Реферат: Хламидиоз. Методы определения, диагностики - текст реферата. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Реферат

Хламидиоз. Методы определения, диагностики

Банк рефератов / Медицина и здоровье

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Реферат
Язык реферата: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Архив Zip, 37 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникального реферата

Узнайте стоимость написания уникальной работы

ХЛАМИДИОЗ - СОВР ЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ Цитоскопичес кие методы обна ружения хламидий При цито скопическом методе одновременно с поиском цит оплазматических клеток-включений Провачека учитываетс я количество лейкоцитов как показателя воспал ения , а также дополнительная информация о наличии сопутствующей бактериал ьной микрофло ры , дрожжеподобных грибов , трихомонад и т.п. Показания : Острая фаза заболевания. Материалом для исследования служат соскоб ы из уретры у мужчин и уретры и /и ли цервикального канала у женщин . Материал берут специальными щеточками или ложечками Ф олькмана . Выделения из цервикального к анала удаляются ватным тампоном . Щеточка ввод ится в канал на 1-2 см , вращается 15 секунд . Соскобный материал распределяется на предметн ом стекле , высушивается на воздухе и фикси руется в метаноле или холодном ацетоне. Наиболее популярна окраска по Ром ановскому-Гимзе . После окраски препараты просматри ваются в световом микроскопе , используя иммер сионный объектив (х 90). При этом цитоплазма к леток окрашивается в голубой цвет , ядра в фиолетово-синий , цитоплазматические вклю ч ения определяются в виде темно-синих и ли розовых микроколоний на фоне голубой ц итоплазмы . На стадии элементарных включения х ламидий окрашиваются в розовый цвет , на ст адии элементарных телец -в синий. Цитоскопический метод широко доступен , но эффективен лиш ь при острых формах инфекции , значительно менее эффективен и ин формативен при хронических формах заболевания При урогенитальном хламидиозе частота обнаруже ния телец Провачека в соскобах уретры и цервикального канала не превышает 10-12 %. Наличие этих теле ц подтверждает диагноз х ламидиоза , однако их отсутствие не исключает наличие инфекции. Прямая иммунофлюо ресценция (ПИФ ) Этот мет од предусматривает прямое выявление антигенов хламидий . При люминесцентной микроскопии включе ния хламидий определяются в вид е зеле ной или желто-зеленой флюоресценции включений на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток Включения могут иметь зернистую гомогенную или смешанную структуру. Показаниям и для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются : 1.Острая фаза забо левания. 2.Хроническая фаза заболевания 3 Установление этиологии хронического инфекц ионного процесса урогенитального тракта 4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом 5. Бесплод ие неясного генеза. Диагностичес кая информативность ПИФ связана с тем , что с ее помощью выявляются не то лько корпускулярные , но и растворимые антиген ы хламидий Этот метод не зависит от в озможного изменения тинкториальных свойств микро организма в процессе заболевания и лечения . ПИФ-метод является важнейшим скриннинговым мет од о м диагностики урогенитального хлам идиоза . Его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител составл яет соответственно 65-90% и 85-90%. При оценке результат ов следует учитывать , что только показатели внутриклеточной флюоресценци и могут оцениваться в качестве положительного результата этого теста при использовании поликлональных антихламидийных антител , при использовании м оноклональных - результат считают при наличии 10 ЭТ в поле зрения . Соскобные препараты гот овят также , как и дл я цитоскопич еских исследований. Выпускают диагностические наборы , содержащие моноклональные антитела для ПИФ , следующие фирмы : Syva, Drfco, Kallastad, Bartrels, Boots celltech, California Integrated Diagnostics, Orion Diagnostica. Реагенты фирм Syva, Difco, Kallastad представляют собой меченные ФИТЦ мон оклональные антитела к основному белку наружн ой мембраны хламидий , а реагенты других фи рм - моноклональные антитела к родоспецифическому хламидийному липолисахариду (ЛПС ). В России ЗАО “НИАРМЕДИК плюс” при НИ И ЭМ им . Н.Ф . Гамалеи РАМН выпускает моноклонал ьные антитела к ЛПС хламидий , которые успе шно конкурируют с продукцией иностранных фирм по качеству продукции . Это набор “Хламоно скрин” для определения моноклональных антител к родоспецифическому липополисахари д но му антигену и набор “Хламоноскрин -2” для определения моноклональных антител к видоспе цифическому белковому антигену хламидий трахомат ис . Наборы имеют ФС 42-359598 и регистрационное у достоверение Минздрава России 93/ 270/ 9 . Моноклональные антитела отлич аются др уг от друга по вызываемой яркости свечени я , постоянству выявляемых форм ЭТ и степен и специфичности . Для диагностики хламидий эти м методом необходим люминесцентный микроскоп. В целом , метод ПИФ отвечает критериям высокой чувствительности и специфичн ости , но требует исполнения опытным , компетентным лабораторным работником. Высококвалифицированная экспертная оценка ме тодом ПИФ редко бывает доступной , поэтому средняя чувствительность его снижается . Метод недостаточно чувствителен и для стабильного опред еления малых количеств ЭТ . К тому же невозможно проверить и отрицательные результаты , и , следовательно , обнаружить среди них ложноотрицательные , что приводит к снижен ию чувствительности. Иммуноморфологические методы Эти методы основаны на обнаружении а нтиг енных субстанций хламидий в эпителии и др угих тканях путем обработки препаратов специф ическими антителами . Антитела диагностической ант ихламидийной сыворотки соединены с какой-либо меткой - люминесцирующей (ФИТЦ-антитела ) или фермент ной (энзим-меченые антитела ). Непрямой метод иммунофлюресценциии Непря мой метод иммунофлюресценции применяют в тех случаях , когда нет в наличии ФИТЦ-конъюга та антихламидийных антител . В этих случаях приготовленный тем же методом , что и дл я ПИФ препарат из клинических пр об обрабатывают вначале антихламидийными антителами , полученными путем иммунизации хламидиями ов ец , кроликов , мышей или других животных , а затем второй сывороткой , специфичной для вида животного , которое было иммунизировано х ламидиями . Антитела второй сыв о ротки конъюгированы с ФИТЦ . Показания к примене нию и специфичность данного метода совпадают с ПИФ. Методы иммуноферм ентного анализа Эти мето ды основаны на обнаружении растворимого антиг ена хламидий в исследуемых пробах . Чаще ис пользуются наборы реактив ов Imx Select Хламидия (Abbott Laboratories) и Chlamydia-antigen Elisa (Medac Diagnostica). Тест Imx Select Хламидия основан на технологии ИФА-анализа на микрочастицах (МИФА ) и предна значен для качественного определения липолисахар идного антигена С . tracho matis в эндоцервикальных и уретральных мазках на анализаторе Imx. Дан ный набор содержит компоненты , полученные из человеческого материала , что обуславливает с облюдение при работе правил биологической без опасности. Узел пробоотборник /электрод добавляет мик р очастицы в лунку , содержащую образец . Предварительно экстрагированный липолисахаридный ант иген (ЛПС ) образца связывается с микрочастицам и . Аликвота реакционной смеси , содержащей комп лексы микрочастиц с ЛПС-антигеном , переносится на стекловолокнистый матри к с реакц ионной ячейки . Микрочастицы необратимо связываютс я с матриксом . К матриксу добавляются крол ичьи антитела против хламидий . Они связываютс я с ЛПС антигеном . Биотинилированные козьи анти-кроличьи антитела добавляются к матриксу и связываются с комплек с ом а нти-хламидия /ЛПС антиген . К матриксу добавляет ся конъюгат щелочной фосфатазы и антител против биотина . Происходит связывание конъюгата с комплексом антиген /антитело . После удален ия не связавшегося материала промыванием к матриксу добавляется субстрат 4 -метилу мбеллиферилфосфат . Образование флуоресцирующего проду кта измеряется в оптическом узле МИФА. Тест-система Chlamydia-Antigen-ELISA medac (регистрационное удостоверени е Минздрава РФ 97/128 от 07.02.97 г .) является экономн ым и в то же время достаточно с пецифичным и чувствительным методом в рутинной диагностике хламидийной инфекции . Этот тест представляет собой метод твердофазного ИФА-анализа для определения антигенов хламид ий . Твердая фаза покрыта хламидийными монокло нальными антителами установленной сп е цифичности . Амплификация достигается с использова нием технологии полимерной конъюгации , в резу льтате чего происходит фиксация , при которой на каждый связанный участок антигена при ходится полимерный комплекс с высокомолекулярным фрагментом . Кроме того , амп л ифика ция выполняется на стадии обозначенного воспр оизведения с использованием запатентованной техн ологии фермент-амплификации . Визуально положительные пробы окрашиваются в желто-оранжевый цвет . Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена хла м идий . Точный результ ат исследования определяют с помощью микроЭВМ , спектрофотометра “Мультискан” или другого а ппарата для ИФА при длине волны 492 нм . О бразцы дающие значения поглощения выше или равные значению отсекающего поглощения (cut-off), счит аются п о ложительными для хламидий . Чувствительность и специфичность ИФ методов соответственно составляет 65-70% и 90-100% . Показания к применению такие же , как и для метода прямой иммунофлюресценции . Выявление в сыворотк е крови антител к липополисахаридному анти г ену хламидий классов Ig G, Ig A, Ig M с опред елением их титра позволяет определить стадию заболевания , обосновать необходимость антибактер иального лечения и оценить его эффективность. Показания к выявлению антихламидийных антител классов Ig G, Ig А , Ig M в сыворотке крови методом ИФА 1. Определен ие стадии заболевания ; -острая , первичная ; -хроническая ; -реактивация или реинфекция ; -состояние после реконвалесценции (остаточная серология ). 2.Оценка эффективности проводимого лечения (наряду с исследованием мето дами ПЦР , культурального посева ). 3.Установление хламидийной этиологии экстраг енитальных поражений (артриты , пневмонии , заболеван ия глаз ). Сравнивая различные диагностические наборы , мы рекомендуем использовать тест-систему r-Elisa фир мы MEDAC DIAGNOSTICA (Германия ). Регистрационное удостоверен ие Минздрава РФ 97 от 7.02.97 г . Это иммунофермент ные наборы для выявления антихламидийных анти тел классов Ig G, Ig A, Ig M с определением их количестве нного титра в сыворотке крови по одной точке . Антиген получен ме т одами генной инженерии . В качестве антигена тверд ой фазы используется специфические рекомбинантны е липополисахаридные фрагменты хламидий , отсутств ующие в липополисахаридах других бактерий . Вы бирая тест-систему , где в качестве антигена используются липопол и сахаридные фракци и , мы исходили из предположения , что обсле дуемое лицо может в течении жизни подверг аться инфицированию не только C.trachomatis, но и С .pneumonia , и C.psitacci с выработкой к ним соответствующих антител . Выявление их количе ственного титра и его динамики является важнейшим показателем эффективности проводимого лечения. В промежутке между пятым и двадцатым днями после появления клинических симптомов заболевания последовательно возникают антитела этих трех классов к специфическому хлами дийному липополисахариду . Ig M является маркером острой стадии , он определяется уже через пять дней после начала заболевания . Изменен ия продуцирования Ig M на определяемое продуцировани е Ig А может происходить в течение 10 дней после появления симптомов заболева н ия . В течение короткого периода могут одновременно присутствовать Ig M и Ig А . В это же время или с небольшой задержкой - 2-3 недели могут быть определены Ig G. Прогрессирование заболевания , переход в хроническую стадию х арактеризуется появлением Ig A. Ig G- антител (смотри таблицу 3). Таблица 3. Определение стадии заболевания на основании выявления антител классов Ig G, Ig A, Ig M Стадия заболевания Классы антител Острая Ig G, Ig А , Ig M Хроническая Ig A*, Ig G Реактивация или реинфекция Ig A *, Ig M Со стояние после реконвалесценции Ig G *-при недостове рном определении титра Ig А подтверждение осуще ствляется при помощи определения Ig M. Для адек ватной интерпретации результатов серодиагностики хламидиоза следует определять такое понятие как 'пограничные титры Это наименьшие во зможные разведения в которых тест-системы опр еделяют антитела против хламидий . “Пограничные титры” для Ig M - 1:50, Ig А -1:50, Ig G-1:100. Так называемые “диагн остические титры” могут подтверждать клинический диагноз , стадию процесс а необходимо сть назначения антибактериального лечения (смотри таблицу 4). При реинфекции и реактивации пр оисходит скачкообразный подъем титров Ig G изменения титра Ig А идут параллельно с титром Ig M однако на более низком уровне . У лиц , н е получающих в пе р иод реинфекции лечения , титр Ig G сохраняется на неизменном уровне . Выявление на протяжении длительного п ериода титра только Ig G указывает на состояние реконвалесценции после перенесенной хламидийной инфекции (“серологические шрамы” ). Исследуя ти тры анти т ел Ig G, Ig A, Ig M можно оценивать э ффективность проведенного лечения в отдаленном периоде (через 1-1,5 месяца ). В табл . 5-17 показана возможность определения стадии инфекционного процесса , показаний к антибактериальному лечению и вынесения заключе ния о н аличии хламидииной инфекции на основании однократного или динамического опр еделения титров антител IgG, IgA, IgM. Таблица 4. Диагностический диапазон титров антител Ig G, Ig А , IgM. Выявление на основе его оценки стадии заболевания , обоснованности назначен ия анти бактериального лечения. Стадия заболевания Дипазон титров IgG Диапазон титров IgA Диапазон титров Ig M Первичная /острая . Определяются Ig M >100-6400 > 50-1600 > 50-3200 Хроническая . Опр еделяются Ig A > 100-1600 <50 >50-200 Реактивация / Реи нфекц ия . Определяются Ig G, Ig A >100-51200 >50-400 <50 Состояние после реконвалесценции . Определяется Ig G > 100-400 <50 <50 Рассмотрим возмо жность определения стадии инфекционного процесса , показаний к антибактериальному лечению и вынесения заключения о нал ичии хламиди йной инфекции на основании однократного или динамического определения титров антител Ig G, IgA, Ig M. Используя данные однократного исследования затруднительно вынести клиническое заключение (табл . 5), при и сследовании сыворотки через 10-14 дне й уже можно судить о наличии хламидийной инфекци и и показании к назначению антибактериального лечения (табл . 6) или об их отсутствии (т абл . 7) Таблица 5. Очень ранняя стадия инфекции (сомнительно ). “Пограничные титры” в первой сыворотке Титр Ig G Титр Ig А Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение <100 |<50 |<50 сомнительно не показано Таблица 6. Острая первичная инфекция . “Диагн остические титры” во второй сыворотке через 10-14 дней Титр Ig G Титр Ig А Титр Ig M Заклю чение о наличии хламидииной инфекции Антибактериальное лечение >200 >=100 =<50 имеется Показано Таблица 7. Отсутствие хламидийной инфекции . “Диагностические титры” во второй сыворотке ч ерез 10-14 дней Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной ин фекции Антибактериальное лечение <100 <50 <50 отсутствует не показано При однократном определении титров антите л (табл . 8) так же , как и в предыдущем наблюдении трудно однозначно вынести клиническ ое заключение Повторное обследование больн ого через две недели (табл . 9) позволяет судить о прогрессировании первичной инфекции либо реактивации и реинфекции . В другом случае (табл . 10) исследование сыворотки в д инамике через две недели позволяет вынести заключение о персистенции антител и непока з анности антибактериального лечения Таблиц а 8. Ранняя стадия инфекции (сомнительно ). Хронич еское течение (сомнительно ). “Пограничные титры в первой сыворотке” Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение 100 50 <50 Сомнительно (требуется подтверждение ПЦР и культуральным посевом ) не обязательно Таблица 9. Прогрессирующая первичная инфекция . Реинфекция . Реактивация . Диагностические титры во второй сыворотке через 10-14 дней Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение >=400* >=200* <=50 Имеется показано *- 4-х кратное повышение значимо только для Ig G и Ig А. Таблица 10. Хроническая персистенция антител без клинич еских проявлений . Диагностически е титры в о второй сыворотке через 10-14 дней. Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение 100 50 < =50 Персистенция антител не показано В следующем наблюдении (табл .11) можно сразу вынести заключе ние о первичной инфекции или о ее прогрессировании либо реактивации , реинфекции ( табл .12) и , соответственно , показанности антибактериа льного лечения. Таблица 11. Первичная стадия . Диагностические титры в первой сыворотке Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключе ние о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение <100 <50 >=50 Имеется Показано >=100 >=50 >=50 Имеется Показано <100 >=50 >=50 Имеется Показано Таблица 12. Прогрес сирующая первичная инфекция . Реинфекция . Реактивац ия . Диагностические титры первой сыворотки Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение >=400 >=200 <50 имеется показано В следующем наблюдении первичное исследование не дает осн ований для выводов (табл .13), и только повтор ени е его через две недели позволяет вынести заключение . Отсутствие изменения титра антител (табл .15) за указанный период времен и свидетельствует о персистенции хламидий , вы зывающих образование Ig А-антител и об отсутстви и показаний к назначению антибактериал ь ного лечения . В другом случае (табл .14) увеличение в 2 раза титров Ig G и Ig A позволяет сделать вывод о присутствии хламидийной ин фекции и наличии показаний к назначению а нтбактериального лечения. Таблица 13. Первичная инфекция (сомнительно ). Реинфекция ( сомнительно ) . Реактивация (сомнительно ) . “Погран ичные титры” в первой сыворотке Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение <100 50-100 <50 Возможна Сомнительно . Не обязательно Таблица 14. Первичн ая инфекция . Реинфекция . Реактивация . “Диагно стические титры” во второй сыворотке через 10-14 дней Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение >=200 >=200 <50 Имеется Показано Таблица 15. Хрониче ская пе рсистенция антител без клинических проявлений . Диагностические титры во второй сыворотке через 10-14 дней. Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение <100 50-100 <50 Присутствует персистирующие хлами д ии , вызывающие образование IgA-антител . Клин иническое значение неизвестно. Не показано В случае обс ледования реконвалесцентов или при выявлении повышенных титров IgG, расценивающихся как “серологи ческая находка” (табл . 16), динамическое наблюдение через д ве недели в случае отсутств ия 4-х кратного повышения титра Ig G позволяет вынести заключение о неинфицированности и непоказанности антибактериального лечения (табл . 17) Таблица 16. Состояние после реконвалесценции - “остаточная серология” (сомнительно ). По граничные титры в первой сыворотке. Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение >=10 <50 <50 Сомнительно необходимы проведение ПЦР , ку льт . посева Сомнительно Таблица 17. Состоян ие после реконвалесценц ии - “остаточная се рология” . Диагностические титры во второй сыв оротке через 10-14 дней. Тит р Ig G Титр Ig A Титр Ig M Заключение о наличии хламидийной инфекции Антибактериальное лечение >=100* <50 <50 Отсутствует Не показано * - в случае отсутствия 4-х кратного повышения титра м ежду первой и второй сыворотками . Если это повышение имеется , то отмечается текущая инфекция. С января 1999 г . на российском рынке п оявились тест-наборы С . trachomatis Ig G и Ig A pELISA medac. Они использ уют синтетический пепти д из иммунодоминан тной области МОМР . С помощью этого высокос пецифичного антигена возможно выделение С . trachomatis - специфических антител с высокой чувствительн остью среди общих антихламидийных антител с высокой степенью чувствительности. Преимущества тес та : -отсутствие ложноположительных результатов , об условленных межвидовой перекрестной реакцией хла мидий ; -отсутствие инфицированного антигенного матер иала ; -химически точная структура антигена ; -наличие стрипов позволяет экономично исп ользовать тесты ; -при годен для использования на авт оматических открытых системах для ИФА. ЗАО "Вектор-Бест " (Новосибирск ) производит с ледующие тест-системы для диагностики хламидиоза методом ИФА : - ХламиБест -Ig G-стрип для выявления иммуног лобулинов классов G к С . trachomati s и С . psittacci в сыворотке крови ; - ХламиБест -Trachomatis Ig G- стрип . Тест-систем а иммуноферментная для выявления иммуноглобулино в класса G к Chlamydia trachomatis в сыворотке (плазме )крови ; -ХламиБест -Ig M - стрип . Тест-система иммуноферментн ая для выя вления иммуноглобулинов класса М к Chlamydia trachomatis и Chlamydia psrttaci; - ВектоХлами-антиген-стрип . Тест-система для вы явления антигена Chlamydia trachomatis. Хромоген-ОФД. -ВектоХлами-антиген-стрип . Тест-система для выяв ления антигена Chlamydia trachomatis. Имеются реактивы различных фирм для э кспресс-диагностики хламидийной инфекции , учет реа кции через 10-15 минут визуальный . Однако чувствит ельность этих методов невысока - 50-60%, они могут быть использованы только для скриннинговых исследований. Диагностика хлами дий на культуре клеток МсСоу Одним из лучших , но в то же время наиболее трудоемким является метод диагностики хламидий путем изоляции возбудителя на культуре к леток , обработанных различными антиметаболитами (“ золотой ст андарт” ) Для этой цели обычн о используют чувствительную культуру клеток , обработанную циклогексимидом . Чувствительность культу рального метода по сравнению с ПЦР состав ляет 70-80%, но в то же время он превосходи т молекулярно-биологические методы диагностик и по специфичности . В литературе описаны случаи выявления хламидий трахоматис методом ПЦР при отрицательных результатах культураль ного теста и наоборот. Показаниям и для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются : 1 Беременно сть с отягощенным аку шерским анамнезом. 2. Оценка эффективности проведенного антибак териального лечения. 3. Выявление чувствительности и резистентнос ти к антибактериальным препаратам. 4. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со вторичными иммунодефицитными со стояниям и (онкологические больные после п роведенных курсов лучевой и химиотерапии , тра нсплантации костного мозга ; лица , получающие и ммунодепрессанты ; больные вирусным гепатитом и туберкулезом ). 5. Бесплодие неясного генеза. 6. Установ ление этиологии хронического и нфекционного процесса урогенитального тракта. Культуральны й посев является референс-методом при оценке эффективности антибактериального лечения . При исследовании биопроб методом ПЦР после кур са химиотерапии в некоторых случаях можно получить “ложноположите льные с клинической точки зрения” результаты . Это связано с тем , что невозможно однозначно оценить жи знеспособность и патогенность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома , используя только данные молекулярно-биологически х методов . В эт о м случае при исследовании клинического материала с помощью культурального посева микробные клетки , поте рявшие эти важные с клинической точки зре ния свойства , не дадут роста в клеточной культуре. Для транспортировки и хранения клиническо го материала использ уют специальную питат ельную среду (транспортная среда ). Она разливае тся в пенициллиновые флаконы по 1 мл и хранится при температуре + 4 ° С (в общей камере бытового холодильника ) в течение 2-х месяцев . Состав транспортной среды : среда MEM с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота и антибиотика гентамицина к онцентрации 50 мкг /мл . Клинический материал после перенесения в транспортную среду хранится в общей каме ре холодильника при температуре + 4 ° С и , в течение двух суток должен быть доста влен в л абораторию. Про цедура посева 1. Обработка однодневной клеточной культуры МсСоу 1% раство ром ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут. 2. Заражение обработанных клеток материалом , полученным от больных. 3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течени е 45 минут. 4. Отмывка клеток питательной средой. 5. Добавление к клеткам ростовой среды , содержащей циклогексимид. 6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 ° С. 7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или ПЦР. Реал ьный срок получения результатов этим методом - семь дней. В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к антибактериальным препаратам (эритро мицину , тетрациклину , доксициклину , фторхинолонам ). Ценность культурал ьного метода состоит в том , что он является пока единственным методом , позволяющим выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии. Схе ма метода выявления устойчивости хламидий тра хома тис к антибактериальным препаратам -Хламидийным изолятом , выделенным от больного при посе ве , заражают чувствительные клетки. -К зараженным клеткам добавляют ростовую среду , содержащую антибиотик. -Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 ° С. -Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции в заражен ных клетках . Процедура длительная , занимает по времени две недели . Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции Дороговизна , длительность и трудоемкость микробиологиче ского выделения хламидий в культуре существен но затрудняет использование этой процедуры в рутинной лабораторной диагностике . В литерат уре накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР для выявления х л амидий трахоматис . Особое внима ние при его использовании следует уделять , без сомнения , вопросам правильной интерпретаци и получаемых результатов . Экстремально высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦ Р делают эту методику во многом революцио н н ой в лабораторной диагностике . О сновными мишенями при выявлении хламидий трах оматис являются нуклеотидная последовательность видоспецифической криптической плазмиды , последовател ьность главного белка внутренней мембраны , ри босомальные гены. Данная реакция представляет собой м ногократно повторяющиеся циклы синтеза (амплифика цию ) специфической области ДНК-мишени в присут ствии термостабильной ДНК-полимеразы , дезоксинуклеотид трифосфатов , соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров , о пре деляющих границы амплифицируемого участка . Каждый цикл состоит из трех стадий с различ ными температурными режимами . На первой стади и при 94 ° С происходит разделение цепей ДНК , затем при 56-58 ° С - присоединение (отжи г ) праймеров к комплементарным пос л едовательностям на ДНК-мишени , и при т емпературе 72 ° С протекает синтез новых це пей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5 ’ – 3 ’ . В каждом ци кле происходит удвоение числа копий амплифици руемого участка , что позволяет за 25-40 циклов нараб о тать фрагмент ДНК , ограниченн ый парой выбранных праймеров , в количестве , достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технология ми По сра внению с широко применяющимися иммунологическими тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ : -высокой и регулируемой специфичностью , обусловленной лишь нуклеотидной последовательностью , применяемой в данной диагностической системе ; -высокой чувствительностью , позволяющей диагно сцировать не только острые , но и латентные инфекции (возмо жно выявление даже еди ничных бактерий или вирусов ); -химическое сходство всех нуклеиновых кис лот позволяет разрабатывать универсальные процед уры для выявления различных инфекционных аген тов, -возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 часов. Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию п роизводится в холодовом термоконтейнере или т ермосе со льдом . Важной отличительной особенн остью ПЦР-диагностики является относительно низка я стоимость оборудования для проведения анали за , сочетающаяся с универсальн о стью метода , что позволяет выявлять весь спектр клинически актуальных инфекционных агентов. ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты ). Следует иметь не менее двух комнат -пре-ПЦР-помещение , где проводится обработка клинических образцов , выд еление ДНК , при готовление реакционной смеси для ПЦР и по становка ПЦР (при наличии условий два посл едних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении ), в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционным и агента ми (микробиологический анализ , ИФА , другие диаг ностические тесты ), ПЦР-диагностика которых проводи тся в данной лаборатории. -пост-ПЦР-по мещение , где проводится детекция продуктов ам плификации , в ПЦР-помещении допускается использова ть другие методы д етекции инфекций , ди агностика которых проводится в данной лаборат ории . Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение ) следует располагать как можно дальше от пре-ПЦР-помещений . Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помеще н и я в пре-ПЦР-помещение. В комнат е приготовления реакционной смеси и в ком нате обработки клинических образцов должны бы ть установлены ультрафиолетовые лампы , рабочие поверхности в лаборатории должны обрабатыватьс я дезинфицирующими растворами . Показания для диагностики С . trachomatis методом ПЦР 1. Острая фаза заболевания 2. Хроническая фаза заболевания 3. Установление этиологии хронического инфек ционного процесса урогенитального тракта. 4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом . 5 Бесплодие неясного генеза. 6. Контроль эффективности проведенного антиб актериального лечения. В случае выявления фрагмента ДНК хлам идии трахоматис после курса химиотерапии след ует провести культуральную диагностику для ис ключения “ложноположительного с клинической точк и зре ния результата” . Если проведение культуральной диагностики невозможно , то необходи мо через 5-6 недель (полное обновление эпителиал ьного покрова мочеполовых путей ) провести пов торное исследование методом ПЦР. 7. Выявлен ие хламидии у ВИЧ-инфицированных лиц , бол ьных туберкулезом , вирусным гепатитом и со вторичными иммунодефицитными состояними (онкологич еские больные после курсов химио - и лучево й терапии , трансплантации костного мозга , полу чающие иммуносупрессивную терапию ). В 1991 году компания Хоффман-ла Рош ЛТД получила от компании Cetus права и патенты на исполь зование ПЦР . В этом же году была созда н Roche Molecular Systems, занимающийся исключительно вопросами раз вития и совершенствования ПЦР . В 1992 году бы ли внедрены первые стандартизованные тест-системы для клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis, а в 1993 году начато производство этих тест систем . Многочисленные проведенные исследо вания показали высокую чувствительность и спе цифичность данного набора . Это позволило полу чить данной тес т -системе сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году . В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одновременной их детекции в од ной пробирке . В тесте использованы биотинилир ованные праймеры (СР 24/ СР 27) из криптической плазмиды С . trachomatis. Чувствительность теста состав ляет 10 копий /мл , специфичность 99,6%. Тест-система вк лючает : набор для сбора и транспортировки образцов , набор для выделения ДНК из церви кальных , уретральных образцов и мочи , наб о р для амплификации и детекции . Все наборы стандартизованы , полностью готовы к использованию , имеют внутренний контроль , систему защиты от контаминации. Научно-производственной фирмой "Литех " при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускае тся набор реаген тов "Полимик " в виде трех отдельных наборов для определения соо тветственно Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Каждый набор “Полимик” комплектуется отдельным набором для выделения ДНК из биопроб . Инструкция по применению набо р а реагентов рекомендована к утверждению экспе ртной комиссией Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от 18.03.96 г .) и утверждена Министерством здравоохранения РФ 17.05.96 г . (ТУ 9398-405-17253567-96). В состав реакционной смеси набора “Полимик” входит внутренний контроль (рек омбинантная плазмида , содержащая фрагмент-вставку размером 308 н.п .). Этот компонент позволяет контро лировать процесс прохождения реакции амплификаци и , а также тестировать наличие в пробах веществ , ингибирующих ПЦР. Полоса , соответс твующая внутреннему контролю , должна проявляться как в положительном и в отрицательном контролях , так и во всех тестируемых пр обах. При выделении ДНК из биопробы (“Набор для выделения ДНК” ) используется метод эк стракции ДНК из клеток хлами дий с помощью гуанидина тиоцианата и связывания высвобождающихся нуклеиновых кислот с частицами крупнопористого стекла . Это позволяет оптими зировать условия выделения и подготовки проб для амплификации , а также уменьшить колич ество манипуляций с образцом. При этом все манипуляции проводятся в одной п робирке . Выход хромосомной ДНК составляет 70-80% по результатам определения числа колониеобразующих единиц клеток Acholeplasma laidlawii (штамм микоплазм , взятый в качеств е стандарта ) как в случае чистой культур ы , так и при добавлении этих клето к к клиническому материалу , не содержащему определяемых инфекционных агентов. После завершения ПЦР продукты амплификаци и фракционируют методом электрофореза в 1,5% ага розном геле. Анализ результатов диагностики 1. В пол ожи тельном контрольном образце для хламид ий выявляется полоса размером 501 н.п. 2. В отрицательном контрольном образце по лоса , соответствующая фрагментам генома хламидий , должна отсутствовать . Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контам инации компонентов набора. 3. В анализируемой пробе отсутствие полос ы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии возбудителя в пробе , наличие полосы , соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контр олю , свидетельствует о наличии хламидий в клинической пробе. 4. Во всех образцах выявляется полоса оранжево-красного цвета , соответствующая внутреннем у контролю размером 308 н.п . Полученные результат ы можно документировать фотографированием гелей с использовани ем оранжевого или инте рференционного (594 нм ) светофильтра . При использовани и видеосистемы "Gel-doc" возможно документирование резул ьтатов электрофореза в виде компьютерного фай ла , доступного любым приложениям “ Windows”. Набор “Полимик” следует хранить при температуре - 18-20 ° С в течение всего срока годности (6 месяцев ). Допускается , хранени е и транспортировка набора при температуре не выше 0 ° градусов не более одних суток. По состоянию на третий квартал 1999 г . Минздравом России помимо набора “Полимик” разрешены следующие диагностические наборы для обнаружения хламидий трахоматис методом ПЦР в качестве изделий медицинского назнач ения : набор реагентов амплификационный для опре деления ДНК хламидий (Хламидия-Ампли-тест ) ТУ 9398-402-18137053-96 производства АО “ВНЦМДЛ” , Москва ; набор реактивов для выявления нуклеотидны х последовательностей хламидия трахоматис методо м ПЦР (Хлам Ам ) ТУ “ 9398-403-29032954-96 производства ЗАО “Внедрение систем в медицину” . Москва, набор реагентов для выявления ДНК хла мидий трахом атис методом ПЦР (Хлам-Ген ) ТУ 9398-412-46482062-97 производства НПФ “ДНК-технология” , Москва. Достоинства и недостатки различн ых методов обнаружения Chlamydia trachomatis (Taylor-Robinson О ., Thomas B.J ,1991, с дополнениями Говорун В.М , Бочкарев Е.Г. , Парфенова Т.М ., 1999) Хар актеристика / Метод ПИФ Культуральный посев ИФА-методы ПЦР Исследуемый мате риал Любой Большинство Ограничения из-за неспецифичности реакций Любой Значение правиль но взятых проб Решающее Решающее Решающее Решающее Условия тран спортировки проб Если препарат фиксирован -условия не в ажны Быстрая доставка или хранение при низ кой температуре Не имеет значения , если проба взята в буфер Быстрая доставка или хранение при низ кой t o менее важно , чем для культуры клеток Условия хранения На короткое время при +4°С длительно при -20 °С +4°С - сутки-двое . Длит хранение в жидк ом азоте 3 -5 дней при +4°С Замораживание снижает чувствительность На короткое время + 4°С , две недели - 20°С Длительное время - в жидком азоте Проверка адекват ности вз ятия материала Мазки оценивают во время тестирования Не практикуется Не практикуется Определяется , присутствует ли ДНК. Потребность в специальном оборудовании Люминесцентный микроскоп Центрифуга Комплект для ИФА Амплификатор и оборудование для электрофо ре за Обработка проб Простая Трудоемкая Становится проще для новых тестов Требует строгой предосторожности , чтобы н е контаминировать ДНК Чтение результат ов Субъективное и утомительное Субъективное умеренно утомительное Объективное , Простое Объективное , прос тое Время выполнения 30 минут 12-72 часа 3 часа 4,5-5 часов Способы проверки результатов Повторный просмотр Повторный просмотр Повторение теста Повторная проба или переваривание эндоукл еазой Результат зависи т от следующих причин : Опыта микроскописта Чув ствительности клеточной культуры Присущей мощности теста Требует хорошего контроля и отсуствия контаминации Способность к поддержанию штамма Нет Да Нет Нет Использование ка к контроля эффективности лечения Ограничено Рекомендуется Ограничено Рекомендуется с ограничениями
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Рабинович звонит племяннику-адвокату:
- Фима, приходи сегодня вечером к нам в гости! Мы с тётей Сарой очень по тебе соскучились!
- Яков Моисеевич, а какой кодекс взять с собой: гражданский или уголовный?
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, реферат по медицине и здоровью "Хламидиоз. Методы определения, диагностики", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru