Реферат: Аденилатциклазный сигнальный механизм - текст реферата. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Реферат

Аденилатциклазный сигнальный механизм

Банк рефератов / Медицина и здоровье

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Реферат
Язык реферата: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Архив Zip, 569 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникального реферата

Узнайте стоимость написания уникальной работы

53 АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ ИНСУЛИНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА У ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ Актуальность проблемы Изучение гормональных сигнальных систем, участвующих в регуляци и жизненно важных для организма клеточных процессов , является о дной из актуальных проблем современной молекулярной эндокринологии и биохимии . К ч ислу систем, осуществляющих реализаци ю регуляторного действия веществ гормональной и негормональной природы , относится аденилатциклазная сигнальная система (АЦС) , которая представлена в клетке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по крайней мере, из трех молекулярных блоков. Необходимыми компонентами АЦС являются : р ецептор ы , способны е воспринимать внеклеточные сигналы, гетеротримерны е ГТФ-связывающие белки ( G-бел ки ) стимулирующего (Gs) и ли ингибирующего (Gi) тип а , состоящие из трех субъединиц – б, , г и обеспечивающие сопряжение между рецептором и третьим компонентом системы - ф ерментом аденилатциклазой (АЦ), катализирующей образование универсального внутриклеточного посредника – циклического аденозинмонофосфата (ц АМФ ) . При его участии осуществляется реализаци я целого ряда регуляторных эффектов в клетке (пролифераци я , дифференцировк а , апоптоз , син тез белка и др.). К настоящему времени в литературе накоплен значительный объем данных, свидетельствующих об участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормоно в не пептидн ой природы ( серотонин, адреналин, норадреналин и др.) , осуществляющих свой эффект на клетку через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. В рамках на стоящего исследования мы предприняли попытку выяснить возможность участия АЦС в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства , обладающих рецепторами тирозинкиназного типа, один раз пронизывающими мембрану клетки. До исследований, проведенных нами, участие системы АЦ С -цАМФ в реализации действия гормонов инсулиновой природы практически отрицалось . В литературе и мелись лишь отдельные сведения о влиянии инсулин а , бомбиксин а , релаксин а на а ктивность АЦ (Pertseva et al., 2003; Patel, 2004) . Н есмотря на успехи, достигнутые за последние десятилетия в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейотропного действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными ( Pertseva et al., 2003 ; Телкова, 2005 ). В связи с этим изучение ранее неизвестных молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства, насчитывающего в настоящее время около 50 представителей, относится к числу актуальных проблем современной эндокринологии. Согласно современным представлениям, инсулин и родственные ему пептиды играют ключевую роль в регуля ции ряда клеточных процессов – клеточный рост, апоптоз , метаболизм . Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение , так как возникли в ходе эволюции из о бщего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при этом структурное и функциональное сходство ( Murray-Rust et al., 1992; Chan et al., 1992) . К изучению участия АЦС в реализации действия гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы лаборатория приступила в начале 90-х годов . Отправной точкой послужили данные, впервые полученные нами , о способности инсулина и родственных пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков (Plesneva et al., 1994). Мы использ овали эволюционный подход, предложенный Л.А. Орбели (1958) применительно к эволюционной биохимии , который включал исследовани я в филогенезе , онтогенезе и при патологии. Было изучено: 1) влияни е на АЦС инсулина , инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) позвоночных и инсулиноподобного пептида (ИПП) беспозвоночных ( моллюск Anodonta cygnea ; 2) влияние на АЦС пептидов в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные – крысы, птицы и беспозвоночные – моллюски); 3) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе (в тканях куриных эмбрионов разного возраста и у цыплят); 4) действи е пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных. Цель работы . Д оказат ь участие аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР - 1, ИПП моллюска в клетк е и расшифров ать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма их действия в тканях позвоночных и беспозвоночных , а также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции фундаментальных клеточных процессов – клеточн ый рост, апоптоз . З адачи исследования 1. И сследовать действие ин сулина, ИФР-1 и ИПП , выделенного из висцеральных органов моллюск а Anodonta cygnea (Русаков и др., 1991) , на АЦС в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных . О характеризовать зависимость эффект а от времени и концентрации исследуемых пептидов , а также от присутствия гуанин овых нуклеотидов для п о дтверждения вовлеченности в АЦ сигнальный механизм гетеротримерных G-белков. 2. И сследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма , опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и выяснить последовательность этапов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС. С этой целью: а ) у становить тип рецептор ов и G-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия пептидов , используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами ; б) в ы я вить участие фосфатидилинозитол-3 киназы ( ФИ-3-К ) , используя специфичный ингибитор вортманнин; в) идентифицировать изоформу протеинкиназы «С» ( ПКС ) ; используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформ ам П КС . 3 . Исследовать участие АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1 в регуляции процесс ов клеточного роста и апоптоза, и сходя из гипотез ы о важной роли цАМФ в регуляции фундаментальных процессов в клетке (Перцева, 2000) . 4. Исследовать функциональные нарушения в АЦ сигнально м механизм е действия пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии – сахарный диабет 1 -го и 2 -го типов. Научна я новизна Впервые обнаружено стимулирующее действие инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска A . cygnea на активность АЦ. Показано участие рецепторной тирозинкиназы и установлена вовлеченность G-белков ( Gi ) и ( Gs ) тип а в реализаци ю активирующего действия этих пептидов на АЦ. Впервые показано, что в проявлении АЦ стимулирующих эффектов инсулина и ИФР-1 участвуют ФИ-3-К и изоформ ы ПКС - ПКС и возможно ПКС е. В мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных о бнаружен ранее неизвестный АЦ сигнальн ый механизм действия инсулина и ИФР-1 и у станов лена его структурно-функциональн ая организаци я , представленная в клетке следующ ей сигнальн ой цепь ю : рецептор тирозинкиназ ного типа Gi-белок ( г -димер ) ФИ-3-К ПКС (позвоночные) или ПКС е ( беспозвоночные) Gs-белок АЦ цАМФ п ротеинкиназа «А» ( ПКА ) эф ф екторные системы . Этот механизм отличается по числу сигнальных блоков от извес т н ого АЦ сигнальн ого механизм а действия гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа , представленного в клетке следующей цепью: рецептор серпантинного типа G-белок (Gi или Gs) АЦ цАМФ ПКА эффекторные системы . Следует отметить, что действие пептидов инсулиновой природы на АЦ в мышечной ткани моллюска осуществляется через АЦ сигнальный механизм , сходный с таковым позвоночных , но имеющий на пострецепторных этапах трансдукции гормонального сигнала отличие на уровне ПКС . Исходя из результатов нашего исследования , в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных принимает участие ПКС ж , а у беспозвоночных (моллюски) , как предполагается, – ПКС е . Э кспериментально подт верждена , выдвинутая нами гипотеза , о важной роли АЦ-цАМФ в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР - 1 на фундаментальные процессы в клетке . Показан о участие АЦ-цАМФ системы в способност и ИФР-1 и инсулина стимулировать клеточный рост и ингибировать апоптоз в культур ах фибробластоподобных клеток . Обнаружены нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при патологии (сахарный диабет 1-го и 2-го типов). Теоретическое и практичес кое значение работы Теоретическ ое и практическ ое знач ение работы определяется важн ой роль ю инсулин а и други х пептид ов инсулинового суперсемейства в организме высших и низших животных . Обнаружение новых сигнальных механизмов действия пептидов этой группы, в частности инсулина и ИФР - 1 , расширяет современные представления о спектре сигнальных систем , участвующих в регуляторном действии пептидов инсулинового суперсемейства. Применение эволюционного подхода ( изучени е ряда эволюционно - родственных пептидов и использование представителей позвоночных и беспозвоночных ) позволило выявить консервативность обнаруженного АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулиновой природы. Д анны е, полученные на беспозвоночных, могут быть полезны для понимания сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и для разработки м оделей эндокринной патологии у человека (сахарный диабет) в рамках нового направления - «эволюционн ая биомедицин а » ( Перцева , 200 6 ) . П олученные данные о молекулярных механизмах действия инсулина и ИФР-1 имеют фундаментальное значение и могут применяться при чтении курса лекций в университетах и медицинских ВУЗах как в России, так и за рубежом. Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза сахарно го диабет а, а также в создании нов ых подход ов для диагностики этого заболевания. Обнаруженный нами АЦ с игнальный механизм действия инсулина, может служить основой для разработки биохимического тест а , позволяюще го проводить диагностику нарушения отдельных звеньев в молекулярн ом механизм е действия инсулина . П оложения , выносимые на защиту 1. Впервые установлено, что п ептиды инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска Anodonta cygnea ) ГТФ-зависимым образом активирую т АЦ в тканях позвоночных (млекопитающие, птицы) и беспозвоночных (моллюски) животных . 2. Реализация АЦ активирующего действия пептидов инсулино вой природы осуществляется через о бнаруженный нами АЦ сигнальный механизм, включающ ий следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (вг -димер ) ФИ-3-К ПК С Gs-белок АЦ . 3. С участием АЦ сигнальн ого механизм а , генерирующего цАМФ , осуществляется регуляторно е действи е пептидов инсулиновой природы на фундаментальные клеточные процесс ы - стимул ируется клеточн ый рост и ингибир уется апоптоз. 4. При эндокринной патологии (сахарн ом диабет е 1-го и 2-го типов) наруш ается функционировани е АЦ сигнального механизма действия гормонов инсулиновой природы в основном на уровне G s -белка и его сопряжения с АЦ. 5 . Сходство структурно-функциональной организации АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных животных свидетельствует о б его эволюционной консервативности . Апробация работы Основные результаты и положения работы были представлены и доложены на следующих конференциях и съездах: 17- я, 19-я , 20-я , 21-я Конференции Европейского О бщества Эндокринологов (Кордо в а, Испания, 1994 ; Нидерланды, 1998; Фаро, Португалия, 2000; Бонн , Германия, 2002 ) ; 4-й Симпозиум по нейробиологии моллюсков (Амстердам, Нидерланды, 1994); Симпозиум по инсулину, ИФР-1 и инсулиноподобным пептидам (Испания, Барселона , 1997); XXXIII Международный конгресс физиологов (Санкт-Петербург, 1997 ); 2-й съезд Биохимического Общества РАН ( Москва, 1 997 ) ; XVII съезд физиологов России ( Ростов-на-Дону, 1998 ); конференция “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” ( Пущино , 1998); Съезд Биохимического общества Университета Глазго ( Глазго, Великобритания, 1999 ); 18-ый Международный конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Бирмингем, Англия, 2000); 3-я и 4-я М еждународн ые конференция по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000 ; Виоминг, США, 2004 ); XVIII Съезд Физиологического Общества имени И.П. Павлова , Казань, 2001 ); XI, XII и XIII Междунар одн ые совещания по эвол юционной физиологии ( С анкт -Петербург, 1996; 2001 ; 2006 ); Международная Европей с кая конференция ( Люксембург, 2002); Втор ая конференция “Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии”, посвящ енная 80-летию со дня рожд ения М.Г. Колпакова . ( Новосибирск. Октябрь, 2002 ); 1-й съезд Общества К леточн ых Б иолог ов (Санкт-Петербург, 2003); Физиологичес кий съезд (Екатеринбург, 200 4 ); 1-й Съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); Публикации . По теме диссертации опубликовано 75 работ, в том числе 3 6 статей в рецензируемых отечественных и международных изданиях . Личный вклад автора – Экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 2 5 9 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 2 8 5 источников. Работа иллюстрирована 4 3 рисунками и 35 таблицами. Основное содержание работы Объекты и методы исследования . Объектами исследования служили: 1) представители позвоночных - крыс ы Ratus norvegicus линии Wistar ; 2) куры породы русская белая « Леггорн » ; 3) представители беспозвоночных - пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea ; 4 ) культур а клеток миобластов куриных эмбрионов ; 5) фибробластоподобная культура клеток линии Swiss 3T3 ; 6) культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов линии Е1А+сНа-ras (клет ки , впадающи е в апоптоз) и E1A+E1B (клетк и, не впадающи е в апоптоз). М етоды . В работе использова н широкий спектр физиологических, биохимических и фармакологических методов : - выделение фракций плазматических мембран мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных с использованием метод а дифференциального центрифугирования (Kidw a i et . al., 1973 с нашими модификациями ) ; - выделение частично очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных эмбрионов , фибробластоподобных клеток линии Swiss 3T3 , E1A+cHa-ras , E1A+E1B (Плеснёва и др., 199 9 ; 2003 ) ; - выделение фракции, содержащей примембранн ую форм у цАМФ-ФДЭ (Houslay, 1985). - определение активности АЦ с использованием радиоакти вного субстрата АЦ реакции - [ б 32 P]АТФ (Salomon et al., 19 74 с н екоторыми модификациями ) ; - о пределение активности цАМФ-ФДЭ, с использованием радиоактивного субстрата [ 3 H]цАМФ (Ткачук и др., 1978) ; - АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белк ов холерным и коклюшным токсинами (Pertseva et al., 1992 ) ; - электрофорез в ПААГ - иммуноблотинг с использованием моноклональных антител для идентификации изоформы ПКС ж; - определение ростстимулирующей активности действия инсулина, ИФР-1, ЭФР и цАМФ по включени ю [ 14 C] тимидина в ДНК культур ы клеток Swiss 3 T 3 (Баркан и др. 1992; Плеснёва и др., 1997; 1999); - использование модели апоптоза на трансформированных клетках, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов E1A+cHa-ras, обладающих высокой проапототической чувствительностью к удалению ростовых факторов ( Bulavin et . al ., 1999) и ее характеристика (Плеснёва и др., 2003); - оценка антиапоптотического действия инсулина , ИФР-1 и цАМФ с использованием метода клоногенной выживаемости культуры клеток E1A+cHa-ras ( Плеснёва и др., 2003); - о пределение активн ости ферментов углеводного метаб олизма – гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Кузнецова , 1998; Кузнецова и др., 2004) ; - определения содержания белков методом Лоури ; - создания м одел ей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных (Ping et al., 1999 с нашими модификациями ) и диабет о подобного состояния у беспозвоночных ( Плеснева и др., 2006; Кузнецова и др., 2007) с использованием стрептозотоцина . - статистические методы обработки данных по программам ( Statgra ph и Anova ). Результаты исследования и их обсуждение В работе представлены экспериментальные доказательства ак тивирующего действия инсулина, ИФР-1 и ИПП на АЦ, установлена структурно-функциональная организация АЦ сигнального механизма в клетке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза. Основные этапы работы состояли в исследовании: - действия пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации in vitro и in vivo ; - участия примембранной цАМФ- ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма действия инсулиноподобных пептидов ; - звень ев АЦ сигнального механизма (от рецептора до эффектор н ых систем ) ; - рол и АЦ сигнального механизма , как в регуляции клеточных процессов , так и его функционального применения в условиях патологии ; Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки П роведено исследование in vitro динамики во времени АЦ активирующего эффекта инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска при концентрации пептидов 10 -8 М и для сравнения эпидермального ростового фактора (ЭФР) , пептида не инсулиновой природы, обладающего рецептором тирозинкиназного типа (Никольский и др., 1987) . П оказано, что в мембранной фракции скелетных мышц крыс наибол ьшее выраженное активирующ ее действие исследованных пептидов на АЦ проявляется через 2.5 мин . Активирующий АЦ эффект инсулина составляет + 23 6 % . Эффект менее выражен при действии ИФР-1 ( + 20 1 % ) , ЭФР ( + 18 6 % ) и ИПП моллюск а +12 4 % (Рис. 1 ; Таблица 1). Рис. 1. Концентрация пептидов – 10 -8 М Активация АЦ пептидами (в%) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны ( р<0.05 ) Таблица 1 . Динамика во времени действия ИФР-1 на а ктивность АЦ в мембранной фракции скелетных мыш ц крыс Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) 2.5 мин 5 мин 10 мин Без ИФР-1 71.2±4.8 (10 0 % ) 85.11±3.3 (10 0 % ) 101.20±9.24 (10 0 % ) + ИФР-1 214.31±12.1 (30 1 % ) 136.16±5.2 (16 0 % ) 96.14±4.6 (9 5 % ) Примечание: В скобках - базальная активность АЦ (без воздействий) , принятая за 10 0 % и активность АЦ ( в % ) при действии ИФР-1 В мембранной фракции культуры куриных миобластов п оказано ( рис. 2 ) , что стимулирующий АЦ эффект инсулина через 2.5 мин составляет + 25 6 % , по сравнению с базальной активностью, принятой за 10 0 % и имеет с ход ство с данным и , полученным и на мембранной фракции скелетных мышц крыс (+ 2 3 6 % ) (рис. 1 ) . В тканях моллюска A.cygnea , ИПП, выделенный из висцеральных органов этого моллюск а , оказывает наиболее выраженное активирующее действие на АЦ (+42 2 % ), по сравнению с ЭФР (+22 1 % ), ИФР-1 (+16 9 % ) и инсулином (+13 3 % ) ( Рис . 3 ; Таблица 2). Следует отметить, что активирующий АЦ эффект исследуемых пептидов в наибольшей степени проявляется через 2,5 мин, через 5 мин снижается, а через 10 минут практически отсутствует (Таблица 2; Рис . 3). Рис. 2. Концентрация инсулина 10 -8 М. Различия достоверны ( р<0.05 ) Таблица 2. Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции гладких мыш ц моллюска Воздействи я Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка ) 2.5 мин 5 мин 10 мин Без ИФР-1 110.21±10.8 (10 0 % ) 125.31±9.3 (10 0 % ) 106.04±6.6 (10 0 % ) + ИФР-1 259.92±11.4 (26 9 % ) 229.31±5.2 (18 3 % ) 103.81±5.8 (9 8 % ) Примечание – как в таблице 1. Таким образом, в мембранных фракциях, выделенных из мышечных тканей исследуемых животных и культуры клеток куриных миобластов, наблюдается закономерность проявления эффекта пептидов в зависимости от времени действия. Инсулин, ИФР-1, ИПП и ЭФР оказывают активирующее действие на АЦ в течение 2,5 и 5 мин с максимальным эффектом через 2.5 мин . АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов видоспецифичен. В скелетных мышцах крыс ряд эффективности пептидов по их влиянию на АЦ имеет следующий порядок: инсулин > ИФР-1 > ЭФР > ИПП, а в мышечных тканях моллюска - ИПП > ЭФР > ИФР-1 > инсулин. Рис. 3. Концентрация пептидов – 10 -8 М Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны ( р<0.05 ) В лияние in vivo разных доз и нсулина на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных в разные временные сроки Обнаружив в опытах in vitro стимулирующее влияние пептидов инсулинового суперсемейства на активность АЦ , мы исследова ли влияние инсулина, основного представителя инсулинового суперсемейства, на активность АЦ в разных дозах и при разном времени действия в условиях in vivo . Э ксперименты проведены на фракц иях мышечных мембран крыс , куриных эмбрионов и моллюск ов после введения инсулина (внутрибрюшинно или внутрижелточно) в дозах 0.05 нг/г- 10 нг /г веса тела (вес крысы или куриного эмбриона, вес моллюска без раковины). Доза, вводимого in vivo инсулина рассчитывалась с учетом концентрации инсулина, используемой в опытах in vitro . Основанием для выбора дозы служили данные литературы и результаты наших опытов in vitro . Было п оказано, что в скелетных мышцах крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина ( + 2 2 2 % ) выявляется через 5 мин после введения гормона ( 1 нг/г ) , а через 15 мин он снижается почти в три раза ( 6 7 % ) (Рис. 4 ) . При более высокой доз е инсулина ( 10 нг/г ) , стимулирующий АЦ эффект гормона через 5 мин выражен слабее ( + 12 4 % ), а через 15 мин отсутствовал . Рис. 4. Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью АЦ, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны ( р<0.05 ) В экспериментах in vivo в мембранных фракциях мышц куриных эмбрионов разного возраста обнаружен АЦ активирующий эффект инсулина . У 10-дневных куриных эмбрионов он выявлялся уже через 5 мин , более четко выражен через 15 мин , а через 30 мин не проявлялся (рис. 5 ). Рис. 5. Различия достоверны ( р<0.05) У 17-дневных куриных эмбрионов выявлено дозозависимое активирующее действие инсулина на активность АЦ через 5 минут (Рис. 6 ), которое ослабевает через 15 и 30 мин после введения гормона. Рис. 6. Различия достоверны ( р<0.05 ) При введении моллюскам инсулина ( 0. 5 нг /г и 5.0 нг/г ) активность АЦ возрастала через 5 мин после введения гормона на + 4 9 % и + 38 1 % , соответственно, по сравнению с контролем, принятым за 10 0 % . Через 20 мин влияние гормона (0.5 нг/г) на активность АЦ снижае тся (+ 2 2 % ) и практически исчезает ( + 6 % ) через 40 мин (Рис. 7 ). При введении инсулина ( 5 нг/г ) моллюскам АЦ стимулирующий эффект гормона через 20 мин составлял + 11 0 % , а через 40 мин + 5 0 % (рис. 7 ). Рис. 7. Светлые столбики - базальная активность АЦ. Заштрихованные столбики - инсулин-стимулированная активность АЦ при разных дозах гормона. Различия достоверны ( р<0.05 ) Из полученных нами данных следует, что отчетливо е влияни е инсулина на активность АЦ в мышечных мембранах моллюска (Р ис. 7 ) выявляется при более высок ой доз е инсулина , чем у млекопитающих и птиц . Это можно объяснить тем, что у моллюска A.cygnea рецепторы к инсулину не обнаружены (Лейбуш, Чистякова, 2003), а эффект инсулина может реализовываться через ИФР-1 - подобные рецепторы или рецепторы ИПП моллюска, которые способны опосредовать активирующее влияние инсулина на АЦ (Шпаков и др., 2005). Следует отметить, что проявление АЦ стимулирующего влияния инсулина и инсулиноподобных пептидов во времени имеет сходств о в опытах in vitro и in vivo . АЦ активирующий э ффект пептидов отчетливо выявляется при коротких сроках влияния пептида (2,5 и 5 мин ) при физиологических концентрациях (10 -9 -10 -8 М), с увеличением времени действия эффект пептидов ослабевает или отсутствует. АЦ а ктивирующий эффект инсулина, ИФР - 1 и ИПП при разных концентрациях в условиях in vitro Установив оптимальное время действия пептидов инсулинового суперсемейства , при котором происходит активация АЦС (2.5 мин ) , необходимо было выявить при каких концентрациях АЦ стимулирующий эффект пептидов наиболее выражен. В разных тканях стимулирующий эффект пептидов инсулиновой природы осуществляется через специфичн ые рецепторы , отличающиеся по сродств у к пептиду в гомологичных и негомологичных пептиду тканях. Проведено исследование влияния инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска и ЭФР в течение 2.5 мин при разных концентрациях (10 -1 2 -10 -6 М) в мембранных фракциях крыс, кур, моллюсков, а также во фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов . В мембранной фракции скелетных мышц крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина, ИФР-1, ИПП обнаруживается при концентрациях - 10 -11 -10 -7 М (Рис. 8 ). Наиболее выраженный АЦ стимулирующий эффект составляет: для инсулина +25 0 % при 10 -8 М; для ИФР-1 +9 1 % при 10 -9 М; для ИПП +11 1 % при 10 -8 М; для ЭФР +19 0 % при 10 -10 М. (Рис. 8 ). Можно отметить, что в диапазоне концентраций 10 -10 -10 -7 М наиболее четко выражен активирующий АЦ эффект инсулина, эффекты других исследованных пептидов инсулиновой природы проявлялись слабее. АЦ стимулирующий эффект ЭФР проявлялся при более низких концентрациях (10 -11 -10 -10 М). Рис. 8. Базальная активность АЦ принята за 100%. Время действия пептидов 2.5 мин Таблица 3 . Вл ияние in vitro разных концентраций инсулина на активност ь АЦ в о фракциях мышечных мембран куриных эмбрионов разного возраста и цыплят Объекты (возраст) 10-сут Э мбрионы 13-сут Э мбрионы 16-сут Эмбрионы Цыплята 3 -сут Воздействия Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка ) В скобках – Активность АЦ (в % ) в присутствии инсулина, по отношению к б азальн ой активности, принят ой за 10 0 % . Без Инсулина 14.02 1.10 (10 0 % ) 3.90 0.45 (10 0 % ) 2.01 0.09 (10 0 % ) 8.52 0.41 (10 0 % ) +инсулин 10 -11 М 16.34 1.35 (11 7 % ) 4.21 0.34 (10 8 % ) 4.81 0.46 (23 9 % ) 10.11 0.55 (11 9 % ) + инсулин 10 -10 М 39.14 1.93 (27 9 % ) 10.33 0.89 (26 5 % ) 5.28 0.30 (26 3 % ) 11.24 0.48 (13 2 % ) + инсулин 10 -9 М 48.25 2.21 (34 4 % ) 15.92 1.24 (40 8 % ) 10.24 0.62 (50 9 % ) 14.54 0.82 (17 1 % ) + инсулин 10 -8 М 19.87 1.44 (14 2 % ) 9.84 0.56 (25 2 % ) 9.92 0.47 (49 4 % ) 19.55 1.13 (23 8 % ) + инсулин 10 -7 М 17.13 0.98 (12 2 % ) 4.93 0.45 (12 6 % ) 7.51 0.33 (37 4 % ) 22.21 1.37 (26 1 % ) + инсулин 10 -6 М 17.90 1.12 (12 8 % ) 5.12 0.21 (13 1 % ) 1.95 0.22 (9 7 % ) 24.39 1.62 (28 6 % ) Изучение АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства и ЭФР в онтогенезе позволило выявить следующие факты. Наиболее выраженный АЦ активирующий эффект инсулина (10 -11 М-10 -6 М обнаруживается у куриных эмбрионов (10, 13, 16 суток) и цыплят (3 суток) при концентрации гормона 10 -9 М , и составляет у 10-суточных эмбрионов + 2 4 4 % , у 13-суточных + 30 8 % , у 16-суточных + 40 9 % (Таблица 3) , а у 3 -х суточных цыплят (+18 6 % ) при более высокой концентрации 10 -6 М , что может быть связано с переходом эмбрионов в постэмбриональный период, когда процессы роста и дифференцировки заканчиваются. П роведен н ы е нами исследования действия инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов (4-й день развития) показали, что наибольший АЦ стимулирующий эффект инсулина (+ 35 2 % ) выявляется при концентрации 10 -9 М, а ИФР - 1 (+ 28 9 % ) при концентрации 10 -10 М ( данные в диссертации) . В мембранной фракции мыш ц моллюска АЦ стимулирующий эффект инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР выявляется при концентрациях - 10 -11 -10 - 8 М (Рис. 9 ). Инсули н и ИФР-1 оказывают наиболее выраженное стимулирующ ее действие на активность АЦ при концентрации 10 -8 М (+ 6 3 % и + 5 4 % , соответственно ) , а ИПП и ЭФР при 10 -9 М (+ 41 5 % и + 2 2 3 % , соответственно ) . Таким образом, определен диапазон концентраций, при которых проявляется АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов. Следует отметить видоспецифичность действия пептидов. Действие ИПП, выделенного из висцеральных ганглиев моллюска A . cygnea , является более эффективным в ткани моллюска и менее эффективным в тканях позвоночных. Рис. 9. Базальная активность АЦ принята за 100%. Время действия пептидов – 2.5 мин. Участ ие ц - АМФ-зависим ой ФДЭ в механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства Уровень цАМФ в клетке зависит не только от АЦ – ферме нта, осуществляющего его синтез , но и от фосфодиэстеразы (ФДЭ) - фермента, обеспечивающего его деградацию . И сследова н а динамик а во времени активност и примембранной формы цАМФ- ФДЭ во фракции скелетных мышц кур . Эта изоформа ФДЭ локализована на внутренней стороне мембраны и способна активироваться инсулином (Houslay, 1985). Нами показано, что активность примембранной цАМФ-ФДЭ не изменяется через 2.5 и 5.0 мин после действия инсулина , увеличивается на +11 5 % через 10 мин и на +17 9 % через 20 мин , по сравнению с базально й активностью фермента , принятой за 10 0 % (Таблица 4). Таблица 4. Влияние инсулина (10 -8 М) на а ктивность примембранной цАМФ-ФДЭ в скелетных мышц кур в зависимости от времени Воздействия Активность цАМФ- ФДЭ (нмоль АМФ/мин/мг белка) 2.5 мин 5.0 мин 10.0 мин 20.0 мин Без инсулина 3.37±0.5 (10 0 % ) 3.70±0.33 (10 0 % ) 3.56±0.61 (10 0 % ) 3.21±0.28 (10 0 % ) + инсулин 3.06±0.21 (9 1 % ) 4.07±0.18 (11 0 % ) 7.65±0.23 (21 5 % ) 8.95±0.44 (27 9 % ) Примечание: в скобках представлена активность цАМФ-ФДЭ (в % ) в присутствии инсулина и базальная активность фермента, принятая за 10 0 % При ис следовании действия разных концентраций инсулина (10 -9 М-10 -7 М) обнаружено, что наиболее выраженное действие гормона ( + 11 5 % ) на активность цАМФ-ФДЭ выявляется через 10 мин при концентрации 10 -8 М ( данные в диссертации). Соотношение активности систем АЦ-цАМФ и цАМФ-ФДЭ в реализации действия инсулин а на клетку является важным моментом в понимании внутриклеточных механизмов функционирования пептидов инсулиновой природы . При активации АЦ гормонами скорость синтеза цАМФ начинает превышать скорость его деградации. Повышение уровня цАМФ приводит к активации мишени его действия - ПКА. Сродство ПКА к цАМФ в 100-1000 раз больше, чем у ФДЭ. При усилении синтеза цАМФ происходит сначала насыщение цАМФ-регуляторных центров ПКА, и лишь затем гидролиз цАМФ с участием ФДЭ. Исходя из представленных нами данных, активирующие эффекты инсулина на АЦ и цАМФ- ФДЭ четко разделены во времени. АЦ активирующий эффект инсулина проявляется через 2.5 и 5 мин и отсутствует через 10 мин . Между тем, цАМФ-ФДЭ активируется инсулином только через 10 минут инкубации с гормоном. Таким образом, а ктивация цАМФ- ФДЭ наступает лишь тогда, когда цАМФ как вторичный посредник выполнит свою функцию, достигнет порогового уровня и осуществит сво е активирующее действие на ПКА , а затем и на эффекторные системы (Ткачук, 1983) , что согласуется с нашими данными о действии инсулина на активность АЦ и цАМФ-ФДЭ и данными литературы . В связи с э т и м основное внимание будет уделено исследованию АЦ С , участвующей в осуществлении регуляторн о го действи я пептидов инсулинового суперсемейства на клеточные процессы. И спользование антиинсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина Для доказательства АЦ стимулирующего действие инсулина, а не других пептидных гормонов, не относящихся к гормонам инсулинового суперсемейства, была использована анти-инсулиновая сыворотка (АИС) , выработанная в лаборатории на инсулин млекопитающих, которая нейтрализует действие инсулина и, к ак установлено нами подавляет стимулирующее действие инсулина на АЦ. При добавлении нормальной сыворотки ( без инсулина ) к фракции скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска, активирующий АЦ эффект инсулина составляет + 6 8 % у крыс и + 4 1 % у моллюсков . При использовании АИС стимулирующий АЦ эффект инсулина отсутствует у крыс (+ 7 % ) и моллюсков (- 5 % ) (Табл. 5 ). Полученные данные свидетельствуют о том, что обнаруженное нами активирующее действие инсулина на АЦ в мышечных тканях исследуемых объектов осуществляется именно инсулином и является специфичным при действии этого гормона. Таблица 5 . Нейтрализация АЦ стимулирующего эффекта инсулина в мембранных фракциях скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска в присутствии антиинсулиновой сыворотк и В оздействи я Активность АЦ (пкмол ь цАМФ/мин/мг белка) Нормальная сыворотка Анти - инсулиновая сыворотка Гладкие мышцы моллюска Anodonta cygnea Без инсулина 111.18 6.13 (10 0 % ) 148.29 4.31 (1 0 0 % ) Инсулин 10 -8 М 156.76 8.54* (14 1 % ) 158.67 8.16 (10 7 % ) Скелетные мышцы крысы Без инсулина 97.34 4.58 (10 0 % ) 115.82 6.49 (1 0 0 % ) Инсулин 10 -8 М 163.49 6.17* (16 8 % ) 110.03 7.12 (9 5 % ) Примечание: приведены данные из трех независимых эксперимент ов , повторенных три раза . Значения представлены в виде среднего арифметического с учетом ошибки среднего. Различия достоверны (р < 0.05 (*). В скобках – активность АЦ в % . Б азальная активность принята за 10 0 % . Следующая часть работы посвящена расшифровке структурно-функциональной организации механизма АЦ активирующего действия инсулина и ИФР-1. В этой части работы мы поэтапно исследовали звенья, которые могут быть вовле чены в реализацию действия инсулиноподобных пептидов , начиная от рецептора и заканчивая эффекторными системами, которые являются конечным звеном реализации сигнала. Участие рецептора тирозинкиназного типа в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового супер семе й ства Для доказательства участия рецептора тирозинкиназного типа, характерного для пептидов инсулинового суперсемейства в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулиновой природы , использовали селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ – тирфостин 47 и генистеин, которые блокируют тирозинкиназную функцию рецептора инсулина и других пептидов инсулиновой природы . Ингибиторы инкубиров али с пробами в течение 1 5 мин после чего в пробу добавляли пептиды (время действия 2.5 мин ) при концентрации , вызывающей максимальный АЦ стимулирующий эффект . Влияние этих ингибиторов на активирующие АЦ эффект ы инсулина, ИФР-1, ЭФР и для сравнения на эффект изопротеренола (в случае позвоночных) и серотонина (в случае беспозвоночных) , которы е также действу ю т активирующим образом на АЦ, но через рецептор серпантинного типа, изучали in vitro в о фракции мембранны х препарат ов мышечной ткани крыс , культуры куриных миобластов, моллюсков. У крыс в присутствии т ирфостин а 47 (1.25-5.0 мкМ) активирующи й АЦ эффект пептидов снижал ся при действии инсулина до 5 0 % , при ИФР-1 до 6 5 % , при ЭФР до 5 0 % по отношению к максимальному эффекту пептидов, принятому за 10 0 % (Рис. 1 0 ). В присутствии генистеина (1.25-5.0 мкМ) снижение АЦ стимулирующих эффектов всех используемых пептидов у крыс было более выражено. Эффект инсулина снижался до 4 0 % , эффект ИФР-1 до 1 0 % , эффект ЭФР – до 1 8 % (рис. 1 1 ). В тоже время у крыс стимулирующий эффект изопротеренола на АЦ (10 -6 М) практически не изменялся в присутствии тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ). В культуре клеток 4-х суточных куриных миобластов тирфостин 47 (Рис. 12) и генистеин (данные представлены в диссертации) ингибировали АЦ активирующий эффект инсулина до 43 % и 38 % , соответственно. Однако, активирующее действие изопротеренола на АЦ в присутствии ингибиторов тирозинкиназ (тирфостина 47 и генистеина) не изменялось ( р < 0.05 ). Это свидетельствует о том, что классические рецепторы серпантинного типа не участвуют в механизме действия пептидов инсулиновой природы. Рис. 10. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100% ) в присутствии тирфостина 47 Рис. 11. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100% ) в присутствии генистеина Рис. 12. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта инсулина и изопротеренола на АЦ (принятого за 100% ) в присутствии тирфостина 47 Рис. 13. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и серотонина на АЦ (принятого за 100% ) Рис. 14. По оси абсцисс – концентрация генистеина в мкМ; по оси ординат - снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и серотонина (принятого за 100% ) в присутствии генистеина У моллюсков наиболее выраженное снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов наблюдалось в присутствии тирфостина 47 (2.5 мкМ). Эффект инсулина уменьшался до 2 0 % , эффект ЭФР до 30-3 5 % . ( Рис . 1 3). В присутствии генистеина АЦ стимулирующий эффект пептидов снижался до 2 5 % в случае инсулина (1.25 мкМ генистеин), и до 50-7 5 % в случае ЭФР (5 мкМ генистеин) (рис. 1 4). Необходимо подчеркнуть, что у моллюсков A . cygnea активность АЦ увеличивается не в присутствии изопротеренол а , а в присутствии серотонин а , реализующ его свое действие также через рецепторы серпантинного типа ( Pertseva et al ., 19 92 ). Исследование действия ингибиторов тирозинкиназ - тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ ) на стимулирующий АЦ эффект серотонина в мембранной фракции мышечных тканей моллюсков не выявило изменений в действии этого биогенного амина на активность АЦ. Таким образом, в мембранной фракции крыс , моллюсков и культуры клеток куриных миобластов с тимулирующее влияние исследуемых пептидов на АЦ снижалось в присутствии тирфостина 47 и генистеина в диапазоне концентраций - 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ во всех исследуемых объектах (Рис. 1 0- 1 4 ). С тимулирующ ее действие изопротеренола (крысы, куры) или серотонина (моллюски) на АЦ, реализуем ое через рецепторы серпантинного типа не изменялись в присутствии тирфостина 47 или генистеина в исследуемых объектах (см. Рис. 1 0 -1 4 ) . Можно заключить, что в мышечной ткани млекопитающих (крысы), птиц (куры) , культуре клеток куриных миобластов и в мышцах моллюсков активирующее действие инсулина, ИФР-1, ЭФР на АЦ осуществляется с участием рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для действия этих пептидов. (Pertseva et al., 1996; Plesneva et al., 2003 ) . Участие G-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина Для доказательства участия G-белков в действии инсулина на активность АЦ был применен широко распространенный подход, в котором используется набор гуаниновых нуклеотидов, способных в разной степени либо стимулировать Г ТФ-азную активность G-белков в присутствии ГТФ и его аналогов - ГТФ гS, ГИДФ и тем самым активировать АЦ , либо ингибировать ГТФ-азную активность G-белка в присутствии ГДФ вS . Было исследовано влияние ГТФ и ряда его негидролизуемых аналогов на активность АЦ в присутствии и отсутствии гормона (Табл . 6 ) . Таблица 6 . Влияние гуаниновых нуклеотидов в отсутстви и и присутствии инсулина на активность АЦ во фракции мышечных мембран крысы и моллюска Воздействия Животные Крыса Моллюск Активность АЦ ( % ) Контроль 100 ±1.0 1 % 100 ±1. 3 % Инсулин (10 -8 М) 222 ± 1. 3 % (+12 2 % ) 186 ± 1. 8 % (+8 6 % ) ГТФ гS (10 -5 М) 242 ± 1. 4 % (+14 2 % ) 470 ± 9. 4 % (+37 0 % ) ГИДФ (10 -5 М) 236 ± 1. 8 % (+13 6 % ) 269 ± 4. 9 % (+16 9 % ) ГТФ (10 -5 М) 135 ± 1.0 5 % (+3 5 % ) 163 ± 5. 1 % (+6 3 % ) ГДФ вS (10 -5 М) 9 5 ± 1 . 2 % (- 5 % ) 92 ± 2. 4 % (- 8 % ) Инсулин + ГТФ гS 473 ± 2. 5 % ( + 37 3 % ) [ 1 0 9 % ] 7 26 ± 20. 3 % (+62 6 % ) [ 17 0 % ] Инсулин + ГИДФ 399 ± 8 . 2 % (+29 9 % ) [ 4 1 % ] 441 ± 12 . 3 % (+ 34 1 % ) [ 8 6 % ] Инсулин + ГТФ 277 ± 10. 1 % (+17 7 % ) [ 2 0 % ] 279 ± 8. 4 % (+17 9 % ) [3 0 % ] Инсулин + ГДФ вS 102 ± 5. 4 % (+ 2 % ) [-1 7 % ] 105 ± 4. 3 % (+ 5 % ) [-8 6 % ] Примечание: в круглых скобках – активирующий АЦ эффект используемых агентов в % по отношению к базальной активности, принятой за 10 0 % . В квадратных скобках – потенцирование эффекта гормона в присутствии гуаниновых нуклеотидов в % . Согласно представленным данным, ГТФ гS, ГИДФ, ГТФ стимулируют активность АЦ в мышечных мембранах крыс и моллюсков. При совместном действии инсулина и гуаниновых нуклеотидов происходит усиление (потенцирование) эффекта гормона по сравнению с аддитивным эффектом гормона и гуаниновых нуклеотидов, действующих раздельно - в присутствии ГТФ гS, ГИДФ и ГТФ на +10 9 % , +4 1 % и +2 0 % у крыс и на +17 0 % , 8 6 % и 3 0 % у моллюсков (табл. 6). ГДФ вS же напротив снижает АЦ стимулирующий эффект инсулина как в мышцах крыс, так и моллюсков. Потенцирование эффекта инсулина в присутствии ГТФ гS, ГИДФ, ГТФ и отсутствие потенцирующего эффекта в присутствии ГДФ вS свидетельствует о вовлеченности Gs-белков в АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства. Таблица 7 . Влияние коклюшного и холерного токсинов на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска A . cygnea Активность АЦ (пкмоль цАМФ/ мин/ мг белка ) Воздействия Скелетные мышцы крысы Гладкие мышцы моллюска Без КТ +КТ Без КТ +КТ Б ез пептидов 39.7±3.4 48.5±2.0 63.2±4.1 69.1±9,6 (10 0 % ) (1 0 0 % ) (10 0 % ) (10 0 % ) И нсулин 67 . 9 ± 3 . 6 48. 2 ± 2 . 7 200 . 5 ±1 4 .4 7 4 . 2 ±7. 6 10 -9 М (1 7 1 % ) (9 9 % ) ( 31 7 % ) ( 1 0 8 % ) И ФР-1 5 7. 4 ± 2 . 1 4 3 . 1 ± 1 . 6 139 . 2 ±1 2 .4 7 6 . 8 ±7. 3 10 -9 М (1 4 5 % ) ( 8 9 % ) ( 22 0 % ) ( 1 1 1 % ) Без ХТ +ХТ Без ХТ +ХТ Б ез пептидов 39.6±2.6 79.7±2.7 47.4±3.0 94.3±5.6 (10 0 % ) (10 0 % ) (10 0 % ) ( 1 0 0 % ) Инсулин 69.3±2.8 105.8±7.4 151.7±9.8 134.0±7.5 10 -9 М (17 5 % ) ( 13 3 % ) (32 0 % ) ( 14 2 % ) ИФР-1 56.7±4.2 106.2±6.5 100.0±5.4 122.6±8.8 10 -9 М (14 3 % ) ( 13 3 % ) (21 0 % ) ( 13 0 % ) Примечание: В скобках – активность АЦ в % . А ктивность АЦ без пептидов принята за 10 0 % . Для выяснения типов G белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 были использованы бактериальные токсины (коклюшный и холерный), которые модифицируют б- субъединицы Gi и Gs белков. Коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование б i -субъединицы Gi белка, что ведет к потере его функциональной активности (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Известно, что вг- димер Gi белка обладает собственной регуляторной способностью и может стимулировать активность ФИ-3- К. Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к блокированию АЦ стимулирующего эффекта, как инсулина, так и ИФР-1 (таблица 7), что можно объяснить нарушением диссоциации гетеротримерного Gi белка на бi- субъединицу и вг димер в условиях действия коклюшного токсина. Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулин ом или ИФР-l стимуляцию активности ФИ-3-К, реализуемую через вг- зависимый механизм, тормозит активацию АЦ. Влияние холерн ого токсин а на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности бs- субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с этим обработка мембран холерным токсином может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через Gs белок (Milligan, 1988; Reisine, 1990) . Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ и снижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента (таблица 7 ) , что полностью согласуются с о сведениями литературы и указыва е т на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с участием инсулина и ли ИФР-1. Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов , указывает на участие как Gi , так и Gs белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-l. Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 Для выяснения участия ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был использован специфический ингибитор этого фермента - вортманнин. Инкубация мышечных мембран крысы и моллюска с вортманнином (10 -9 – 10 -7 М) несколько снижает базальную активность АЦ (таблиц а 8 ) . В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ. Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижа ет ся в зависимости от концентрации ингибитора ( 10 -9 – 10 -7 М ) . И нгибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10 -7 М (таблица 8 ). Установленные факты свидетельствуют о б участии ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов. Таблица 8 . Влияние вортманнина (10 – 9 М– 10 – 7 М) на стимуляцию ИФР-1 (10 – 8 М) и инсулином (10 – 8 М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мышц моллюска Anodonta cygnea Активность АЦ (пкмоль цАМФ/ мин/ мг белка) объекты Крысы Моллюски в оздействия б ез пептида ИФР-l и нсулин без пептида ИФР-l инсулин б ез ворманнина 21 ± 1.6 38.2 ± 1.0 * 41.4 ± 2.3 * 17.8 ± 1.0 41.1 ± 2.6 * 24.5 ± 1.0 * + в ортманнин 10 – 9 М 17.9±2.0 9.4±1.3 9.7±1.4 15.8±2.0 14.6±1.3 14.2±0.4 + в ортманнин 10 – 8 М 16.5±2.3 8.6±1.3 8.4±1.3 14.6±2.3 1 3 . 9 ± 0 . 8 1 1 . 6 ± 1 . 0 + в ортманнин 10 – 7 М 13.2±1.9 6.3±0.9 6.8±0.8 14.3±0.9 13.8 ± 1.8 7 . 4 ± 0 . 5 Примечание: значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов ( р<0.05 ), отмечены звездочкой. Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнина на АЦ стимулирующ ие эффект ы инсулина и ИФР-1 был и использован ы изопротеренол и серотонин , гормон ы неродственн ы е пептидам инсулиновой природы и реализующ и е действие через рецептор серпантинного типа , не связанн ый с ФИ-3-К сигнальной системой. Результаты этих опытов показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему (данные приведены в диссертации ). Этот факт указывает на участи е ФИ-3-К в , обнаруженным нами, АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1. Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства Для доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокатор ПКС – кальфостин (Yoing et al., 2005) . В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял + 10 1 % и + 7 3 % у крыс , и + 7 8 % и + 8 6 % у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ , принятой за 10 0 % . Как обнаружено нами, кальфостин (10 -10 – 10 -8 М) блокировал АЦ стимулирующ ие эффект ы инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мышц крысы и моллюска . Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10 -8 М . В присутствии кальфостина (10 -8 М) АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижался на 4 6 % и 3 2 % у крыс, и на 4 7 % и 5 0 % у моллюсков, соответственно, по отношению к мак с имальному АЦ стимулирующему эффекту пепт идов, принятому за 10 0 % (данные в диссертации). Для идентификации изоформы ПКС , участвующей в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали моноклональные антитела к ПКС ж, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы. Таблица 9 . Влияние антител к ПКС ж на АЦ активирующий эффект ИФР-1 (10 -8 М) и инсулина (10 -8 М) в мышечных мембранах крысы и моллюска A.cygnea Активность АЦ ( Объекты Крысы Моллюски Воздейтсвия Без пептида ИФР-1 Инсулин Без пептида ИФР-1 инсулин без антител 100±4.4 253±17 247±24 100±12 307±24 255±18 АТ 1:1000 104±9.5 102±14 108±16 166±25 251±21 254±12 АТ 1:100 98±8.2 95±12 103±5 163±18 327±27 237±20 АТ 1:10 94±6.8 68±3.6 88±8 145±5 403±33 238±25 Активность АЦ выражена в % к контрольным величинам, принятым за 10 0 % . Антитела к ПКС ж почти полностью блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР- 1 в мышечных мембранах крыс (таблица 9 ) . Таким образом, использование моноклональных антител к ПКС ж показало, что эта изоформа фермента вовлечена в стимулирующее действие инсулина и ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс. Между тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего действия на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР- 1 . Мышцы моллюска обладают иным набором ПКС (Sossin et а1., 1996) и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКС е из мозга позвоночных. Таким образом, настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных . Этот механизм имеет принципиально сходн ую структурно-функциональн ую организаци ю в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП- компетентных АЦ сигнальных систем. Он может быть представлен в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок ( вг- димер) фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза . АЦ является генератором внутриклеточного посредника – цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы “A” передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам. В плане изучения функциональной роли , обнаруженного нами , АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было исследовано его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз. Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы Для изучения митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства мы использовали фибробластоподобную культуру клеток Swiss 3T3, любезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Проведена функциональная характеристика АЦ системы в культуре Swiss 3 T 3 клеток. Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток Таблица 1 0 . Функциональные свойства АЦ С культуры Swiss3T3 клеток Воздействия Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) Стимулирующий АЦ эффект в % Базальная 30.59 ±1.41 10 0 % (базальная) NaF 10 -2 М 178.91 ±4.15 58 5 % (+48 5 % ) форсколин 10 -5 М 99.26 ±3.21 32 4 % (+22 4 % ) ГИДФ 10 -6 М 111.20 ±3.48 36 4 % (+26 4 % ) ГТФ 10 -5 М 82.98 ±2.92 27 1 % (+17 1 % ) ЭФР 10 -9 М 168.31 ±4.75 55 0 % (+45 0 % ) ИФР-1 10 -9 М 102.14 ±3.34 33 4 % (+22 4 % ) Инсулин 10 -9 М 74.89 ±2.11 24 5 % (+14 5 % ) В скобках – активирующий АЦ эффект агентов гормональной и негормональной природы (в % ), по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 10 0 % , стимулируется классическими негормональными активаторами АЦ - NaF, форсколином, ГИДФ, ГТФ, а также инсулином, ИФР-1 и ЭФР (таблица 10). Проведенные нами исследования показали, что в культуре Swiss 3T3 присутствует АЦС с функциональными свойствами, близкими к АЦС других клеток и тканей позвоночных, которая способна к восприятию внеклеточных сигналов различной природы. Оценив функциональные свойства АЦ сигнальной системы культуры Swiss3T3 клеток, была исследована способность инсулина, ИФР-1 и ЭФР индуцировать в культуре клеток Swiss3T3 митогенный эффект, оцениваемый по включению [ 14 C]-тимидина в ДНК (Рис. 1 5-1). Показано, что инсулин (1000 нг/мл), ИФР 1 (50 нг/мл) и ЭФР (10 нг/мл) стимулировали синтез ДНК (прирост от 10 0 % до 25 0 % ). Исследуемые пептиды в тех же концентрациях оказывали стимулирующее влияние (2,5 мин ) на активность АЦ. (Рис. 1 5-2). Для подтверждения участия цАМФ в реализации митогенного эффекта был использован его дибутириловый аналог цАМФ, обладающий способностью проникать в клетку. Этот аналог, взятый при низких концентрациях (10 -12 -10 -9 М), вызывал четкий митогенный эффект, по величине даже превосходящий аналогичный эффект ЭФР и ИФР-1. Эффект оценивали по включению [ 14 C]-тимидина в ДНК (Рис. 1 5-3). Представленные экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу (Перцева, 2000 ) об участии АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства и, продуцируемого им цАМФ, в реализации митоге н ных процессов . Участие аденилатциклазного сигнального механизм в антиапоптотическом действии инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1 Нами подобрана модель апоптоза, включающая клеточные линии, с разной степенью устойчивости к условиям, вызывающим незапрограммированную гибель клеток (апоптоз). В экспериментах использовали культуру клеток E1A+cHa-ras , обладающую высокой проапоптотической чувствительностью к удалению ростовых факторов и действию ДНК-повреждающих агентов («впадают в апоптоз») (Bulavin et al., 1999) и культуру клеток Е1 А+Е1В с высоко й устойчив остью как к действию ДНК повреждающих агентов, так и к удалению ростовых факторов из среды («не впадают в апоптоз»). В клеточных культур ах была охарактеризована чувствительность АЦС к действию инсулина и ИФР-1 (Таблица 1 1 ). Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки культуры линий Е1А+сНа- r as и Е1А+Е1В способны отвечать на действие инсулина и ИФР-1 (10 -8 М) активацией АЦ, что указывает на наличие в них рецепторов инсулина и ИФР-1, а также АЦС, чувствительной к этим пептидам. Клетки сохраняют чувствительность АЦС к инсулину и ИФР-1 как в среде с 1 0 % сывороткой, так и в среде с 0. 5 % сывороткой. Согласно данным литературы пептиды инсулинового суперсемейства – инсулин и ИФР-1, а также цАМФ, образующийся в результате активации АЦ, способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки. Показано, что инсулин (10 -7 М), ИФР-1 (10 -8 М) и дибутирил-цАМФ (10 -9 М) оказывают ингибирующее влияние на апоптоз, вызванный удалением ростовых факторов сыворотки, в культуре клеток E1A+cHa-ras (Плеснева, 2003). Оценка антиапоптотического эффекта инсулина, ИФР-1 и дибутирил-цАМФ проводилась на клетках культуры E1A+cHa-ras с использованием метода клоногенной выживаемости, который относится к числу наиболее чувствительных способов тестирования антиапоптотического действия агентов. Обнаружено, что культивирование Таблица 1 1 . Влияние инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в грубой мембранной фракции культур клеток E 1 A + cHa - ras и E 1 A + E 1 B Условия Активность АЦ (пмоль цАМФ /мин/мг белка ) In vitro E1A+cHa-ras (клетк и , впадающи е в апоптоз) Е1А+Е1В (клет ки , не впадающи е в апоптоз) Контроль Инсулин ИФР-1 Контроль Инсулин ИФР-1 Среда + 1 0 % с ыворотка 33.9 3.4 (100) 48.1 2.1 (142) 56.4 1.3 (166) 4.9 0.5 (100) 14.3 1.2 (292) 17.6 1 (359) Среда + 0. 5 % сыворот к а (апоптоз) 95,9 3,4 (100) 137,0 9,0 (143) 181,6 8,2 (189) 26.7 0.5 (100) 61.4 1.2 (230) 86.3 2.1 (323) In vivo E1A+cHa-ras (клет ки , впадающи е в апоптоз) Е1А+Е1В ( клет ки , не впадающи е в апоптоз) Контроль Инсулин ИФР-1 Контроль Инсулин ИФР-1 Среда + 1 0 % сыворотка 4.1 0.29 (100) 6.0 0.9 (146) 12.2 0.5 (297) 5.2 0.3 (100) 8.5 1.0 (163) 11.4 1.3 (219) Среда + 0. 5 % сыворотк а (апоптоз) 11.0 1.2 (100) 17.2 1.2 (156) 24.8 2.2 (225) 5.8 0.6 (100) 10.0 0.7 (172) 13.6 0.6 (234) Примечание. В опытах in vitro гормоны (10 -8 М) добавляли прямо в пробу, содержащую грубую мембранную фракцию клеток, для определения активности АЦ. В ремя инкубации 2.5 мин . В опытах in vivo инсулин (10 -7 М) и ИФР-1 (10 -8 М) добавляли к культурам клеток, время инкубации 5 мин . Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 10 0 % . Апоптоз индуцировали удалением ростовых факторов сыворотки из среды . Трансформантов на среде без ростовых факторов уменьшает число живых клеток, способных дать потомство в клональном посеве минимум в 2 раза, по сравнению с клетками, культивиру е мыми в нормальных условиях (среда+1 0 % сыворотки). Показано, что только 4 3 % культуры клеток «выживают» в условиях, когда клетки впадают в апоптоз (среда +0. 5 % сыворотки) по сравнению с контролем (среда+1 0 % сыворотка, принято за 10 0 % ). В экспериментах, когда в среду с 0, 5 % сывороткой был добавлен инсулин, ИФР-1 или дибутирил-цАМФ в указанных выше концентрациях, способность клеток давать жизнеспособное потомство восстанавливалась до значений, составляющих около 7 0 % (для инсулина: 7 7 % , для ИФР-1: 6 7 % , для дибутирил цАМФ: 6 6 % по сравнению с контролем, принятым за 10 0 % ). Таким образом, эксперименты показали способность инсулина и ИФР-1 через, обнаруженный нами, АЦ сигнальный механизм и продуцируемый им цАМФ, оказывать митогенное и антиапоптотическое действие в клеточных культурах. Исследования подтверждают участие АЦ сигнального механизма в реализации антиапоптотического действия пептидов инсулинового ряда - инсулина и ИФР-1. Функциональное состояние АЦ сигнального механизма действия инсулина при сахарном диабете На основе концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний (Перцева, 2004) исследовано функционирование АЦ сигнального механизма при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете 1-го и 2-го типа у позвоночных (крысы) и диабетоподобном состоянии у беспозвоночных (моллюски). Диабет вызывали однократным в ведение м ( i . p .) стрептозотоцина ( 80 нг /г веса животного) . На 30-сут стрептозотоцинового диабета обнаружена гипергликемия в крови крыс , в 4, 2 раза превышающая уровень глюкозы у контрольных крыс . Впервые выявлено увеличение уровня глюкозы в гемолимфе моллюсков (в 2, 5 раза) на 2-е и 4-е сутки развития диабетоподобного состояния. Обнаружено при диабете снижение АЦ-стимулирующего эффекта инсулина и его потенцирования гуаниновыми нуклеотидами у крыс и у моллюсков . Инсулин независимый диабет (2-го типа) вызывали введением новорожденным крысятам (1-2 сут) однократно стрептозотоцина (80 нг/г веса животного). При этом типе диабета также возникают нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина. АЦ стимулирующий эффект инсулина и потенцирование не проявляется. На основании полученных данных выявлены функциональные дефекты в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при диабете, в мышцах крыс и моллюсков, затрагивающие дистальные звенья АЦ сигнального механизма на уровне каталитического компонента – АЦ, Gs-белка и его сопряжения с АЦ. Заключение Настоящее и сследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР- 1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и бе с позвон о чных животных. Эти оригинальные данные расширяют современные представления о круге сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства и способствуют формированию нового позитивного взгляда на вовлеченность АЦ сигнального механизма в действие гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы, осуществляемого через рецепторы тирозинкиназного типа. До наших исследований в литературе существовала точка зрения об участии АЦ сигнального механизма только в действии гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа . Важными представляются доказательства, полученные в работе, о распространенности обнаруженного АЦ сигнального механизма действия изученных пептидов в тканях как позвоночных, так и беспозвоночных животных. Установлена принципиально сходная структ у рно-функциональная организация инсулин-, ИФР- 1 - и ИПП - компетентной АЦ сигнальн ых систем. На современном этапе наших исследований она представлена в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок ( вг -димер ) фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза . АЦ сигнальный механизм охватывает стадии от рецептора тирозинкиназного типа до фермента – АЦ , являющейся генератором вторичного внутриклеточного посредника – цАМФ. Образовавшийся цАМФ способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы “A” передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам. Открытый нами АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулиновой природы по своей структурно-функциональной организации наряду со сходством, обладает и существенными отличиями от известных до сих пор гормональных АЦ сигнальных систем . Эти отличия сводятся : - во-первых, к участию в одном АЦ сигнальном механизме сразу дух типов гетеротримерных G-белков (Gs и Gi), которые обычно вовлечены в разные сигнальные системы ; - во-вторых, к взаимодействию рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для гормонов инсулиновой группы с Gi-белком, выступающим в качестве донора вг субъединиц, а не бi- субъединицы как во многих других сигнальных системах. - в- третьих , к больш е му числу, составляющих его блоков (шесть компонентов, во всяком случае) по сравнению с трехкомпонентным АЦ сигнальным механизмом действия биогенных аминов (рецептор серпантинного типа Gs или Gi -белок АЦ); За период, прошедший со времени обнаружения нами АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства ( Plesneva et.al., 1994 ; Kuznetsova et al., 1999; Plesneva et al., 2001 ) в литературе появились данные, касающиеся отдельных его сигнальных блоков, подтверждающие установленную нами структурно-функциональную организацию этого АЦ сигнального механизма. Так показано, что рецепторы инсулина и ИФР-1 функционально сопряжены с Gi-белком ( Ku e mmerle, Murthy, 2001; Dupont et al., 2003; Kreuzer et al., 2004). Также установлено участие ФИ-3-К и ПКС и связь их с продукцией цАМФ в ряде сигнальных путей действия пептидо в инсулинового суперсемейства ( Dessauer, Nguyen, 2005; Nguyen, Dessauer, 2005). В плане изучения спектра функций, обнаруженного нами АЦ сигнальн ого механизм а, генериру ющего цАМФ , установлено его участ ие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы , как клеточный рост ( стимул яция) (Плеснева и др. 1 999) и апоптоз (ингибирование) (Плеснева и др., 2003) , способствующие в итоге выживанию клетки . Таким образом, в ыдвинутая нами гипотеза (Перцева, 2001) о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на жизненно-важные клеточные процессы – клеточный рост, апоптоз нашла подтверждение в наших исследованиях (Плеснева и др., 1999; Плеснева и др., 2003) . Основываясь на эволюционном подходе Л.А. Орбели ко всем изучаемым явлениям ( Орбели, 1958) мы использовали комплекс методов эволюционн ой физиологии применительно к изучению биохимических систем организма . Исследование включало несколько аспектов : а) изучение трех эволюционно родственных пептидов инсулинового суперсемейства – инсулина и ИФР-1 позвоночных, а также ИПП беспозвоночных (моллюска Anodonta cygnea); б) изучение действия этих пептидов на АЦС в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные – млекопитающие и птицы; а также беспозвоночные – моллюск Anodonta cygnea ) ; в) часть исследований (птицы) проведена в онтогенез е ; г) исследованы АЦ сигнальные механизмы действия пептидов инсулинового суперсемейства и выявлены функциональные нарушения в них при патологии – сахарном диабете. В плане развиваемой в лаборатории концепции (Перцева, Шпаков, 2004) молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний проведено исследование функциональных нарушений в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, возникающих при сахарном диабете. Впервые обнаружены дефекты в этом сигнальном механизме на уровне каталитического компонента – АЦ, Gs-белка и его сопряжения с АЦ , а также ослабление регуляторных метаболических эффектов гормона у крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом 1-го и 2-го типов. Использование эволюционного подхода позволило выявить не только существование АЦ сигнального механизма действия ряда пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных, но и обнаружить принципиальное сходство в его структурно-функциональной организации, свидетельствующее об эволюционной консервативности этой сигнальной системы Выводы 1. В мышечных тканях представителей позвоночных (крысы) и беспозвоночных (моллюски) животных обнаружена чувствительная к влиянию пептидов инсулиноподобн ого суперсемейства АЦС. И нсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска оказывают ГТФ-зависим ое активирующее действие на АЦ . АДФ-рибозилирование бактериальными токсинами позволило выявить участие G-белков как ингибирующего (Gi-белок), так и стимулирующего (Gs-белок) типов в АЦ сигнальном механизме действия изученных пептидов . 2. Устан овлено участие рецептор ов т и розинкиназного типа, в активирующе м действи и инсулин а , ИФР-1 и ИПП моллюска на АЦС , ведущ е м к образовани ю внутриклеточного пос редника – цАМФ. Показано, что селективны е ингибитор ы рецепторных тирозинкиназ – тирфостин 47 и генистеин, блокир уют активирующе е действи е исследуемых пепт идов на АЦ в мыш цах позвоночных и беспозвоночных. 3. В ыявлено участие фосфатидилинозитол-3 киназ ы в АЦ сигнально м механизм е действия пептидов инсулинового суперсемейства , на что указывает блокирование активирующего влияния пептидов инсулиновой природы на АЦ в присутствии с пецифическ ого ингибитор ФИ-3-К – вортманнин а. 4. Установлено участие протеинкиназ ы ПКС идентифицированной с помощью моноклональных антител в реализации АЦ стимулирующего действия пептидов инсулинового суперсемейства в мышечных тканях позвоночных. 5. На основе совокупности полученных данных, сделан вывод о существовании в клетках позвоночных , ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР 1 , включающ его сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок( г) фосфатидилинозитол-3-киназа ПКС Gs-белок аденилатциклаза . Сходный механизм обнаружен в мышцах моллюска Anodonta cygnea, отличающийся только изоформой ПКС. 6. Э кспериментально подтверждена гипотеза о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия и нсулин а и ИФР-1 на фундаментальные клеточны е процесс ы . Показана их способность стимулировать клеточный рост (в культуре клеток Swiss3T3) и ингибировать апоптоз (в культуре клеток Е1А+сНа-ras) . 7. Обнаружение АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства природы в тканях-мишенях у представителей как позвоночных, так и беспозвоночных животных, а также сходство в его структурно-функциональной организации указывает на консервативность этого сигнального механизма в эволюции. 8 . При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) у человека, а также у экспериментальных животных (позвоночных и беспозвоночных ) при стрептозотоциновой модели диабет а обнаружены функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, локализованные в основном на уровне G -белка и его сопряжения с АЦ. Публикации по теме диссертации 1. Pertseva M.N. , Kuznetsova L.A. , Plesneva S.A. , Grishin A.V. , Panchenko V.P. в-agonist-induced inhibitory-guanine-nucleotide regulatory protein coupling to adenylate in mollusk Anodonta cygnea foot muscle sarcolemma // Eur. J. Biochem. Pharmacol. 199 2 . V. 210 . P. 2 7 9 - 2 8 6 . 2 . Перцева М.Н. , Плеснева С.А. , Шпаков А.О. , Русаков Ю.И. , Кузнецова Л.А. Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов // Доклады Академии наук . 1995. T. 342. №3 . C. 410-412. 3 . Pertseva M.N. , Plesneva S.A. , Shpakov A.O. , Rusakov Yu.I., Kuznetsova L.A. Involvement of adenylyl cyclase signalling system in the action of insulin and mollusc insulin-like peptide // Comp. Biochem. Physiol. 1995. V. 112. P. 689-695. 4 . Перцева М.Н. , Шпаков А.О. , Плеснева С.А. Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов // Журн. э вол . биохим . физиол . 1996. T. 32. №3 . C. 318-340. 5 . Pertseva M.N. , Plesneva S.A. , Kuznetsova L.A. , Shpakov A.O. , Derkach K.V. On the tyrosine kinase mechanism of the novel effect of insulin and insulin-like growth factor-I: Stimulation of adenylyl cyclase system in muscle tissues // Biochem. Pharmacol. 1996. V. 52. № 1 2. P. 1867 – 1874 . 6 . Плеснева С.А. , Баркан Р.С. , Решетникова Г.Ф. , Кузнецова Л.А. , Перцева М.Н. Аденилатциклазный сигнальный механизм в митогенном действии инсулина, инсулиноподобного и эпидермального факторов роста // Доклады Академии наук, 1999. Т . 368. №6 . С . 833 -838. 7 . Kuznetsova L., Plesneva S., Derjabina N., Omeljaniuk E., Pertseva M.N. On the mechanism of relaxin action: the involvement of adenylyl cyclase signalling system // Regulatory Peptides. 1999. V. 80. P. 33-39. 8 . Плеснева С.А. , Кузнецова Л.А. , Омельянюк Е.В. , Шпаков А.О. , Перцева М.Н. Аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина // Журн. эвол . б иохим . физиол . 2000. T. 36. № 6 . C. 562-568. 9 . Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы А и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea // Журн. э вол. б иох им . ф изиол. 2001 . Т . 37. №5 . С . 395 -400. 1 0 . Plesneva S.A. , Shpakov A.O. , Kuznetsova L.A. , Pertseva M.N. A dual role of protein kinase "C" in insulin signal transduction via adenylyl cyclase signaling system in muscle tissues of vertebrates and invertebrates // Biochem. Pharmacol. 2001. V. 61. № 1 0. P. 1277 – 1291 . 1 1 . Плеснева С.А. , Шпаков А.О. , Кузнецова Л.А. , Перцева М.Н. Роль протеинкиназы С в регуляции процесса трансдукции инсулинового сигнала через аденилатциклазный сигнальный механизм // Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова . 2001. T 87. № 8 . C. 1106 – 1117 . 1 2 . Шпаков А.О. , Плеснева С.А. , Кузнецова Л.А. , Перцева М.Н. Исследование функциональной организации нового – аденилатциклазного сигнального механизма действия инсулина // Биохимия. 2002. T. 67. №3 . C. 403-412. 1 3 . Pertseva M.N. , Shpakov A.O. , Plesneva S.A. , Kuznetsova L.A. A novel view on the mechanisms of action of insulin and other insulin superfamily peptides: involvement of adenylyl cyclase signaling system // Comp. Biochem. Physiol. 2003. V. 134. № 1 . P. 11-36. 14 . Шпаков А.О. , Гурьянов И.А. , Власова Е.Н. , Корольков В.И. , Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. , Власов Г.П. , Перцева М.Н. Ингибирование синтетическими катионными пептидами стимулирующего влияния гормонов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Доклады Академии на ук . 2003. T. 389. № 1 . C. 127-130. 15 . Шпаков А.О. , Плеснева С.А. , Кузнецова Л.А. , Леонтьева Е.А. Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система в клеточной культуре фибробластов мыши линии L // Журн. эвол . биохим . физиол . 2003. T. 39. № 5 . C. 438-444. 1 6 . Плеснева С.А. , Поспелова Т.В. , Кузнецова Л.А. , Быкова Т.В. , Шпаков А.О. , Перцева М.Н. Новая инсулинкомпетентная аденилатциклазная сигнальная система как возможный механизм антиапоптотического действия инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1 // Д оклады Академии наук . 2003. T. 393. №4 . C. 551-553. 17 . Kuznetsova L., S hpakov A., Rusakov Yu., Plesneva S., Bondareva V., Pertseva M. Comparative study of biological activity of insulin of lower vertebrates in the novel adenylyl cyclase test-system // Regulatory Peptides. 2003. V. 116. № 1 -3. P. 81-86. 18 . Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. , Шпаков А.О. , Шарова Т.С. Стимулирующее влияние инсулина и эпидермального фактора роста на активность протеинкиназы А, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гликогенсинтетазы в скелетных мышцах кур в эмбриогенезе // Журн. эвол. б иохим . физиол . . 2004. T. 40. № 4 . C. 325-333. 1 9 . Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. , Шпаков А.О. , Бондарева В.М. , Перцева М.Н. Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система скелетных мышц крысы в условиях введения инсулина in vivo и при инсулиновой недостаточности, вызванной стрептозотоциновым диабетом // Журн. эвол . биохим . физиол . 2004. T. 40. № 4 . C. 334-343. 20 . Шпаков А.О. , Шипилов В.Н. , Кузнецова Л.А. , Бондарева В.М. , Плеснева С.А. , Перцева М.Н. Реактивность аденилатциклазной сигнальной системы нервных ганглиев моллюска Anodonta cygnea к серотонину и адренергическим агонистам // Нейрохимия. 2004. T. 21. № 3 . C. 190-197. 21 . Шпаков А.О. , Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. , Перцева М.Н. О вовлеченности фосфатидилинозитол-3-киназы и протеинкиназы С в аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина в мышечных тканях крыс и моллюсков // Бюл . э кспер . б иол . м ед . 2004. T. 138. № 1 0. C. 420-423. 22 . Шпаков А.О. , Гурьянов И.А. , Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. , Корольков В.И. , Перцева М.Н. , Власов Г.П. Использование С-концевых пептидов -субъединиц G-белков для исследования их функционального сопряжения с рецепторами биогенных аминов в тканях крыс и моллюсков // Биол . мембраны. 2004. T. 21. № 6 . C. 441-450. 23 . Шпаков А.О. , Шипилов В.Н. , Бондарева В.М. , Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. , Русаков Ю.И. , Перцева М.Н. Регуляторное действие родственных инсулину нейропептидов моллюска Anodonta cygnea на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Нейрохимия. 2005. T. 22. № 1 . C. 28-37. 24 . Шпаков А.О. , Шипилов В.Н. , Гурьянов И.А. , Кузнецова Л.А. , Бондарева В.М. , Плеснева С.А. , Перцева М.Н. Молекулярные механизмы регуляторного действия биогенных аминов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы в нервных ганглиях моллюска Anodonta cygnea // Доклады Академии наук . 2005. T. 401. № 6 . C. 829-832. 25 . Шпаков А.О. , Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. , Гурьянов И.А. , Перцева М.Н. Молекулярные причины изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы сердечной мышцы к биогенным аминам при экспериментальном стрептозотоциновом диабете // Цитология. 2005. T. 47. № 6 . C. 540-548. 26 . Шпаков А.О. , Кузнецова Л.А. , Плеснева С.А. , Перцева М.Н. Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете // Бюл . э кспер . б иол . мед. 2005. Т . 140. №9 . С . 286 -290.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Газета - уникальная вещь: и скатерть, и мухобойка, и вентилятор, и туалетная бумага, и шапка, и зонтик, и даже почитать можно.
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, реферат по медицине и здоровью "Аденилатциклазный сигнальный механизм", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru