Реферат: Критерии оценки методов иммунодиагностики - текст реферата. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Реферат

Критерии оценки методов иммунодиагностики

Банк рефератов / Медицина и здоровье

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Реферат
Язык реферата: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Архив Zip, 42 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникального реферата

Узнайте стоимость написания уникальной работы

Критерии оценки методов иммунодиагностик и Содержание Введение 1. Иммуноферментный анализ 2. Иммуносенсоры 3. Генное зондирование 4. Иммуноэлектрофорез 5. Иммуноблоттинг 6. Критерии положительных и отрицательных реакций Список используемой литературы Введение Любой лабораторный анализ в медицине основан на понимании любого забол евания как реакции целого организма. Патологическое изменение функции какого-либо органа, ткани, группы клеток вызывает отклонение от нормальн ых показателей в работе других органов, тканей, систем. Наряду с неспециф ическим, т. е. свойственным для многих видов патологии проявлением таких сдвигов, в большинстве случаев наблюдаются особые, характерные лишь для данного заболевания изменения внутренней среды организма. При инфекц ионных заболеваниях - это, прежде всего, появление во внутренней среде ор ганизма возбудителя или его продуктов (токсины, антигены и т.д.) и иммунный ответ на возбудитель. Иммунодиагностику инфекционных заболеваний разделяют на две ча сти: 1) определение изменения функциональной активности различных компонен тов иммунной системы, характерных для здорового организма: изменение к оличества лимфоцитов различных популяций, их соотношения, активности к леток системы мононуклеарных фагоцитов, концентрации иммуноглобулино в и т.п. 2) специфическое распознавание маркеров возбудителя и реагирующих с ни м комплементарных структур (прежде всего антител) на основе их взаимодей ствия с микробными антигенами. Специфическое распознавание в более широком смысле возможно не т олько с помощью антител, но также и других комплементарных структур, реа гирующих с микробными продуктами - различными рецепторами клеточной по верхности, лектинами, участками молекул нуклеиновых кислот и т. п. В той ил и иной мере эти подходы нашли технологическое осуществление в различны х методах. Однако лишь методы анализа на основе реакции с участками нукл еиновых кислот нашли достаточно широкое применение в клинической прак тике (генное зондирование) и будут описаны более подробно. Оценка состоя ния иммунной системы при инфекционном процессе может включать в себя сл едующие методы: определение количества и соотношений Т- и В-клеток, субпо пуляций лимфоцитов в периферической крови, активности лимфоцитов в реа кции бласттрансформации, определение активности макрофагального звен а (хемотаксис, подвижность, фагоцитоз), определение концентрации иммуног лобулинов М, G , А и Е, соотношения концентраций изотипов IgG , определение кон центрации лимфокинов, монокинов, интерферонов, состояния местного имму нитета (лизоцим, секреторный Ig А) и общих неспецифических гуморальных фак торов (система, комплемента, пропердин, трансферрин, церулоплазмин), конц ентрации тимических гормонов и др.Находят применение и методы комплекс ной оценки реактогенности иммунной системы по, так называемым, реакциям немедленного типа и реакции гиперчувствительности замедленного типа ( кожные пробы при бактериальных инфекциях и микозах, туберкулиновая про ба). Весьма перепективна оценка субпопуляционного состава лимфоцитов п о специфическим поверхностным маркерам, особенно при использовании им мунофлуоресцентных методов автоматической сортировки клеток. Все пере численные выше методы позволяют оценить динамику изменений состояний иммунной системы при инфекционном процессе, а при провокационных теста х - выявить специфическую реактивность иммунного ответа. Применение так ого рода диагностических процедур демонстрирует индивидуальную реакц ию иммунной системы пациента на течение инфекционного процесса, позвол яет оценить эффективность применяемых методов лечения и прогнозироват ь исход заболевания. Однако лишь в некоторых случаях эти методы позволяю т определить вид инфекционного агента. Изменение соотношения популяци й и субпопуляций лимфоцитов происходит при различных видах инфекционн ых заболеваний, особенно при хроническом течении инфекции. Так же часто изменяется концентрация неспецифических гуморальных компонентов имм унной системы. Известно, что при некоторых паразитарных заболеваниях ре зко повышен уровень Ig Е в крови. При острых воспалительных процессах, вызы ваемых бактериями, растет концентрация С-реактивного белка в крови, тогд а как при сходных клинических формах вирусной инфекции такие изменения не наблюдаются. Провокационные методы могут выявить сенсибилизацию к какому-либо инфекционному агенту, однако это может быть результатом изм енения общей реактивности организма. Иммунодефицитное состояние, выз ванное инфекцией, т.е. синдром вторичного иммунодефицита, является широ ко распространенным явлением. С другой стороны, при инфекции, вызываемой ретровирусами ВИЧ-1, ВИЧ-2, Н TLV -1, НТ LV -2 наблюдаются самые разнообразные стру ктурные изменения иммунной системы, сопровождающиеся множественными а ссоциированными инфекционными заболеваниями протозойной, бактериаль ной и вирусной природы. Наиболее значимыми для специфической диагностики инфекционного проце сса стали методы иммунохимического анализа ( immunoassay ) для определения антиге нов и антител. Условно методы иммунохимического анализа можно разделить на четыре бо льшие группы. К первой группе относятся прямые (непосредственные) методы определения реакции антиген-антитело. Образующийся при этом комплекс антиген-антит ело идентифицируется визуально, либо с помощью простых оптических устр ойств. К таким методам относятся преципитация в растворе (в том числе - реа кции турбодиметрии и нефелометрии), в геле, на полимерной пленке, агглютинация бактериальных клеток, простейших, прямая реакция агглюти нации эритроцитов антителами, вирусами. Ко второй группе относятся реакции пассивной агглютинации, т.е. агглютин ации частиц, с поверхностью которых связаны антигены или антитела. Такие препараты и получили название диагностикум. К этим методам относятся ре акции пассивной гемагглютинации (РНГА) и непрямой геммагглютинации (РНГ А), латексагглютинации, коагглютинации, агглютинации частиц бентонита, ж елатиновых капсул, частиц сефарозы и др. К третьей группе относятся индикаторные методы, основанные на использо вании различного рода меток для выявления реакции антиген-антитело. Наи более распространены иммуноферментный, иммунофлюоресцентный, радиоим мунологический анализ. В четвертую группу можно выделить одно из, бурно развивающихся направле ний лабораторного анализа - иммуносенсоры. Все перечисленные методы применяются не только при диагностике инфекц ионных и неинфекционных заболеваний человека, но и в ветеринарии, растен иеводстве, для контроля загрязнения окружающей среды и т. п. 1. Иммуноферментный анализ Основной отличительной чертой иммуноферментного анализа (ИФА) являетс я то, что в качестве индикаторной молекулы, которая позволяет следить за иммунным комплексом, используется молекула фермента. В связи с тем, что ф ермент обладает уникальным свойством модифицировать не одну, как в обыч ных химических реакциях, а большое число молекул субстрата, т. е. обладает своего рода усиливающим свойством, чувствительность иммуноферментных методик может быть очень высока. В некоторых случаях, как показывают мно гочисленные сравнительные исследования, она выше чувствительности имм унофлуоресцентных и радиоиммунологических методов. История создания иммуноферментных методик начинается с момента, когда биохимики начали ковалентно иммобилизовывать («пришивать») молекулы ф ерментов к молекулам белков и, в частности, к молекулам иммуноглобулинов . Однако потребовалось пять лет для создания методики иммуноферментно го анализа именно в том виде, в каком мы используем его в настоящее время. Принципы этого метода следующие: - комплекс антиген - антитело можно выявить, если ввести в состав одного из участников иммунной реакции (ковалентно «пришить») одну или несколько м олекул фермента. Причем эта процедура на промежуточных (в процессе «приш ивки») и финальной стадии (конъюгат антигена или антитела с ферментом) не должна изменять иммунные (свойства фермент-меченного участника иммунн ой реакции; удобно выявлять иммунный комплекс, используя способность фермента рас щеплять субстрат, который при ферментативной модификации изменяет сво й цвет. В этом случае для выявления комплекса антиген - антитело обычно ис пользуют спектрофотометрию; - иммунный комплекс можно выявлять с помощью иммуноферментного анализа, как в растворе, так и при адсорбции (или ковалентной иммобилизации) на тве рдом носителе. Различают два принципиально различных типа ИФА - гомоген ный и гетерогенный (твердофазный) иммуноферментный анализ. Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) - наиболее простой в методичес ком отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной ре акции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом, и за ход ом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя измене ние активности фермента. Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за сче т пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конфо рмационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед дру гими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь ан ализ с помощью ГИФА, занимает минуты, и даже доли минут). Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих в ремени этапов промывки. И, наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Одн ако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток - на его ос нове можно создавать диагностические тест-системы только для низкомол екулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с ан тигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, несмотря на кажу щуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на осно ве ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пепт идов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекуля рных белков. Гетерогенный (твердофазный) иммуноферментный анализ (ТФИФА или Е LIS А) в по следние годы особенно широко используется в биологии и медицине. Как и д ля других твердофазных методов анализа, характерной особенностью ТФИФ А является то, что в процессе проведения анализа один из участников реак ции антиген - антитело иммобилизуется на твердом носителе. Эту фиксацию антигена или антител можно осуществлять либо путем их ковалентной «при шивки» к полимерной или стеклянной матрице, либо путем их физической адс орбции на твердом носителе за счет достаточно прочных сил электростат ического и ван-дер-ваальсового взаимодействия. Идея иммобилизации имм унного комплекса важна для анализа многокомпонентных смесей макромоле кул, когда в системе должны оставаться только те компоненты смеси, котор ые обладают нужными иммунохимическими свойствами. Именно твердофазные методики позволяют избавиться от балластных, не вошедших в иммунный ком плекс антигенов простой промывкой. Необходимо отметить, что в своей физико-химической основе твердофазный ИФА очень сходен с твердофазным РИА. Отличие касается лишь индикаторных молекул - в ТФИФА это фермент, в твердофазном РИА это радиоактивные изото пы. Остальные же принципы анализа полностью совпадают - в обоих методах и спользуется твердая матрица, на которой адсорбируется иммунный компле кс, и идентичный способ удаления из системы не вошедших в комплекс компо нентов диагностикума. В настоящее время уже опубликованы обзоры, подробно анализирующие схем ы проведения диагностических исследований с использованием метода тве рдофазного ИФА. Для обнаружения в биологических и клинических образцах бактериальных и вирусных антигенов особенно часто применяется так называемый сэндви ч-метод или модифицированный сэндвич-метод. При использовании этих мето дик на твердую подложку (обычно полистирол) сорбируются последовательн о первичные антитела, выявляемый антиген и вторичные антитела. В случае двойного сэндвич-метода ферментная метка вводится в состав вторичных а нтител, в случае модифицированного двойного сэндвич-метода вторичные антитела (немеченые) «проявляются» антивидовыми меченными ферментом и ммуноглобулинами. Особая популярность последней разновидности ТФИФА о бъясняется тем, что для выполнения методики нет необходимости синтезир овать специфические для каждого конкретного антигена конъюгаты (мечен ные ферментом антитела). В последние годы были разработаны методики ТФИФА, использующие в качест ве «проявляющих» конъюгатов молекулярные комплексы ферментов с белком А золотистого стафилококка. Как известно, это белок взаимодействует с в ысокой константой связывания с тяжелой цепью ( F с-фрагментами) иммуногло булинов. Это позволяет построить диагностические системы, где - в качест ве «проявляющего» агента используются не антивидовые антитела, а белок А. В этом случае, однако, возникают некоторые трудности, связанные с несп ецифичностью белка А, который взаимодействует с F с-фрагментами любых ан тител. Если использовать обычную сэндвич-методику, заменив лишь антивид овой конъюгат на конъюгат на основе белка А, последний будет взаимодейс твовать не только со вторичными антителами, но и с первичными иммуноглоб улинами, давая положительную реакцию, даже если проба не содержит искомо го антигена. В этом случае имеется несколько вариантов решения проблемы . Во-первых, в качестве первичных антител в методике можно использовать и ммуноглобулины, с которыми белок А взаимодействует слабо (например, с мы шиными иммуноглобулинами). Во-вторых, возможна прямая адсорбция антиген а на полистирол, когда первичные антитела просто не используются. И, нако нец, в качестве первичных антител можно применять не полные молекулы имм уноглобулинов, а молекулы, лишенные F с-фрагментов, - так называемые Ра b 2 -фрагменты. В этом последнем случае дополнит ельным удобством методики будет являться то, что для конструирования д иагностической системы можно будет использовать не две сыворотки, полу ченные от разных животных, а одну. Именно в связи с этими обстоятельствам и в настоящее время разработано и разрабатывается большое число диагно стических методик, использующих конъюгаты на основе белка А. Построение диагностикумов для серодиагностики бактериальных и вирусн ых заболеваний, выявление и идентификация с их помощью антител в биолог ических и клинических образцах проводится аналогичным образом. Обычно приготовляется так называемый иммуносорбент - антиген, иммобилизованн ый на твердом носителе (либо за счет его прямой сорбции на твердую матриц у, либо за счет ковалентной «пришивки» к этой матрице, либо за счет иммуно сорбции на иммобилизованные первичные антитела). Затем исследуемая сы воротка, содержащая или не содержащая выявляемые антитела, контактируе т с иммуносорбентом. Степень адсорбции специфических к иммобилизованн ому антигену иммуноглобулинов обычно определяется с помощью антивидов ых конъюгатов. Использование антивидовых антител к различным классам и ммуноглобулинов позволяет выявить в исследуемом образце не только спе цифические к использованному антигену антитела, но и провести их изоти повой анализ. Конкретные методики диагностики и серодиагностики заболеваний бактер иальной и вирусной природы, использующие иммуноферментные подходы, отл ичаются многими параметрами, в частности, типом и формой адсорбента, на к отором иммобилизуется иммунный комплекс. В качестве твердофазного нос ителя может использоваться целый ряд полимеров: полиметилметакрилат, н ейлон, тефлон, полипропилен и др. Однако наиболее часто в качестве адсорб ента в настоящее время применяется полистирол и поливинилхлорид. Для уд обства проведения анализа эти адсорбенты производятся в виде многолун очных плашек, шариков или палочек. Использование плашек, изготовленных и з оптически прозрачного полистирола или поливинилхлорида, позволяет п роводить все операции ТФИФА, включая конечное фотометрирование хромоф орной субстратной смеси. Не менее существенным преимуществом полистир оловых плашек перед другими формами адсорбента является возможность а втоматизации практически всех операций анализа, включая трудоемкие эт апы промывки лунок и внесения в них однотипных реагентов. Следует отметить, что использование полистироловых плашек для целей ТФ ИФА имеет и некоторые недостатки - высокие требования к чистоте полимерн ого материала и точности изготовления плашек и нерентабельность их исп ользования для одиночных анализов. Большое внимание при постановке ТФИФА обычно уделяется правильному вы бору фермент-субстратной системы. В современных диагностических иммун оферментных тест-системах используется большое число разнообразных фе рментов и субстратов. Выбор той или иной фермент-субстратной пары для ис пользования в конкретной тест-системе на основе ТФИФА диктуется нескол ькими соображениями. Во-первых, обращается внимание на стабильность в пр оцессе анализа и хранения как крайне чувствительного к структурным вну тримолекулярным перестройкам конъюгата, так и во многих случаях светоч увствительного хромофорного или флуорохромного субстрата. Во-вторых, э то отсутствие используемого в диагностикуме фермента или субстрата (св ободного или связанного) в биологических или клинических образцах, кото рые предстоит анализировать. В-третьих, наличие соответствующей регист рирующей аппаратуры (спектрофотометра или спектрофлуориметра). И, након ец, в-четвертых, выбор той или иной фермент-субстратной пары диктуется ес тественным желанием экспериментатора или клинициста иметь в руках сис тему, обладающую максимальной специфичностью и чувствительностью. Фермент-субстратные системы, наиболее часто используемы е в твердофазном ИФА Фермент Субстрат Спос об Длина волны наблюдения (н/м) Чувствительность нг / образец Щелочная фосфатаза Паранитрофенилфосфат 4-метилумбеллиферил-фосфат Н-аденозинмонофосфат Фотометрия Флуорометрия Радиометрия 400,405 450(360) - 0,5-20 10 -4 -10 -2 10 -2 Пероксидаза аминосалициловая кислота Ортотолуидин (ОТ) 0ртофенилендиамин (ОФД) Ортодианизидин (ОД) Парагидроксифенилпропионовая кислота Фотометрия - //- - //- - //- Флуорометрия 450,474,520 630 450,492 400 405(320) 100 - 2,5 20 5*10 5 b -галактозидаза Ортонитрофенил- b - D -галакт озид 4-метилумбеллиферил- b - D -галактозид Флуоресцеин-ди ( b -галактозид ) Фотометрия Флуорометрия Флуорометрия 410 , 420 450(360) 450(360) 0,01-10 10 -6 — 10 -2 2*10 -2 *Для фотометрических измерений указаны только наиболее часто использу емые длины волн наблюдения; для флюорометрических измерений - длины волн флюоресценции и возбуждения (в скобках). Специфичность диагностической системы не зависит от выбора фермент-су бстратной пары и определяется в основном чистотой и гомогенностью испо льзуемых при конструировании диагностикума препаратов антигенов и ант ител. Использование в ТФИФА не гетерогенных антиген-содержащих препара тов и даже не очищенных бактерий и вирусов, а индивидуальных бактериальн ых и вирусных белков - вот единственный, хотя и трудоемкий путь повышения специфичности диагностических систем. То же можно сказать и о препарата х, используемых в ТФИФА иммуноглобулинов, - желательно использовать не ц ельные сыворотки и даже не суммарные гаммаглобулиновые фракции этих сы вороток, а аффинноочищенные или моноклональные антитела. Особой популярностью в настоящее время у нас в стране пользуются иммуно ферментные конъюгаты на основе пероксидазы хрена. Это, вероятно, связан о с доступностью сырья для выделения этого фермента, относительно легко стью очистки, достаточно высокой стабильностью, и большим числом хромоф орных и флуорохромных субстратов.. Тем не менее следует подчеркнуть, что два других достаточно часто используемых в ТФИФА фермента - щелочная фос фатаза и b -галактозидаза - в некоторых случаях имеют целый ряд преимущест в перед пероксидазой. Это, во-первых, высокая стабильность, растворимост ь и нетоксичность субстратов, а, во-вторых, возможность использования от носительно недорогих флуорохромных субстратов, применение которых рез ко повышает чувствительность анализа. Определенное значение для реализации максимальной чувствительности Т ФИФА имеет правильный выбор субстрата. Наряду с естественным желанием и спользовать субстраты с высокой удельной хромофорной активностью (выс окий коэффициент молярной экстинкции окрашенного конечного продукта) необходимо принимать во внимание такие важные факторы, как растворимос ть субстрата и продуктов его ферментативной модификации в условиях про ведения анализа и стабильность этих субстратов при хранении и в процесс е эксперимента. Чувствительность диагностических систем на основе ТФИФА лишь частично зависит от типа выбранной при конструировании диагностикума фермент-с убстратной пары. В основном эта чувствительность определяется другими факторами, которые трудно учесть: способом синтеза конъюгата, гомогенно стью и удельной активностью используемых для такого синтеза антител и а нтигенов, а также многочисленными параметрами проведения анализа (спос обом иммобилизации выявляемого антигена или антител, степенью их солюб илизации в биологическом или клиническом образце и т. д.). Именно в связи с этим в литературе приводится такой широкий диапазон пределов чувствит ельности для уже разработанных методик ТФИФА. На основании анализа этих данных трудно рекомендовать при конструировании вновь создаваемых тве рдофазных иммуноферментных систем наилучший фермент и наилучший субст рат. Следует лишь отметить, что с помощью использованных ранее фермент-с убстратных пар метод ТФИФА позволяет выявить в исследуемом образце нан ограммовые количества антигена при использовании хромофорных субстра тов и пикограммовые количества антигена при применении флюорохромных субстратов. Если при конструировании новой системы на основе ТФИФА невозможно или н ежелательно использование коммерческих универсальных конъюгатов (ант ивидовых фермент-меченных антител), то встает вопрос о синтезе конъюгата на основе выбранных фермента и антител. Как уже указывалось, наиболее сп ецифичные и высокоактивные конъюгаты могут быть получены на основе тол ько максимально очищенных белковых ингредиентов. Однако в связи с относ ительной сложностью и трудоемкостью работ по тщательной очистке бакте риальных и вирусных антигенов в настоящее время при разработке иммуноф ерментных систем часто используются либо цельные сыворотки, либо сумма рные фракции иммуноглобулинов, содержащие в своем составе как специфич еские, так и балластные антитела. Антигены также часто не подвергаются н адлежащей очистке, и используемый при конструировании диагностикума б елок составляет лишь небольшой процент от суммарного белка. В связи с эт им резко повышается вероятность неспецифических реакций, особенно опа сных при высокой чувствительности, которой обладают ИФ-методики. Большое значение для успешного использования ТФИФА в микробиологическ их и вирусологических исследованиях имеет правильная интерпретация по лученных результатов. Это особенно важно при использовании клиническо го материала, когда понятия «контроль» и «опыт» часто определяются с бол ьшой долей субъективизма. Для тестирования положительных проб вначале ставят 6-8 тестов на образцах, взятых от заведомо здоровых людей, и определ яют среднюю оптическую плотность контроля и стандартное отклонение пр и естественном разбросе данных за счет различных методических погрешн остей. Проба обычно считается положительной, если отклонение ее оптичес кой плотности от контроля в 3 раза превышает стандартное. 2. Иммуносенсоры Впервые принцип иммуносенсоров был использован М. А izaw а и соавторами в 1977 г оду, когда они сконструировали мембрану, способную на иммунологический ответ. В настоящее время опубликовано несколько сообщений об использов ании аналогичного подхода для определения различных микробных антиген ов или антител к ним. Принцип методов, основанных на иммуносенсорной технологии, заключаетс я в изменении физико-химических свойств мембраны или другого носителя, с вязанного с антителами или антигенами. Уменьшение мембранного потенци ала, изменение оптических или химических свойств среды, прилегающей к но сителю, выявляются с помощью специального электрода или оптического ус тройства и выражаются в виде электрического сигнала. Существует два основных типа иммуносенсоров, различающихся по особенн остям определения реакции антиген - антитело. 1 тип - так называемый немече ный иммуносенсор. Такое устройство состоит из металлического электрод а для потенциометрии, покрытого полупроницаемой полимерной мембраной с иммобилизованными на ней молекулами антител (или антигена). В результа те реакции с искомым комплементарным веществом образуются иммунные ко мплексы на поверхности мембраны. Это приводит к изменению заряда мембра ны и ее поверхностного потенциала. Изменение разности потенциалов и опр еделяется электродом.2 тип - меченый иммуносенсор. В этом случае на мембра не также иммобилизуются антитела или антиген, но реакция определяется п о изменению проводимости (амперметрия). Для этого используют кислородны й электрод, реагирующий на изменение концентрации О 2 после реакции антител с антигеном, меченым ферментом (например , каталазой). Конкуренция искомого антигена с известным количеством мече ного конъюгата дает изменение проводимости раствора в области мембран ы, что реализуется в виде электрического сигнала на выходе электрода. В д ругой модификации результат цветной ферментативной реакции может быть определен и с помощью оптического устройства. Для оценки результатов реакции в двух описанных типах иммуносенсоров з начительно реже используют пьезоэлектрический эффект, измерение темпе ратурных колебаний и некоторые другие способы, менее разработанные в ср авнении с электрохимическими и оптическими. Особенностью иммуносенсоров, отличающей их от других систем иммунохим ической диагностики, является то, что информация о возникновении иммунн ого комплекса непосредственно реализуется в виде физического сигнала - изменения разницы потенциалов, оптической плотности, силы тока и т. п. Одним из первых применений иммуносенсоров было измерение количества а нтител при сифилисе. Для этого на полупроницаемой мембране электрода св язывали антигены трепонемы и инкубировали его в растворе сыворотки кро ви. Изменения разницы потенциалов наблюдали вплоть до разведения полож ительной контрольной сыворотки 1:800, причем, увеличение сигнала соответст вовало повышению концентрации антител. Важно то, что после отмывания имм уносенсор можно использовать вновь. Аналогичный подход был применен дл я определения антител другой специфичности (к групповым антигенам кров и) и альбумина. Более сложное строение иммуносенсора увеличивает чувств ительность анализа. Так при использовании меченого иммуносенсора дост игается чувствительность до 0,1 нг белка/мл. Имеются данные об определении таким методом HBs -антигена с помощью I -электрода и антител к HBs -антигену, меч еных пероксидазой. Устройство, включающее стеклянную матрицу, активиро ванную различными вирусными антигенами (биочип) было использовано для с ерологической диагностики вирусных заболеваний. Предприняты попытки о пределять с помощью иммуносенсоров продукты синтеза некоторых грибов ( охратоксин А), клетки С. Albicans . Хотя в настоящее время отсутствуют коммерческие образцы иммуносенсоро в для диагностики инфекционных заболеваний, следует обратить внимание на основные этапы использования подобных устройств. Опыт использования аналогичных систем для определения глюкозы в крови, гормонов, низкомолекулярных веществ позволяет разделить процесс анали за на три этапа: 1. Подготовка образца для анализа Некоторые типы иммуносенсоров способны взаимодействовать непосредст венно с биологическим материалом. Однако чаще всего используется предв арительно отделенная центрифугированием плазма или сыворотка крови, р азведенная специальным раствором. 2. Проведение аналитической процедуры Помещая каплю раствора на микроэлектрод, или опуская электрод в исследу емый образец, создается контакт реагентов. Время достижения равновесия от нескольких секунд (для низкомолекулярных веществ) до нескольких мину т (для высокомолекулярных агентов, антигенов, клеток). Результат определ яется по разнице в показаниях с референс-электродом или по изменению сиг нала после реакции. Результат может быть выражен в систематических един ицах (милливольт, миллиампер), либо с помощью микропроцессора трансформи рован в единицы концентрации искомого агента, в соответствии с предвари тельным калиброванием. 3. Регенерация иммуносенсора Для повторного или многократного использования иммуносенсора необход имо освободить его рабочую поверхность от веществ, активно или пассивно сорбированных в ходе анализа. Наиболее простой способ регенерации сост оит в интенсивном последовательном промывании иммуносенсора растворо м с кислым значением рН и буферным раствором с высокой ионной силой. Для н екоторых типов иммуносенсоров до сих пор не найдено оптимальных услови й регенерации, не снижающих их чувствительность. В этих случаях использу ют сменные одноразовые мембранные элементы. В ближайшее время будут созданы надежные портативные иммуносенсоры дл я диагностики наиболее распространенных инфекционных заболеваний, как это сделано уже для анализаторов глюкозы. 3. Генное зондирование Интенсивное развитие молекулярной биологии и создание совершенной ме тодической базы генетических исследований явились основой генетическ ой инженерии. В области диагностики возникло и бурно развивается напра вление по определению специфических нуклеотидных последовательносте й ДНК и РНК, так называемое генное зондирование. В основе подобных метод ик лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации - образованию дв ухцепочных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеоти дов (А-Т, Г-Ц). Для определения искомой последовательности ДНК (или РНК) спец иально создается, так называемый, зонд полинуклеотид с определенной пос ледовательностью оснований. В его состав вводят специальную метку, позв оляющую идентифицировать образование комплекса. Хотя генное зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического а нализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется теми же способами, что и индикаторные методы им мунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют во сполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его фенотипич еской экспрессии (вирусы, встроенные в геном, «молчащие» гены). Первые сообщения об использовании зондов были связаны с чисто исследов ательскими задачами молекулярной биологии - контролем наличия тех или иных последовательностей ДНК в общем поле клеточной ДНК. Различают неск олько разновидностей генного зондирования: гибридизация по Саузерну ( анализ ДНК), Nothern -блот (анализ РНК), точечная гибридизация, гибридизация in situ . ( на срезе, в мазке). Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью получе ния одноцепочных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК- или РНК-з онда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК (ил и РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного ми кроорганизма), как правило, представленные в виде генетических последов ательностей в составе векторных плазмид, либо химически синтезированн ые олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда применяют преп араты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда - препараты РНК , особенно часто - рибосомальная РНК. В качестве метки используют те же индикаторы, что и при различных видах и ммунохимического анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотоп ( с дальнейшим проявлением комплексом авидин-фермент) и т. п. Порядок проведения анализа определяется свойствами имеющегося зонда. В исследовательских лабораториях используют ДНК-зонды, приготовленные самостоятельно и меченые, как правило, радиоактивным фосфором ( 32 Р). В настоящее время все чаще применяются коммерчес кие наборы, содержащие все необходимые ингредиенты. В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатура ция ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего - полимерный мембранный ф ильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание несвязав шихся продуктов, детекция. При отсутствии стандартного препарата ДНК- ил и РНК-зонда предварительно проводится его получение и введение метки. Для подготовки пробы может быть необходимо предварительное «подращива ние» исследуемого материала для идентификации отдельных колоний бакте рий или увеличения концентрации вирусов в клеточной культуре. Проводит ся и непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи, уретральны х соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие и нфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из состава кл еточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают пр епарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т. е. переход ее в одноцепочн ую форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец нуклеиновых ки слот фиксируют на носителе - нитроцеллюлезной или нейлоновой мембране, о бычно путем инкубации от 10 мин до 4 час при 80 С 0 в вакууме. Далее, в процессе предгибридизации достигается инактивация с вободных мест связывания для уменьшения неспецифического взаимодейст вия зонда с мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до 20 ч, в зависимо сти от концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и ег о размера. После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов пров одится детекция образовавшегося комплекса. Если в состав зонда входит р адиоактивная метка, то для проявления реакции мембрану экспонируют с фо топленкой (ауторадиография). Для других меток используют соответствующ ие процедуры. Например, известен метод определения модифицированных уч астков ДНК с помощью антител, введением в состав зонда низкомолекулярны х компонентов (биотин, дигоксин и т. п.) с последующим проявлением конъюгат ом авидин-фермент, антитело - фермент. Первые сообщения о коммерческих образцах наборов для генного зондиров ания появились в 1986 г. - ими стали наборы для определения М. pneumoniae , L . pneumoniae . Затем п оявились наборы для идентификации других патогенов, в том числе - вируса иммунодефицита человека. В настоящее время ведутся интенсивные разработки по упрощению процеду ры генного зондирования до одной - двух стадий процесса. Предприняты поп ытки отказаться от сорбции материала на мембране. Наиболее перспективным является получение нерадиоактивных (так называ емых - холодных) зондов. На этой же основе развивается методика гибридиза ции, позволяющая устанавливать наличие патогена в препаратах срезов, пу нктатов ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе (гибр идизация in situ ). Существенным этапом в развитии методов генного зондирования явилось и спользование полимеразной реакции амплификации (Р CR ). Этот подход позвол яет увеличить концентрацию определенной (заранее известной) последова тельности ДНК в пробе за счет синтеза многочисленных копий in vitro . Для прове дения реакции к исследуемому образцу ДНК добавляют препарат фермента Д НК-полимеразы, избыток дезоксинуклеотидов для синтеза и, так называемые , праймеры - два типа олигонуклеотидов величиной 20-25 оснований, соответств ующих концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Один из п раймеров должен быть копией начала участка считывания кодирующей цепи ДНК при направлении считывания 5-3, а второй - копией противоположного конц а некодирующей цепи. Тогда при каждом цикле полимеразной реакции происх одит удвоение количества ДНК-копий. Для осуществления связывания праймеров необходима денатурация ДНК (пл авление) при 94°С с последующим доведением смеси до 40-55°С. В первом сообщени и, описывающем метод, полимеразу добавляли вновь после каждого взаимоде йствия праймеров с ДНК, так как фермент не выдерживал нагревания до 94 0 . В настоящее время чаще используют ДНК- полимер азу термофильной бактерии Т. aquaticus , выдерживающую такую температуру и имею щую максимум активности при 70°С. Для проведения реакции сконструированы программируемые инкубаторы ми кропроб, позволяющие легко чередовать изменения температуры, оптималь ной для каждого этапа реакции. Реакция амплификации позволяет существенно повысить чувствительност ь анализа при генном зондировании, что особенно важно при низкой концент рации инфекционного агента. Особое значение этот подход приобрел при ди агностике СПИДа и некоторых других вирусных инфекций. Причем в этих случ аях впервые была показана возможность амплификации и для РНК-содержащи х вирусов (непосредственно, или через провирусную ДНК). Одним из существенных достоинств генного зондирования с амплификацией является возможность исследования субмикроскопического количества п атологического материала. Так уже показана возможность генетического анализа материала единственной волосяной сумки, взятой из человеческо й кожи, или нескольких десятков буккальных клеток, полученных простым по лосканием полости рта. Другой особенностью метода, более важной для анализа инфекционного мат ериала, является возможность выявления скрытых (молчащих) генов. Наприме р, выявление гена холерного токсина в штаммах без его фенотипического пр оявления, позволяет сделать важные выводы при эпидемиологическом анал изе. Методы, связанные с использованием генного зондирования, безусловно, бу дут более широко внедряться в практику диагностики инфекционных забол еваний по мере их упрощения и удешевления. 4. Иммуноэлектрофорез Иммуноэлектрофорез помогает идентифицировать антигены по электрофор етической подвижности, особенно в том случае, когда в образце присутству ют и другие антигены. С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов и иденти фицируют миеломные белки. На основе сочетания электрофореза с иммуноперципитацией разработано н есколько удачных методов, в каждом из которых перемещение антигена в эле ктрическом поле приводит к его контакту с антителами. Встречный иммуноэ лектрофорез может применяться для определения антигенов, мигрирующих в агаре к положительно заряженному электроду. Данный метод занимает мен ьше времени и более чувствителен, чем двойная диффузия по Ухтерлони. Его применяют для идентификации антигенов вируса гепатита В и соответству ющих антител, антител к ДНК при системной красной волчанке, аутоантител к растворимым ядерным антигенам при коллагенозах, а также антител (преци питинов) к Aspergillus при аллергическом бронхолегочном аспергиллезе. Ракетный электрофорез-это количественный метод, предусматривающий внесение ант игена в гель, содержащий антитела. Линия преципитации имеет форму ракеты , длина которой определяется концентрацией антигена. Как и встречный эле ктрофорез, это быстрый метод, но и здесь антиген должен перемещаться к по ложительно заряженному электроду. Таким образом, ракетный электрофоре з подходит для белков, например альбумина, трансферрина и церулоплазмин а, в то время как концентрацию иммуноглобулинов обычно определяют метод ом простой радиальной иммунодиффузии. Один из наиболее удачных вариант ов ракетного электрофореза - двухмерный или перекрестный иммуноэлектр офорез Лорелла. При этом на первом этапе смесь антигенов электрофоретич ески разделяют в геле агарозы. Затем разделенные белки вновь заставляют диффундировать в геле под влиянием электрического поля в другом направ лении, перпендикулярном первому. Таким образом, удалось количественно о пределить каждый из антигенов смеси. Наиболее впечатляющий пример- это о ценка степени конверсии СЗ в инактивированную форму СЗс, которая часто п роисходит при обострении в сыворотке больных системной красной волчан кой или синовиальной жидкости пораженных суставов в острой фазе ревмат оидного артрита, а также в других случаях. 5. Иммуноблоттинг После разделения сложной смеси белков методом электрофореза в полиакр иламидном или агарозном геле их можно перенести из геля на микропористу ю нитроцеллюлозную мембрану. Далее неспецифически связанные с мембран ой антигены могут быть идентифицированы с помощью меченых антител. Данн ый метод получил широкое распространение. Например, он используется для идентификации компонентов нейрофиламентов, которые предварительно ра зделяют в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия ( ДСН). Разумеется, если антиген необратимо денатурируется ДСН, то такая методи ка использоваться не может. Если белки антисывороткк разделить изоэлек трофокусированием, а затем перенести (это и называется блоттингом) на ме мбрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодейству ющих с данным антигеном. 6. Критерии положительных и отрицательных реакций Проблема дифференциации положительного и отрицательного результата н е является специфической для медицины, а пути ее разрешения лежат в обла сти математической статистики. Тем не менее, следует обсудить некоторые практические вопросы, с которыми встречаются врачи при использовании р азличных методов лабораторной диагностики, в том числе - иммунохимическ ого анализа при инфекционных заболеваниях. Основным противоречием, возникающим при анализе лабораторных данных и приводящим к совершенствованию известных и разработке новых методов д иагностики, является несоответствие между целью медицинской диагност ики как таковой, т. е. стремлением врача определить, чем болен пациент и це лью того или иного метода (установление какого-либо параметра внутренне й среды организма). Поэтому любой метод иммунохимического анализа долже н рассматриваться лишь как часть общей диагностической процедуры. Ни од ин из этих методов не может быть использован вне клинической интерпрет ации. Ложноположительные или ложноотрицательные выя реакции при лабор аторном анализе имеют значение не только для самого пациента. Такая ситу ация при СПИДе, например, оказалась опасной и в социальном и в эпидемиол огическом аспекте. В лабораторном анализе при характеристике аналитической процедуры при нято указывать количественные показатели метода: чувствительность, во спроизводимость, точность и др. Однако при определенных взаимодействия х между организмом и инфекционным агентом может возникнуть ситуация, ко гда высокочувствительный метод не позволяет получить достоверную инфо рмацию о причине заболевания. Например, определение антител любыми сове ршенными методами не дает информацию в случае выраженной иммуносупрес сии гуморального ответа. Для того, чтобы выразить возможность использования симптома (результат а иммунохимического анализа) для диагностики определенного заболевани я можно определить понятия чувствительности и специфичности анализа, в сравнении с контрольной группой здоровых людей, как частоту положитель ных и отрицательных реакций. Эти параметры могут быть использованы при сравнении эффективности как их-либо методов. Однако для применения их на практике необходимо уточнит ь принципы формирования опытной и контрольной групп, а также оценить, ка кое значение имеют вычисленные параметры для оценки случайно выбранны х неизвестных образцов. Правильное решение указанных вопросов и позвол яет перейти к разработке критериев положительной и отрицательной реак ции. Для формирования опытной группы больных с инфекционной патологией, как правило, используют больных, у которых обнаружен искомый инфекционный агент другими методами - бактериологическими, вирусологическими и т. п. В случае инфекции, вызываемой условнопатогенными микроорганизмами, испо льзуют количественные или функциональные критерии. В зависимости от це лей анализа, группа может быть более или менее однородной по другим при знакам данного заболевания - особенностям течения и тяжести инфекционн ого процесса, возрасту больных, сопутствующему лечению (прежде всего - в ведению антибиотиков). Формирование контрольной группы из здоровых лиц является наиболее час тым, но не единственным способом. Если анализируемый метод будет примене н для дифференциального анализа _ сходных заболеваний, вызываемых разны ми микроорганизмами, более важным является подбор группы с заболевани ем, которое следует исключить при установлении диагноза. Например, при о строй пневмонии, вызванной различными возбудителями, для оценки чувств ительности и специфичности, например, метода определения антигенов пне вмококка, следует сформировать контрольную группу из больных с заболев анием, вызванным гемофильной палочкой. Вышеуказанное важно учитывать п ри разработке методов диагностики. Однако и при использовании этих мето дов следует иметь представление о причинах возникновения и возможной и нтерпретации ложноположительных и ложноотрицательных реакций. При ана лизе образцов от пациентов с неизвестным диагнозом следует учитывать дополнительные параметры, производные от чувствительности и специфич ности анализа. В целом, чем выше чувствительность и специфичность анализа, тем выше цен ность положительного и отрицательного результатов. Однако для случайн о взятых образцов значение ожидаемой ценности результатов будет завис еть от частоты данного заболевания в популяции (преваленс). Например, при чувствительности и специфичности метода равных 99% и частоте заболевания 0,1% количество больных на 100 000 пациентов составит 100, из них положительная реа кция будет у 99. Однако у пациентов без данного заболевания (всего их 99 900) буд ет в 100 случаях также выявлена положительная реакция. Таким образом, ценно сть положительного результата составит 99/(100+99) 50%, а отрицательного - 99 80ОД99 800+1) 100%. В случае же, если в данной популяции частота заболевания более высока, то и ценность положительного результата выше. Например, при частоте в 10%, соо тветствующие значения ценности положительного результата - 91,70/0, а отрица тельного - 99,9%. Влияет ли выбор критерия оценки положительного и отрицательного резул ьтата на чувствительность и специфичность анализа? При оценке того или иного метода диагностики врач, как правило, пользует ся критериями, специально выработанными для данного метода, реже - собст венным опытом. В качестве критерия установления положительного или отр ицательного результата может выступать параметр в виде концентрации в ещества (в сравнении с концентрацией в норме). Могут быть использованы бе зразмерные величины, выражающие отношение определяемого показателя к нормальной величине. Иногда критерием служат единицы активности матер иала и характеристики активности, специально введенных меченых молеку л (флуохромы, изотопы и т. п.). Наиболее часто определение критерия положительной реакции связано с а нализом образцов из опытной и контрольной групп, описанных выше. Определ ение значений чувствительности и специфичности при разных способах оц енки позволяет выявить критерий, соответствующий максимальному значен ию вычисленных величин. Принципиальное значение для определения этих критериев имеет аналитич еская вариабельность метода, т. е. величина расхождения между значениями , полученными при многократных измерениях одной и той же пробы. Допускае тся, что этот параметр должен составить не более 10% среднего значения изме ряемой величины, но не больше 25% ширины интервала величин, полученных в ко нтрольной группе. Большое разнообразие методов и реакций, применяемых в иммунохимическо м анализе отражает различия в течение инфекционных процессов, многообр азие возбудителей и условий взаимодействия между микро- и макроорганиз мом. Но также, как не может существовать единственного средства лечения всех болезней, нет панацеи и в диагностическом смысле. Итак, проведение аналитических процедур при подозрении на инфекционно е заболевание, должно быть направлено на обнаружение патогенного агент а (вируса, бактерии, простейшего и т. п.), а также иммунологического ответа м акроорганизма на этот агент. Классическая триада Коха в подавляющем бол ьшинстве случаев является недостижимым условием диагностики вирусных и бактериальных заболеваний, в меньшей степени - паразитарных. Многочисл енные исследования бессимптомного носительства вирусов и бактерий убе ждают в том, что обнаружение микроба является лишь одним из признаков, ко торые должны учитываться врачом при постановке диагноза. Ситуацию осло жняют частые смешанные инфекции (ассоциации типа вирус - вирус, бактерия - бактерия и вирус - бактерия). Кроме того, иммунный ответ на инфекционный аг ент не во всех случаях носит регулярный характер (первичные и вторичные иммунодефициты). С другой стороны, современный человек иммунизируется д остаточно большим количеством вакцин, что может маскировать развитие с опутствующей инфекции. В связи с этим, процесс установления диагноза, в т ом числе с помощью иммунохимических методов, следует рассматривать как вероятностный. Привлечение дополнительной информации (расширение симп томатики) можно считать способом увеличения вероятности установления правильного диагноза. Для инфекционных заболеваний, несмотря на конкре тный тип или вид возбудителя, можно назвать три основных процесса, котор ые определяют вероятность идентификации этиологического агента: - наличие в макроорганизме или на ограничивающих его покровах генетичес кого материала микроорганизма, продукты которого, прямо или опосредова но, повреждают функциональные структуры микроорганизма; - определение в макроорганизме или на ограничивающих его покровах этих б иологически активных продуктов микроорганизма, приводящих к проявлени ю симптомов, характерных для данного заболевания; - изменение состояния иммунной системы макроорганизма под действием ми кробных продуктов, направленное на их нейтрализацию. Очевидно, что ни один из этих признаков не выявляется в 100% случаях в любой с тадии и разновидности инфекции определенного типа. Так, на стадии выздор овления сами микробы и многие их продукты могут не определяться. Иногда развернутая клиническая картина является следствием воздействия на ма кроорганизм микроба, который быстро элиминируется из организма. При это м, в одних случаях невозможно достоверно определить генетический матер иал микроба, а в других - уже нейтрализованный антигенный материал. Иммун ный ответ, как уже отмечалось выше, может развиваться лишь через несколь ко суток после начала болезни. Следовательно, в начальной стадии болезни определение, например, наличия антител затруднительно. Но, тем не менее, н аличие в течение определенного периода времени одного, двух или всех тре х рассмотренных признаков пропорционально ведет к увеличению вероятно сти того, что данный микроб является возбудителем. И наоборот, если ни оди н их этих признаков не наблюдается, то эта вероятность стремится к нулю. Рассматривая примеры использования различных методов для специфическ ой диагностики инфекционных заболеваний можно отметить, что коммерчес кие препараты, используемые в мире для этих целей, относятся в основном к методам агглютинации, преципитации, нейтрализации вирусов, ингибирова ния гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, коагглютинации, латек сагглютинации, реакции связывания комплемента, иммунофлуоресценции, И ФА. Значительно реже для этих целей используют радиоиммунологический а нализ, метод генного зондирования, а коммерческие иммуносенсоры и липос омальные методы еще только разрабатываются. Хотя в научной литературе е сть сообщения о разных видах иммунохимического анализа, описанных или н е упомянутых в настоящей главе, немногие методы стали общепринятыми. Таблица: Возможности использования коммерческих препар атов для различных методов лабораторной диагностики при инфекциях у че ловека Метод Определяемый ком понент Инфекционная патология (возбудитель) Прямая агглютинация Антигены, антитела Кишечные инфекции ( Sallmonella , Shigella , Escherichia , Proteus , Brucella ),Респираторная инфекция ( B . Pertussis , Legionella , N . meningitidis , S . Pneumoniae , Staphylococcus , Streptococcus ), Listeria monocytogenes , T . gondii Торможение прямой гемагглютинации Антитела Вирусы ЕСНО-коксак и, гриппа, парагриппа, паротита, кори, реовирусы Нейтрализация Антитела М. Pneumoniae , Вирусы ЕСНО-коксаки, аденовирусы, гриппа, парагриппа, полимиелита, реовирусы Перциптация Антигены, антитела Гистоплазмоз, кокцидиоидомикоз , бластомикоз, аспергиллез. кандидоз, сифилис Коааглютинация Антигены Кишечные инфекции ( Shigella , энтеротоксиког енные E . Coli ), менингит ( N . meningitidis , S . Pneumoniae , H . Influenzae ) Латексагглютинация Антигены, антитела менингит ( N . meningitidis , S . Pneumoniae , Streptococcus , H . Influenzae ), E . Coli , S . aureus , Cl . Perfingens, эхино коккоз , мононуклеоз , краснуха , криптококкоз , цито мегаловирус . РПГА Антитела Yersinia , Staphylococcus , мононуклеоз, краснуха, трипаносомоз, шист омоз, лейшманиоз, эхинококкоз, амебная дизентерия Реакция связывания комплемента Антитела Большинство патогенн ых вирусов, бактерий, Chlamidia , М. Pneumoniae , рикетсии, Р. Capsulatum , B . dermatitidis , C . immitis , Aspergillus Иммунфлуоресценция Антигены, антитела A деновирусы, Вирусы ЕСН О-коксаки, цитомегаловирус, вирус простого герпеса, гриппа, краснухи, геп атита В, М. Pneumoniae , Большинство патогенных бактерий, E . Histolytica Иммуноферментный анализ Антигены, антитела Большинство патоге нных бактерий, вирусов, грибы, простейшие Генные зонды Нуклеиновые кислоты М. Pneumoniae , L . Pneumoniae , A деновирусы, Вирусы ЕСНО-коксаки, гепатита A и В, вирус простого герпеса, ВИЧ-1, ВИЧ-2, папиломавир ус Для бактериальных инфекций в некоторых случаях сохраняется испол ьзование методов прямой агглютинации бактерий для идентификации их чи стой культуры (при респираторных, кишечных инфекциях) либо определение а нтител (кишечные инфекции), хотя значение этих реакций в сравнении с друг ими более чувствительными, постепенно снижается. Такая же закономернос ть наблюдается и при использовании методов прямой агглютинации при пар азитарных заболеваниях. Аналогом для вирусных инфекций является метод прямой гемагглютинации. Однако, из-за его относительно невысокой специфичности, практически бол ее важным является метод ингибирования (торможения) реакции гемагглюти нации с целью определения антител к вирусу. Для этих же целей используют метод нейтрализации вирусов, однако он более трудоемок из-за необходимо сти поддержания культуры вируса. При бактериальных, вирусных и паразитарных инфекциях на смену этим реак циям приходят методы коагглютинации (определение антигенов) и латексаг глютинации (определение антигенов, либо антител). Эти методы находят все большее практическое применение, особенно при диагностике менингитов, респираторных и некоторых кишечных инфекций. Реакция пассивной агглют инации по-прежнему популярна при диагностике паразитарных заболеваний , реже при определении антител к вирусам (краснуха, мононуклеоз). Для определения антител при большинстве видов инфекций, а особенно широ ко - при вирусных заболеваниях и болезнях, вызываемых риккетсиями, микоп лазмами и т. п. используется реакция связывания комплемента. Однако в пос леднее десятилетие этот метод вытесняется ИФА. В силу своей универсальности при различных видах инфекционной патолог ии распространен иммунофлюоресцентный метод для определения антигено в и антител. В обычных вариантах он основан на микроскопии и визуальном н аблюдении. Это одновременно и недостаток (субъективная оценка) и достоин ство (наглядность), что в значительной мере руководит при его выборе врач ом, в зависимости от целей анализа. Модификации последних лет, основанны е на инструментальном учете, вместе с ИФА теснят другие иммунохимически е методы. Для подтверждения некоторых форм гепатита В, а также СПИДа применяется р адиоиммунологический анализ для диагностики инфекций. Расширение обла сти его использования в практике диагностики инфекционной патологии м ало вероятно. Иммуноферментный анализ для определения антигенов и антител к микроор ганизмам находит все более широкое применение в практике. В настоящее вр емя по частоте применения он не уступает, а во многих случаях (гепатиты, СП ИД) превосходит другие методы иммунохимического анализа. При бактериал ьных, вирусных, паразитарных заболеваниях с его помощью определяют разл ичные антигены микробов и антитела к ним, относящиеся к разным классам и ммуноглобулинов. Практически важным при выявлении антигена любым методом иммунохимичес кого анализа является представление о природе искомого антигена. В неко торых случаях система анализа ориентирована лишь на определенный тип а нтигена, характерный для определенного типа инфекции. Например, при диаг ностике коклюша можно определять различные компоненты бактерии - ЛПС, ра зличные белки и т. д. Однако наиболее существенно выявление коклюшного т оксина. Вирусы, вызывающие у человека СПИД (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) имеют общие антиген ы с вирусами лейкоза крупного рогатого скота, но диагностически значимо определять специфические гликопротеины gp 24, gp 120 и т. д. То же относится и к опр еделению антител. При бактериальном эндокардите, вызываемом S . aureus диагнос тически более значимы антитела к тейхоевым кислотам, а при респираторно й стафилококковой инфекции - антитела к поверхностным антигенам. При исп ользовании того или иного набора для проведения иммунологического ана лиза следует определять, для какого типа заболевания определяемый приз нак является информативным, т. е. увеличивающим вероятность точного диаг ноза. В результате рассмотрения всего многообразия методов иммунохимическо й диагностики, можно сделать вывод, что необходимым является использова ние различных методов, оптимальный набор которых зависит от конкретной патологии. Так для острой респираторной инфекции кроме классических ба ктериологического и вирусологического анализа можно рекомендовать ме тод латексагглютинации для определения антигенов, иммунофлуоресцентн ый метод для подтверждения, иммуноферментный для определения антител. П ри СПИДе проводится определение вируса и антител к нему иммуноферментн ым методом (иногда скрининг - методом латексагглютинации) с подтверждени ем иммуноферментным (вестерн-блат), либо радиоиммунологическим методом. Наиболее приемлемые варианты обследования и уровень сложности методов диктуют цели непосредственного анализа. Для массового скрининга необх одимы простые, но надежные и чувствительные методы (латексагглютинация, гомогенный ИФА, иногда РПГА), позволяющие проводить десятки и сотни анал изов в сутки. Для установления первичного диагноза в поликлиническом ле чебном заведении, для анализа образцов в лаборатории СЭС необходимы отн осительно простые методы, но с более высокими показателями чувствитель ности (ИФА, РИА). При обследовании пациента в специализированной клинике комплекс таких методов должен быть как можно более широким, включая и дл ительные наблюдения динамики развития процесса, иммуногистологически й анализ (в том числе - иммунофлуоресцентный), генное зондирование и т. д. Последовательное применение изложенных принципов позволит наиболее э ффективно использовать преимущества высокочувствительных и информат ивных методов иммунохимического анализа для диагностики инфекционных заболеваний человека. Список используемой литературы А.М. Егоров “Теория и практика иммуноферментного анализа” Высшая школа 1991 г. В.Г. Галактинов “Графические модели в иммунологии” Медицина 1986 г. Каталог фирмы Biorad 1996 г. Материалы занятий и лекции по микробиологии 1995 - 1996 год. Р.В. Петров “Иммунология” Медицина 1987 г. Ройт А. “Основы иммунологии” Мир 1990 г. Руководство “Иммунология инфекционного процесса” Москва 1994 г. У.П. Коллинз “Новые методы иммуноанализа” Мир 1991 г.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Учёба подразделяется на два типа:
1. Слишком сложно, чтобы выучить.
2. Слишком просто, чтобы учить.
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, реферат по медицине и здоровью "Критерии оценки методов иммунодиагностики", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru