно фракции, соответствующие интересующим пикам, и исследовать не только их УФ-спектры, но и другие физико-химические характе ристики. Существуют быстро сканирующие с пектрофотометрические детекторы, которые позволяют снять УФ-спектр ве щества при его прохождении через кювету без остановки потока. Один из на иболее удачных детекторов такого типа используют в хроматографе «Мили хром», в котором с помощью зеркала, поворачивающегося по заданной програ мме на определенный угол с заданной частотой, кюветы с образцом и сравни тельная кювета освещаются последовательно монохроматическими лучами с выбранными оператором различными длинами волн. Получаемая при этом хр оматограмма, представляющая собой комбинацию из двух, трех или более хро матограмм, снятых при разных длинах волн, позволяет получить качественн ую информацию о возможных примесях, замаскированных в одном пике, о прир оде и структуре вещества, о длине волны, при которой поглощение данного в ещества максимально и можно определить его минимальное количество. Эта информация часто позволяет по одной хроматограмме решить сразу нескол ько достаточно сложных задач: обнаружить примеси, установить чистоту ве ществ, определить длину волны, при которой поглощение каждого вещества н аибольшее, провести идентификацию. Работать с таким детектором, конечно , сложнее, чем с простым спектрофотометром. Существуют еще более усложненные спектрофотометры, например т акие, которые позволяют, в соответствии с записанной программой, изменят ь длину волны для каждого пика или группы пиков таким образом, чтобы полу чить максимальную чувствительность. Длина волны при этом меняется авто матически несколько раз за время анализа. В заключение хотелось бы подчеркнуть два положения. Применени ю спектрофотометров как универсальных детекторов, работающих при длин ах волн около 200 нм, в большой мере препятствует очень малый в ыбор растворителей, УФ-прозрач ных в этом диапазоне. То лько тщательно очищенные ацетонитрил и вода могут использоваться в обр ащенно-фазном варианте при 200 нм и ниже. Получить такие высокочистые раств орители очень трудно, и стоят они дорого. Еще труднее очистить для работы в этой области алканы (гексан, гептан и др.). 1 .4.3 Рефрактометр ические детекторы Дифференциальный рефрактометр непрерывно регистрир ует изменение показателя преломления элюата на выходе из колонки. Главн ым достоинством этого детектора является универсальность, так как при в ыборе подходящего растворителя он может детектировать любые вещества. Поэтому он занимает второе место (после УФ-детектора) по частоте использ ования. К другим достоинствам рефрактометра относятся возможность раб оты с любыми растворителями в широком интервале скорости потока, невысо кие требования к чистоте подвижной фазы, надежность и удобство в эксплуа тации. Некоторые модели детекторов могут работать при температуре до 150 ° С, что является исключительно важным для эксклюзионной хроматографии р яда синтетических полимеров. Рефрактометр представляет собой недеструктивный концентрационный де тектор средней чувствительности. Последняя определяется разностью пок азателей преломления элюента и анализируемых веществ и часто может быт ь повышена за счет правильного выбора подвижной фазы. В оптимальных усло виях предел обнаружения для рефрактометра достигает 5• 10 -7 г/мл. Основные недостатки рефрактометриче ских детекторов— практическая невозможность использования при гради ентном элюировании и необходимость тщательной стабилизации температу ры. Для работы на максимальной чувствительности нужно поддерживать тем пературу элюента и обеих ячеек кюветы. с точностью до 10 -3 -10 -4 °С, ч то затруднительно даже при помещении кюветы в металлический блок с боль шой теплоемкостью и использовании эффективных теплообменников. Послед ние, в свою очередь, увеличивают мертвый объем между колонкой и кюветой д етектора, что приводит к дополнительному размыванию хроматографически х зон и снижению эффективности разделения. Рефрактометры весьма чувствительны к пульсации потока, поэтому при раб оте с этими детекторами необходимо применять демпфирующие устройства. Промышленность производит рефрактометрические детекторы трех типов, р азличающиеся принципами измерения. Рефрактометр оптического отклонения — наиболее распространенный тип данно го прибора. Принцип действия детектора основан на том, что при прохожден ии луча света через кювету, заполненную двумя жидкостя ми с различными показателями преломления, луч отклоняется на угол, пропо рциональный разности этих показателей преломления. Принципиальн ая схема рефрактометра показана на рис. 8.12. Свет от лампы 1 проходит через м аску 2, собирается в параллельный пучок линзой 3 и попадает в кювету. Кювет а представляет собой две ячейки в виде призм с общей гранью; в измеритель ную ячейку 4 поступает элюент из колонки, а сравнительная ячейка 5 заполне на чистым растворителем. При изменении показателя преломления в измери тельной ячейке луч света отклоняется от первоначального направления, отражается зеркалом 6 обратно в кювету, сно ва отклоняется и через линзу 3 фокусируется на фотосопротивлении 7. После днее вырабатывает электрический сигнал, пропорциональный положению лу ча света, который усиливается электронным усилителем 8. Специальная стек лянная пластина 9 служит для установления оптического нуля. Рефрактометр оптического отклонения может работать с любыми растворителями и имеет широкий диапазон линейности. Вместимость кюветы обычно равна 10 мкл, а пор ог чувствительности составляет 5• 10 -8 -2• 10 -7 ед. рефракции. К этому типу принадлежат широко известный рефрактометр R 401 фирмы «Уотерс» и уникальный лазерн ый рефрактометр ЛР-1 [24] с вместимостью кюветы всего 0,1 мкл. Рис. 1.13. Схема рефрактометра Френеля : 1 — призма; 2 — зеркальная стальная пластина; 3 — проектор; 4 — кюветы; 5 — фокусирующие линзы; 6 — сдвоенное фотосопротивление Рефрактомет р Френеля. Действие данного детектора основано на зако не Френеля, который гласит, что количество света, отраженного от поверхн ости раздела двух веществ (жидкости и стекла), пропорционально разности показателей преломления этих веществ и углу падения света на поверхнос ть раздела. Для получения максимальной чувствительности угол отражени я должен быть близок к критическому. Основой конс трукции рефрактометра Френеля (рис. 8.13) является стеклянная призма 7 с углом при вершине 90°, основание которой является верхней с тенкой кювет. Измерительная и сравнительная щелевидные кюветы образов аны отверстиями специальной формы в тонкой прокладке из фторопласта, за жатой между основанием призмы 1 и зеркальной пластиной из нержавеющей ст али 2 (нижняя стенка кювет), которая одновременно является теплообменник ом. Проектор 3 вырабатывает два параллельных пучка света, которые сфокус ированы на поверхности раздела стекла и жидкости в рабочей и сравнитель ной кюветах 4. Световой поток в кюветах проходит через тонкий слой жидкос ти и отражается от пластины 2. Отраженный свет фокусируется линзами 5 на из мерительное и сравнительное фотосопротивления 6. Разностный сигнал уси ливается электронным усилителем. Проект ор 3 смонтирован на отдельной оптической скамье, которую можно поворачив ать для изменения угла падения и поддержания угла отражения, близким к к ритическому. Главным достоинством рефра ктометра Френеля является малая вместимость кюветы — 3— 5 мкл, что позво ляет принять его в сочетании с современными высокоэффективными колонк ами. Основные недостатки — необходимост ь использования двух призм (1,31— 1,44 и 1,40— 1,55) для перекрывания всего требуемо го диапазона показателей преломления растворителей и очень высокие тр ебования к чистоте кювет. Этот детектор наиболее чувствителен к пульсац иям потока и имеет меньший диапазон линейности, чем рефрактометр оптического отклонения, а порог чувствитель ности— ~10 -7 ед. рефракции. Основным прои зводителем рефрактометров Френеля является фирма «LDC» (детекторы типа « Рефрактомонитор»). Интерферометрически й рефрактометр относительно недавно разработан фирм ой «Оптилаб» (Швеция) и выпускается только разработчиком. Он представляе т собой интерферометр c двумя Проточными кюветами, который измеряет разн ость показателей Преломления в единицах длины световой волны. По данным фирмы, у этого детектора очень высокая линейность сигнала, а чувствитель ность на порядок выше, чем у других дефрактометров. Однако небольшой опы т работы с этим детектором показывает, что для получения стабильной нуле вой линии требуется очень тщательное термостатирование всей хроматогр афической системы, и полностью реализовать его высокую чувствительнос ть практически не удается. 1 .4.4 Флуориметрические детекторы Детектирование по флуоресценции применяют в биологи и, медицине, форма-кологии, при анализе пищевых продуктов и контроле загр язнения окружающей среды. Флуоресцентными свойствами, т.е. способностью излучать свет (в видимой области спектра) под действием ультрафиолетово го излучения, обладают многие биологически-активные вещества: лекарств а, витамины, стероиды. Красители, соединения с сопряженными связями, в том числе полиядерные ароматические углеводороды, также можно определять с помощью флуориметрического удетектора, при этом чувствительность оп ределения велика. Интенсивность флуоресцентного излучения зависит от интенсивности воз буж дающего излучения и квантового выхода процес са возбуждения. Поэтому для повышения чувствительнос ти метода следует использовать достаточно мощные источники света, напр имер газоразрядные лампы или лазеры. Применение лазеров позволяет дете ктировать количество вещества на уровне 10 - 12 г. Метод двухфотонного ла зерного возбуждения отдает возможность использовать лазер с более низ кой энергией, например, аргоновый. Для внедрения в практику такого метод а необходимо иметь достаточно широкий спектр лазеров, перестраиваемых по длинам волн. Чувствительность детекторов по флуоресценции для некот орых соединений оказывается на несколько порядк ов выше чувствительности детекторов по поглощению, поскольку отсчет удается вести фактически от интенсивности регистриpyeм огo излучения, близкой к нулю, на которую не накладывается возбуждающее и злучение. Разработаны детекторы, которые могут одновременно работать и как спект рофотометры и как флуориметры. Детекторы с монохроматорами, позволяющи ми выбрать необходимые длины волн для возбуждающего и флуоресцентного излучения, обеспечивают высокую чувствительность и селективность, одн ако они оказываются значительно более дорогими, чем флуориметры с посто янной спектральной полосой. Одним из надежных флуориметров является де тектор «Кратос». В качестве причин уменьшения чувствительности детекторов следует указ ать на поглощение излучения при высокой концентрации вещества в ячейке, а также на потерю излучения за счет отражения от окошек яч е йки. Поэтому при работе с флуо риметром следует использ овать достаточно разбавленные растворы, кроме того, возможно применени е детекторов без окошек, например с Не— Cd-лазером. Некоторые нефлуоресцирующие соединения разделяют в виде производных с флуорогенными веществами. Производные получают до хроматографическог о разделения или после, вводя реагент в Т-образное устройство между коло нкой и детектором. Амины и фенолы образуют диазильные производные при вз аимодействии с 5-диметил-амино-1-нафтилсульфохлоридом до разделения, а ам инокислоты после разделения обрабатывают флуорескамином. Флуориметр п рименяют при анализе микропримесей, когда мала концентрация растворен ного вещества, подлежащего обнаружению. Хотя динамический диапазон флу ориметра достаточно большой (10 4 ), его линейный динамический диапазон может быть ограничен для некоторых рас творенных веществ относительно узким интервалом концентраций (10-кратным). Для количественного анализа его сл едует проверять в интересующем интервале концентраций. Перед количес твенным измерением необходимо убедиться в отсутствие фоновой флуоресц енции, эффектов гашения и проверить отклик детектора на реальный образе ц. Кислородосодержащие растворители гасят флуоресценцию, и их так же как и элюенты, поглощающие свет в области возбужденного излучения, нельзя при менять. Галогенсодержащие растворители (хлороформ и метиленхлорид) дол жны быть использованы с осторожностью, так как имеют тенденцию ослаблят ь флуоресценцию. Если в растворителе нет флуоресцирующих веществ, флуор иметр может работать в градиентном режиме. Флуориметр меньше, чем другие детекторы, зависит от изменений температуры или давления. Однако уменьш ение температуры или увеличение вязкости некоторых растворителей затр удняет флуоресценцию. 1 .4.5 Другие детекторы Кроме детекторов, описанных выше, для ВЭЖХ используют и другие приборы: электрохимический, инфракрасный, детектор с диодной ма трицей, масс-спектро метрический, трансп ортный с пламенно-ионизационным детектированием, радио активный, по диэлектрической проницаемости, электронозах ватный, кулонометрический и др. Одни из них обладают вы сокой селективностью или чувствительностью, другие дают важную качест венную информацию. Рассмотрим более подробно некоторые из них. Рис. 1 .14. Электродн ая ячейка электрохимического детектора : 1 — выход колонки; 2 — к электроду ср авнения; 3 — фтороплатовая прокладка; 4 — рабочая камер а кюветы; 5 — рабочий электрод; 6 — блок ячейки Электрохимический детектор . Этот детектор можно применять для анализа всех веществ, об ладающих электрохимической активностью, т. е. способ при определенном по тенциале окисляться или восстанавливаться , соответственно отдавая или принимая гектроны. В водных раство рах эти потенциалы могут быть от +1,2 до -0,8 В (электрод сравнения — хлорсереб ряный). Вещества, содержащие фенольную, индольную или аль дегидную группы, способны окисляться при низких потен циалах (0,4— 0,7 В), а вещества с нитро- или кетогруппами — восстанавливаться. Так, важные в биологии классы веществ — катехоламины и 5-гидроксииндолы — в этих условиях способны окисляться, отдавая два электрона. При этом и возникает ток в кювете детектора, который затем у силивается амперометрическим детектором. Электродная ячейка (кювета), схема которой представлена на рисунке 1.14, сос тоит из двух блоков, разделенных фторопластовой прокладкой с вырезом, пр едставляющим собой рабочую камеру. В центре камеры расположен тонкосло йный электрод (анод) из стеклоуглерода. Электрод сравнения размещается н а выходе из ячейки. Вместимость рабочей камеры 1 мкл, что позволяет работа ть с микроколонками. Электрохимический детектор более селективен при низких потенциалах ра бочих электродов. Для 5-гидроксииндолов нужен потенциал 0,5— 0,55 В, для катех оламинов — 0.5— 0,7В, для пептидов — 0,9— 1,2В. Чувствительность и специфичност ь электрохимического детектора высокие. По чувствительности они не уст упают кулонометри-ческим детекторам, хотя окисляющая способность тонк ослойных электродов с рабочей поверхностью 2— 4 мм 2 составляет лишь 1— 10% от количества анализируемого вещ ества. Нижний предел детектирования катехоламинов и 5-гидроксииндолов с оставляет от 5 до 20 пг введенного в колонку вещества. На рис. 8.15 приведена хро матограмма 5-гидроксииндолов из солянокислого экстракта 0,5 мл плазмы кро ви. При работе с электрохимическим детектором необходимо учитывать следую щее. Фоновые шумы тем ниже, чем чище используемые реактивы, поэтому фосфа ты нужно очищать перекристаллизацией, использовать высокочистую воду и растворители марок «осч» или для ВЭЖХ. Шлифовать поверхности рабочего электрода следует по мере его загрязнения и увеличения шумов не чаще 1 ра за в месяц с последующей промывкой его 50%-ным метанолом. Обязательным явля ется хорошее дегазирование растворителей, желательно продувкой гелием . Электрохимический детектор находит применение в анализе катехоламино в, серо т онина , ацетилхолина и их метаболитов, нейропептидов, ряда лекарственных препаратов. Его можно использ овать для анализа фенолов, ароматических аминов, тиоспиртов, аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты и других веществ в р ежиме окисления. В режиме восстановления им можно дете ктировать хиноны, нитросоединения, металлоорганичес кие и другие coединения. Существуют др угие типы ячеек, кроме вышеописанной, в том числе с капающим ртутным элек тродом, трубчатым электродом, многоэлектродные ячейки и др. УФ-детектор с диодной матрицей. Как уже отмечалось выше, в УФ-детекторах широко распространенных типов используют прохождение через кюветы (ка к образца, так и сравнительной) монохроматического све та. В УФ-детекторе с фильтрами такой свет из линейчатого спектра испуска ния ртутной лампы вырезается фильтром, а в спектрофотометре — вырезает ся из широкого спектра испускания дейтериевой лампы с использованием д ифракционной решетки. Только в сканирующем спектрофотометре (например, с «прыгающим» зеркалом, используемым в «Милихро ме») кювета освещается последовательно несколькими м онохроматическими лучами света. В п оследнее время появилось очень изящное решение, позволяющее получать н епрерывно информацию о полном УФ-спектре веществ, проходящих через кюве ту. В этом случае через кювету прохо дит полихроматический свет, т.е. весь непрерывный спектр испускания дейт ериевой лампы, который после кюветы попадает на дифракционную решетку, г де делится на монохроматические пучки, каждый из которых попадает далее на свою фотоячейку (фотодиод), расположенные в ряд или линейку. Отсюда название — детектор с диодной матри цей или диодной линейкой. С каждой такой ячейки можно в любой момент полу чить информацию о том, как вещество, проходящее через кювету, поглощает свет при данной длине волны. Существуют диодные линейки с разным числом диодов: 8, 32, 64 и более. Если вывести информацию с каждого диода на самописец, то он запишет столько хроматогр амм, сколько есть диодов, каждую при своей длине волны. Каждая такая хрома тограмма может быть рассмотрена, рассчитана, исследована в совокупност и с любой другой или другими с привлечением математических методов с цел ью нахождения примесей в пиках, примесей, которые не детектируются при и спользовании какой-то одной длины волны. Если такой детектор подключить к многоканальному компьютеру, он может вести обсчет хроматограмм, напри мер, при 8 длинах волн. Если используют достаточное число диодов, может быт ь в любой момент записан полный УФ-спектр вещества в кювете. Рис. 1.15. Хроматограмма 5-гидроксииндо лов из солянокислого экстракта 0,5 мл плазмы крови, полученная на колонке р азмером 200х3,2 мм с нуклеосилом С18 (5 мкм), подвижная фаза — 0,1 М нитратно-фосфатный буферн ый раствор с 12% метанола и 0,5 мМ октил сульфата, рН==4,6, расход 0,8 мл/мин, потенциал +0,5 В, проба 50 мкл: 1 — 5-окситриптофан; 2 — 5-оксииндолил-З-уксусная кислот а; 3 — N-метилдопамин (стандарт); 4 — серотонин Вообще можно считать, что детектор с диодной матрицей— это детектор, наиболее прибли жающийся к универсальному детектору для исследовательской работы. Он п озволяет, сняв только одну хроматограмму, получить очень большой объем информации не только количественной, но и качеств енной. Такие детекторы выпускаются в настоящее время у же несколькими фирмами, и появляются работы по их использованию, особенн о там, где объекты исследования достаточно сложны, а объемы проб очень ог раничены. Хотя стоимость таких детекторов с полным набором требуемого о бслуживающего оборудования (достаточно мощных компьютеров, многоканал ьных интеграторов, графопостроителей, дисководов с дисками и т.д.) достат очно высока, однако можно ожидать относительно быстрого снижения их цен ы в будущем и расширения применения в разных областях. ИК-детекторы . Де текторы, основанные на поглощении в инфракрасной области спектра, в ВЭЖХ применяют сравнительно недавно и в достаточной степени ограниченно. Гл авной причиной такого положения является несовместимость ИК-детектора с основными растворителями, применяемыми в адсорбционной и обращенно-ф азной хроматографии, а также сравнительно невысокая чувствительность. Практически для детектирования можно использовать только некоторые по лосы с наиболее высокими молярными коэффициентами поглощения, а в качес тве подвижной фазы — главным образом хлорированные углеводороды. В час тных случаях, например при детектировании по поглощению карбонильной г руппы или двойной связи, для работы пригодны очень многие растворители в широком диапазоне полярности — от гексана до ацетонитрила и метанола. Рис. 1.16. ММР (1, 2) и распределение по составу ( 1’ , 2') сополимеров пиперилена с метилметакрилатом (ММА); продолжительность сополимеризации: 1 ч (1, 1’ ). 18 ч (2, 2') Несмотря на э ти недостатки, этот детектор имеет н есомненные достоинства. Во-первых, он является одновременно универсаль ным и селективным: при детектировании по поглощению С-Н-связи он обнаруж ивает практически любые органические вещества, а по поглощению функцио нальных групп (например, ОН, С=О, С=С и т.д.) - только соединения, содержащие так ие группы. Во-вторых, сигнал детектора почти не зависит от молекулярной м ассы вещества, что существенно облегчает количественную интерпретацию результатов. В-третьих, он может работать при температурах до 150 °С. Все эти особенности обусловливают ценность ИК-детектора для эксклюзионной хр оматографии синтетических полимеров. При исследова нии сополимеров ИК-детектор позволяет получить уникальную информацию о композиционной неоднородности, которую зачастую нельзя получить ник акими другими методами. На рис. 1.16 приведен ы результаты исследования двух образцов сополимеров пиперилена с мети лметакрилатом. Композиционную неоднородность оценивали по соотношени ю соответствующих высот на двух хроматограммах, записанных ИК-детектор ом Миран-1A по поглощению групп С-Н (А,=3,43 мкм) и С=0 (^=5,75 мкм). Первая Хроматограмма отражала общее ММР сополимера, а вторая - распределение метилметакрилата в пределах этого ММР. Хроматограммы сни мали на составной колонке размером 2(300Х7,8 мм) с ц-сферогелем (10 3 А+10 5 А) при 40 °С и скорости потока тетрагидр офурана 1 мл/мин. Данные рис. 8.16 наглядно показывают изменение дифференциа льных кривых ММР, состава и композиционной неоднородности на начальной и конечной стадиях реакции, которые обусловлены различной реакционной способностью сомономеров. Чувствительн ость ИК-детектора в оптимальных условиях достигает 10 -6 — 5.10 -7 г/мл, т. е. сопо ставима с чувствительностью рефрактометра. В последние годы ведутся интенсивные исследования по использо ванию в качестве детекторов ИК-спектрофотометров с преобразованием Фу рье, что позволит повысить их чувствительность примерно на порядок. Литература : 1. Fitzpatrick F. A., Wana lda M. A., Kaiser D . G. Anal. chem, 1977, v. 49, p. 1032. 2. Dunlap K.L., Sandridge R. L., Keller . Anal. Chem, 1976, v. 48, p. 297. 3. Poole C.F, E. A . J. High Resol. Chromatogr. Commun., 1978, v. 1, p. 83. 4. Denkert M. E. A . J. Chromatogr, 1981, v. 218, p. 31 - 43. 5. Bartha A.E. A . J. Chromatogr, 1984, v. 303, p. 29 - 38. 6. Gloor R., Johnson E. L.. Chromatogr. Sci, 1977, v. 15, p. 413 - 423. 7. Kraak J.C ., Jonker K. M., Huber J.F. K. J. Chromatogr, 1977, v. 142, p. 671 - 680. 8. Wehli A. E . A .J. Chromatogr, 1979, v. 149, p. 199 - 210. 9. Даванко в В . Л . Журн . ВХО им . Менделеева , 1983, т . XXVIII, № 1, с . 25 - 29. 10. Даванко в В. А. в кн. Прикладная хроматография Под р ед. К. И. Сако дынского. М, Наука, 1984, с. 24 - 32. 11. Davankov V. A., Kurganov A. A., Bochkov A. S.fln Ad vances in Chroma-tographyed. J. C. Giddings E. A. N. Y, M. Dekker, 1983, v. 22, p. 139— 185. 12. Apffel J. A., Alfredson T. V., Major R.E./J. Chromatogr, 1981, v. 206, p. 43 - 57.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Пошаговая инструкция по избавлению от неконтролируемых вспышек гнева:
1. Закройте глаза...
2. Глубоко и медленно вдохните-выдохните...
3. Откройте один глаз...
4. Стреляйте!
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, реферат по химии "Аппаратура для современной жидкостной хроматографии", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru