Реферат: Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе - текст реферата. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Реферат

Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Банк рефератов / Медицина и здоровье

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Реферат
Язык реферата: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Архив Zip, 127 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникального реферата

Узнайте стоимость написания уникальной работы

Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе Введение В последние годы в качестве альтернативы радион уклидам в иммуноанализе нашли широкое применение неизотопные метки, в т ом числе ферменты , хемилю минесцентные соединения , флуорофоры и коллоидные частицы . При менение неизотопных маркеров затрудняется необходимостью синтезиров ать, очищать и охарактеризовывать белковые конъюгаты в случае каждого о пределяемого вещества. Ранее система авидин – биотин нашла широкое примен ение при локализации, обнаружении и очистке белков . Оказалось, что эта система не менее полезна и в иммуноанализе. В работе детально рассмотрены два подхода, с помощью которых авидин-биот иновая реакция может быть использована в двухцентровом иммуноанализе. В обоих подходах применяли препараты иммобилизованных и биотинилирова нных антител. Эти препараты отбирали по принципу распознавания различн ых эпитопов антигена. В первом подходе сначала иммобилизованные антите ла вводили в реакцию с исследуемым образцом и биотинилированными антит елами. Затем добавляли конъюгат авиди н а или стрептавиди н а с ферментом или с хемилюми н е сцентным маркером. Во втором подходе вместо белкового конъюгата добавл яли свободный авидин или стрептавидин и затем добавляли биотинилирова нный фермент. В обоих случаях определение осуществляли спектрофотомет рически или по интенсивности люминесценции после добавления соответст вующих субстратов. В качестве биотинилированных ферментов-маркеров пр именяли пероксидазу хрена, АВ + -зависимые ферменты , АТР-зависимые ферменты , пенициллиназу и щелочную фосфатазу . Рассмотрим некоторые результаты, п олученные с помощью этих двух подходов. Основные принципы Уже давно известно, что для обеспечения сильного взаимодействия биотина с гликопротеином яичного белка авидином требуется только уреиднос кольцо витамина . Следовательно, карбоксильную груп пу остатка валериановой кислоты в биотине можно модифицировать и таким образом получать активные биотинилированные производные . В частности, биотин, связанный с мак ромолекулой , сохраняет с пособность связываться с активным центром авидина. Поскольку молекула авидина состоит из четырех идентичных субъединиц, то с ней могут быть од новременно связаны остатки биотина двух различных биотинилированных б елков . Эти свойства авиди и-биотинового комплекса широко используются для решения различных зад ач, в том числе 1) обнаружения, локализации и очистки белков, углеводов и ну клеиновых кислот; 2) разработки методов двухцентрового иммунометрическ ого анализа; 3) картирования эпигонов в гибридомной технологии. Практическое применение авидин-биотиновой системы ограничивается выс окой основностью авидина и наличием в его молекуле углеводных остатков, что в свою оч ередь обусловливает высокий уровень неспецифического связывания. Боле е 20 лет назад в бактериях Streptomyces avidinii был обнаружен другой биотинсвязы ваю щ ий белок, названный стреп тавидином . Подобно авиди ну яичного белка, стрептавидин также образует очень прочный и специфиче ский нековалент-ный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъединиц. Каждая субъединица содержит один биотинсвязываюший центр. В отличие от авидина стрептавидин негликозилирова н и имеет нейтральную p h . Авидин и стрептавидин сильно различаются по аминокислотн ому составу, хотя оба богаты остатками триптофана . Некоторые свойства этих белков приведены в табл. 1. Таблица 1. Некоторые характеристики авидина и с трептавидина Характеристики Авидин Стрептавиднн t Молекулярная масса 67 000 60 000 Мол. масса субъединицы 15 600 14 600 . K d (авидин-биоти новый комплекс), М -10 -15 -10 -15 Е ш (1 мг/мл) 1,54 3,4 Связывание биотина на субъединицу 1 1 Олигосахариды на субъединицу 1 0 Манноэа на субъединнцу 4-5 0 GlcNAc* ва субъединицу 3 0 Иэоэлектрическая точка, pi >10 <7 Остатки аминокислот на субъеднн ицу Триптофавы 4 8 Тироэины 1 6 Лиэины 9 4 Аргинины 8 4 Аспарагин + аспарагиновая кислота 15 12 Глутамин + глутаминовая кислота 10 9 Амиды 16 - Стрептавидин можно использовать вместо авидина или в дополнение к нему в авидин-биотиновых системах. Он коммерчески дос тупен, и, подобно авидину, его можно очищать с помощью аффинной хроматогр афии на иминобиотиновой колонке . Поскольку бактериальный белок имеет нейтральную изоэлек трическую точку и не содержит углеводных остатков, то для него нехаракте рны н еспецифические взаимод ействия, свойственные авидину яичного белка. Хотя неспецифическое связ ывание авидина можно свести к минимуму с помощью химических или каких-либо других методов, стрептавиднн и его конъюгаты я вляются наилучшим решением этой проблемы. В лаборатории для разработки различных методов иммуноана лиза применя ются имеющиеся в продаже конъюгаты авидина с ферментами, а также синтезирова нные препараты биотинилированных белк ов и стрептавидина с хемилюмин е сцентной меткой. Полу чение биотинилированных белк ов Антитела и ферменты биотинилировали по ранее оп исанной методике с испол ьзованием N - г идроксисукцинимидных эфиров п роизводных биотина с различной длиной алкильной цепи. Структура реаген тов и схема реакции представлены на рис. 2. Качество полученных препаратов пр оверяли с помощью ELISA или двухцентрового иммунометриче ского анализа. Получение белк ов с хемилюм инесцентной меткой Стрептавиднн или очищенные фракции IgG моноклонал ьны х антител обрабатывали сукцинимидн ыми производными аминобутилэтилизолюминола . Полученные конъюгаты о чищали гельфильтрацией на сефадексе G - 2 5 и хра нили при -20 °С . Методы анализа При разработке методов двухце н трового имму н ометрического анализа белков применяли меченые кон ъюгаты авидина или стрептавидина либо стрептавидин как связующее зве н о между биотинилированными а нтителами и биотинилирова н н ым ферментом. Величину сигнала в ферментативной реакции как в том, так и в другом случае определяли спектрофотометрически или по интенсивности л юминесценции в зависимости от типа используемой метки. Авидин и стрептавидин в качестве меченых зондов Принципиальная схема этого метода представлена на рис. 3. Исследуе мый образец инкубировали с высокоаффинными моноклональными антителам и, ковалентно связанными с полистирольными шариками диаметром 6 ,5 мм . Затем в с истему вводили биотинилированные антитела к другим эпитопам антигена. По завершении иммунологической реакции добавляли авидин, меченный фер ментом, или содержащий хемилюминесцентную метку стрептавидин. В зависи мости от используемого маркера измерение осуществляли спектрофотомет рически или по интенсивности люминесценции. Определение с помощью спектрофотометрии Для из учения влияния длины цепи между молекулой биотина и монокло н аль н ым антителом на чувствительность анализа применяли систе му, в которой избыток моноклональных аити- hGH антител был ковалент н о связан с полистирольными гранулами. Гранулы ин кубировали со стандартными препаратами или с пробами и с двумя различны ми препаратами биотинилированных моноклональных hGH - антите л , различающимися длиной цепи, соединяющей молекулу биотина и антитела . По завершении реакции антиген – антитело в сис тему добавляли конъюгатавидин – щелочная фосфатаза и смесь инкубир овали в течение 30 мин . Растворы упаривали в токе воздуха, добавляли субстрат м-нитрофенилфосфат и смесь инкубировали 45 мин при 37°С. Образовавшийся продукт ферментативной реакции определяли по поглощению при 405 нм. Эксперимента льные данные представляли в виде графика зависимости логарифма оптиче ской плотности от логарифма концентрации hGH . П олученные данные свидетельствуют, что более крутой наклон наблюдается в случае антител клона № 6 9 , биот инилированных с помощью N - г идроксисукцин имидного эфира с длинной цепью CONH 3 -). Чувствительность анализа , достигаемая с длинно цепочечными биотинилированными антителами клона № 69, сравнима с чувствительност ью определения гормона с помощью обычного конкурентного РИА. Определение путем измерен ия интен сивности люминесценции Кроме спектрофотометрии для определения связан ных биотинилированных антител мы также использовали измерение интенси вности люминесценции . На этом рисунке символом L обозначен хемилюминесцентный маркер , а моноклональные антитела к hGH биотинилировали через длинную цепочку CONH 3 -). В данном методе моноклональные ан титела , связанные с полис тирольными гранулами, инкубировали со стандартами или пробами и с длинн оцепочечными производными биотинилированных антител анти- hGH пр и комнатной температуре. По завершении иммунологической реакции добавляли стрептавид и н, несущий хемилюминесцентную метк у. Через 30 мин гранулы промывали. Интенсивность свечения связанной метк и регистрировали при щелочном рН с использованием системы микроперокс идаза – пероксид водорода . Калибровочный график зависимости логарифма интенсивност и хемилюминесценции от л огарифма концентрации hGH представлен на рис. 5 . Предел обнаружения гормона с помощью данного метода составляет 3 -10 - 5 м.ед. hGH /л или 1,5 пг в пробирке, а раб очий диапазон – от 4 – 10 - 5 до 10 - 1 м.ед. hGH /л. Коэффициент вариации анализа внутри серии равен 5,5 % . Нормальный уровень hGH и его динамические измене ния при искусственной стимуляции у здоровых пациентов определяли с пом ощью обычного РИА и двухцентрового иммунометрического анализа . Коэффициент корреляции обоих м етодов составил 0,96 . Кроме т ого, метод ИХМА позволил определить уровень базальной секреции и слабые изменения концентрации hGH в плазме крови у больных гипопитуитаризмом в течение цирка дного цикла, что невозможно сделать с помощью обычного РИА. Полученные данные показывают, что л юминесцентный ИХМА в 10 раз более чувствителен, чем существующие радио- и и ммуноферментные методы определения hGH . Стрептавидин и биотинилированные ферменты как зонды Принципиальная последовательность операций в этом методе представлена на рис 7. Связанн ые с носителем и биотинилированные моноклональные антитела инкубировали с пробой или стандарт ами. По завершении иммунологической реакции последовательно добавляли или стрептавидин и биотинилированную щелочную фосфатазу , или ацетилированный авидин и биоти нилированную глюкозо- 6 -фосфат дегидрогеназу . В зависим ости от фермента величину сигнала регистрировали спектрофотометричес ки или по интенсивности люминесценции. Примером такого подхода может сл ужить определение hGH с помощью иммобилизованных н а полистирольных гранулах моноклональных анти тел ан ти- hGH и модифицированных длинноцепочечным производным биотина антител анти- hGH клона № 6 9 . Гранулы отмывали и последовательн о инкубировали при комнатной температуре со стрептавидином и длинноцепочечным производным би отинилированной щелочной фосфатазы . После промывки добавляли раствор j - н итрофенилфрсфата . Образование продукта регистрировали по поглощению при 405 н м. Калибровочный график для определения hGH , полученный с помощью био тинилированной щелочной фосфатазы и спектрофотометрического определ ения продукта ферментативной реакции Чувствительность анализа сравнима с чувствительностью методов типа РИА. Коэффиц иент вариации внутри серии при анализе смешанной плазмы с концентрацие й hGH 7.6 – 1 0" 3 м.ед./л равен 6, 5 % , а коэффициент вариации между сериями при анализе того же п ула – 7, 4 % . На рис. 9 приведены результаты анализа образцов плазмы, взятых у па циентов, подвергнутых тесту « н а стимуляцию секреции гормона роста . Полученные данные свидетельствую т, что с помощью этого метода можно регистрировать и количественно опред елять реакцию в тестах по стимуляции и подавлению синтеза hGH , проводимых для оценки ре зервов гормона в гипофизе. Все применявшиеся в этом методе реагенты усто йчивы в течение по меньшей мере двух лет. Диапазон калибровочной кривой позволяет определять в о дном анализе высокие и низкие концентрации hGH . Заключение Сравнительные данные для двух методов двухцент рового иммунометрического анализа hGH приведены в табл. 2. Чувствительность использован ного для сравнения метода РИА составляла 0,6 – 1 0 - 3 м.ед./л, а рабочий диапазон – 10 - 3 м.ед./л.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Просвещение распространилось настолько, что ныне можно читать, писать и публиковать, оставаясь неграмотным.
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, реферат по медицине и здоровью "Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru