Реферат: Методы измерения ионных токов - текст реферата. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Реферат

Методы измерения ионных токов

Банк рефератов / Биология

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Реферат
Язык реферата: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Архив Zip, 260 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникального реферата

Узнайте стоимость написания уникальной работы

8 МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕР АЦИИ НИЖЕГОРОДСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ . Н.И.ЛОБАЧЕВСКОГО БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА БИОФИЗИКИ Реферат на тему Методы измерения ионных токов Выполнил студент 4 курса гр .144-7 Савин А.В . Нижний Новгород 1998 1. Метод фиксации потенциала Для изучения потенциалзависим ых мембранных каналов применяется метод фиксации потенциала . В данном методе используют электронную систему с обратной связью , которая обеспечивает автоматическое поддержание мембранного потенциала . Разность потенциалов по разные стороны мембраны фиксирую т на определенном уровне , при этом мембранный потенциал можно ступенчато изменят на строго определенную величину . Такой метод позволяет измерить ионные токи , протекающие сквозь мембрану через каналы , которые активируются при изменении потенциала . В соответ с твии с законом Ома , если напряжение на мембране постоянно , изменения тока однозначно связанные с изменениями проводимости . В свою очередь , мы можем фиксировать мембранный потенциал на разном уровне и измерять возникающие при этом токи . Если же использоват ь растворы с различенным ионным составом , и препараты , избирательно блокирующие тот или иной канал , то можно будет изучать поведение различных ионных каналов , через которые протекают измеряемые нами токи . Технически фиксация потенциала осуществляется следу ю щим образом . При помощи усилителя-регулятора внутриклеточный потенциал сравнивают с управляющим потенциалом (см . рис .1). Любое отклонение мембранного потенциала от управляющего усиливается и на выходе усилителя возникает управляющий ток . Этот ток течет че р ез электроды , расположенные по разные стороны мембраны в таком направлении , что мембранный потенциал вновь становится равным управляющему . Такое автоматическое согласование происходит за долю миллисекунды после того , как задается ступенчатый управляющий потенциал . Когда в ответ на такую ступенчатую деполяризацию открываются натриевые (или какие-либо другие ) каналы , соответствующие ионы входят в аксон по электрохимическому градиенту и переносят с собой электрические заряды . Эти входящие заряды стремятся сдвинуть мембранный потенциал в положительном направлении , однако малейшее отклонение от управляющего потенциала немедленно комп е нсируется в результате удаления из клеток избыточных зарядов с помощью усилителя-регулятора . При этом записывается тот ток , который подается усилителем для поддержания мембранного потенциала на необходимом уровне , и этот ток в точности равен ионному току, протекающему через мембрану. Метод фиксации напряжения , или кламп метод , позволяет измерять ионный поток при перемещении иона по контролируемому градиенту электрохимического потенциала и получать информацию об электрической проводимости мембраны и её пассивной проницаемости в отношении интересующего нас иона . Этот метод используется для измерения вольт-амперных характеристик растительных клеток , что позволяет получить информацию о тонких механизмах функционирования различных систем мембранного тра н спорта. 2. Метод пэтч-кламп Метод пэтч-кламп ( patch - clamp ) позволяет осуществлять локальную (точечную ) фиксацию мембранного потенциала и измерять токи через одиночные ионные каналы . На данный момент этот метод является мощным средством для исследования биомембран . Метод позволяет : 1. проводить многие исследования в рамках классических электрофизиологических подходов. 2. регистрировать токи и потенциалы от клеток очень малых размеров (3-10 мкм ) 3. регистрировать токи одиноч ных каналов амплитудой порядка пикоампер 4. исследовать действие лекарственных препаратов при быстром подведении их как к наружной , так и к внутренней стороне мембраны Метод пэтч-кламп был введен в исследовательскую практику Неером и Сакманом , когда в 1 976 году ими была опубликована статья в журнале “ Nature ” , которая называлась “Токи через одиночные каналы в мембране волокна денервированной мышцы лягушки” . Это открыло путь для изучения на молекулярном уровне электрических свойств мембран и регуляции разл ичных транспортных процессов. Основой для создания метода послужило обнаружение факта , что при определённых условиях клеточная мембрана формирует очень плотный контакт с поверхностью кончика стеклянного микроэлектрода . При небольшом разрежении , создаваем ом внутри пипетки , между стеклом и мембранным фрагментом возникает контакт , имеющий гигаомное сопротивление . В результате образуется электрически изолированный участок мембраны , и шум регистрирующего сигнала уменьшается на несколько порядков . Так как конт а кт мембраны со стеклом очень прочен , то находящийся под кончиком электрода фрагмент надо либо изолировать от клетки , либо разрушить , и таким образом проникнуть внутрь клетки . Существует несколько вариантов метода пэтч-кламп (рис .2). Наиболее близким к естественным условиям является вариант измерения ионных токов на прикреплённой , но неповрежденной ( cell - attached ) клетке , по скольку исследуемый участок г 99зэмембраны не отделяется от клетки и не нарушается его связь с цитоплазмой . Измерение на целой клетке при разрушении мембраны в кончике микропипетки ( whole - cell ) позволяет заменять ионный состав цитоплазмы и изучать на диализ ированных таким образом клетках ионные токи в режиме фиксации напряжения. Ионные токи через небольшие мембранные фрагменты измеряют с помощью пипеток , у которых диаметр кончика соизмерим с размерами фрагментов . Сопротивление пипеток , заполненных раство ром 150 ммоль /л KCl и погруженных в раствор такой же концентрации , приблизительно линейно зависит от площади отверстия кончика и варьирует от 1 до 5 МОм . Площадь отверстия кончика пипетки можно варьировать от 1 до 8 мкм 2, изменяя степень нагрева спирали н а последнем этапе вытягивания . Эти размеры находятся на грани разрешения светового микроскопа . Наружную поверхность покрывают гидрофобным материалом – силгардовой резиной . Особенностью незастывшего силгарда является его способность растекаться тонкой плен к ой по поверхности стекла на несколько миллиметров , покрывая при этом и кончик микроэлектрода . Так как высокоомные контакты образуются только с чистым стеклом , эту пленку необходимо удалять только оплавлением микроэлектродов . При работе на мембранных фрагм е нтах используется несколько типов пипеток . Пипетки из тугоплавкого стекла получили в практике большее применение , чем пипетки из мягкого стекла . Первые имеют больше удельное сопротивление , чем мягкое стекло с более низкой температурой плавления . Вследст вие этого вклад шума , обусловленного ёмкостью связи через стеклянную стенку в пипетках с тугоплавким стеклом меньше . Пипетки из толстостенного тугоплавкого стекла имеют ряд преимуществ . Во-первых , при большей толщине стенок шунтирующая проводимость чере з стекло меньше . Во-вторых , на некоторых препаратах гигаомные контакты более стабильны и величина их образования значительно больше , чем для аналогичных тонкостенных пипеток Табл .1. Геометрические параметры кончиков пипеток , изготавливаемых из различных типов ст . капилляров Материал , из которого изготовлены пипетки Площадь отверстиямкм 2 Площадь кольца , мкм 2 Ширина кольца, мкм Угол конуса, град Тонкостенные капилляры CEE BEE – мягкое стекло 1.0 0,79 0,19 24 Кимакс – твердое боросиликатное стекло 1,2 0,82 0,2 20 Алюминиевое – твердое алюмосиликатное стекло 1,0 0,9 0,22 25 Тонкостенные капилляры Jencons – твердое боросиликатное стекло 1,01 1,71 0,39 10 Мембранные фрагменты При работе с некоторыми клеткам и , например , с изолированными с помощью ферментов клетками миокарда , гигаомные контакты иногда формируются спонтанно , при прикосновении кончиком пипетки к поверхности клетки высокоомный контакт формируется без подсасывания . В этом случае не наблюдается ни к аких деформаций клеточных мембраны , и площадь мембранного фрагмента можно оценить по значению сопротивления пипетки до образования контакта . Но в большинстве случаев контакт формируется только при небольшом разрежении , создаваемом внутри пипетки . При этом поверхность мембраны деформируется , часть её втягивается внутрь пипетки на 2-3 мкм , принимая Q -образную форму . Когда фрагмент изолируют механическим отведением кончика пипетки от поверхности клетки , его У-образная форма практически не изменяется . При дальн ейшем подсасывании образуется сферический пузырёк . Если известна удельная ёмкость мембраны (как правило , она составляет 1 мкф /см 2), площадь фрагмента можно оценить по величине его ёмкости ; обычно площадь варьирует от 2 до 25 мкм 2. Электронные схемы для пэ тч-кламп регистрации Электронная схема пэтч-кламп регистрации должна иметь такие параметры , чтобы было возможным зарегистрировать передвижение всего лишь нескольких сотен элементарных электрических зарядов через малый участок клеточной мембраны . При мак симально сниженных собственных шумах измерительной аппаратуры , токи через одиночные электровозбудимые Са-каналы , можно зарегистрировать только в нефизиологических условиях – например , при использовании растворов , содержащих Ва 2+ вместо Са 2+. Стандартным методом измерения малых токов является регистрация создаваемого ими падения напряжения на высокоомном сопротивлении . На рис .3 представлен три электрические цепи , с помощью которых осуществляются подобные измерения . Наиболее удобно автоматическое поддержан и е требуемого значения V б с помощью операционного усилителя , который представляет собой управляемый потенциалом источник напряжения ( рис .3, в ). Регистрация от целой клетки в условиях плотного контакта Несмотря на то , что метод пэтч-кламп был разработан для регистрации токов через одиночные каналы , пэтч-пипетки можно с успехом использовать также для регистрации токов от целой кле тки (РЦК ), особенно когда размеры её невелики . После образования гигаомного контакта мембранный фрагмент под пипеткой можно разрушить , прикладывая к ней короткие импульсы отрицательного давления . Такая манипуляция в большинстве случаев не нарушает контакт а пипетки с мембраной , и в результате между пипеткой и содержимым клетки устанавливается хорошо изолированный от омывающего раствора проводящий путь . Такой способ проникновения в клетку наносит ей гораздо меньше повреждений , чем введение стандартного микро э лектрода . Входное сопротивление небольших клеток велико по сравнению с эффективным сопротивлением кончика пипетки , поэтому при работе с ними электрические измерения можно проводить от участка мембраны намного большей площади , чем у исходного фрагмента . В о тличие от разных вариантов ПК регистрации этот метод позволяет осуществить регистрацию от мембраны целой клетки , а не от маленького мембранного фрагмента . Для регистрации на целой клетке пэтч-пипетки заполняют соответствующим раствором с низкой концент рацией ионов кальция . Пипетку прижимают к поверхности клеточной мембраны , в результате чего формируется высокоомный контакт . Затем потенциал пипетки изменяют до отрицательного значения и подают импульсы напряжения с амплитудой в несколько милливольт . На э т ом этапе производится компенсация быстрой ёмкостной компоненты , обусловленной ёмкостью держателя и стенок пипетки . К пипетке прикладывают импульсы отрицательного давления до тех пор , пока вновь не появятся ёмкостные переходные процессы (возникает дополнит е льный ток ). Регистрацию от целой клетки можно проводить в течение часа без визуальных или электрических признаков нарушения мембраны . Если исследуемая клетка плотно прикрепилась к культуральной чашке , плавным отведением её от пипетки можно получить конф игурацию outside - out . После такой процедуры клеточная мембрана быстро “зашивается” и клетка является интактной . Но содержимое клетки соответствует раствору в пипетке . Это используется в различных целях : 1. для изменения содержимого выбранной клетки с мин имальным повреждением её мембраны. 2. Для проведения исследований с различными внутриклеточными растворами на одной и той же клетке путем смены регистрирующих пипеток. 3. Для регистрации в одном эксперименте интегральных токов и одиночных каналов. Пипе тки должны быть сравнительно широкими и иметь кончики с большим углом схождения . Между раствором в пипетке и содержимым клетки происходит быстрый обмен , поэтому раствор для заполнения пипеток должен быть близок по своему составу к клеточному содержимому. Таб . 2. Типичные электрические параметры , получаемые при регистрации на хро мафинных клетках в конфигурации РЦК Последовательное сопротивление , Rs 4 МОм Ёмкость клетки , C 5 пФ Пост . Времени фиксации потенциала , RsC 20 мкс Пост . Времени обмена ионов , t об 5с Сопротивление клетки , R 10ГОм Сопротивление утечки , R ут 20ГОм Шум (среднеквадр . значение , 0-400 Гц ) 0,15 пА Данные таблицы отличаются от значений , полученных с обычными стеклянными микроэлектродами по трем осн овным пунктам : 1. большинство клеток с диаметром менее 20 мкм при прокалывании обычным микроэлектродом повреждается , в то время как РЦК можно проводить даже на клетках диаметром менее 10 мкм , совершенно не нарушая их. 2. Сопротивление утечки микроэлектро д-клетка при использовании обычных микроэлектродов не превышает 500 МОм , в то время как соответствующее значение сопротивления утечки при РЦК могут быть 20 ГОм и более. 3. Обычные микроэлектроды имеют сопротивление кончика Rs более 100 МОм , а типичные значения для РЦК на хромафинных клетках составляют 4 МОм. Метод РЦК применяется для регистрации токов в мембране опухолевых клеток г ипофиза , внутренних сегментов палочек сетчатки , островковых клеток поджелудочной железы , клеток миокарда , наружных сегментов палочек сетчатки , нейронов спинного мозга млекопитающих и др . Пэтч-кламп регистрация при неплотном контакте Метод регистрации от целой клетки в условиях плотного контакта позволяет регистрировать ионные токи , протекающие через небольшие мембранные фрагменты , которые содержат только один или несколько ионных каналов . Для получения информации о кинетике работы каналов или о плотност и токов через мембрану проводится одновременная регистрация работы множественных каналов с использованием метода пэтч-кламп или применяется классический метод фиксации мембранного потенциала. Регистрация при неплотном контакте по сути идентична регистрации одиночных каналов , за исключением того , что участок мембраны , на котором фиксируется потенциал , на 3 порядка больше , и при этом не требуется формирования гигаомных контактов . Метод позволяет без труда получать стабильные электрофизиологические данные от локальных участков мембраны , используя интактные клетки практически без их изоляции или других видов обработки . Например , можно проводить измерения на целой мышце , не выделяя одиночные клетки . Отпадает необходимость и в использовании внутриклеточных мик р оэлектродов. Однако , необходимо отметить , что наиболее корректную информацию о мембранной проводимости всё-таки даёт регистрация токов через одиночные каналы , так как позволяет избавиться от ряда артефактов , которые могут быть получены при регистрации макр оскопического тока . Имеются , по крайней мере , четыре основные проблемы , с которыми приходится сталкиваться при регистрации макроскопических токов . Во-первых , трудно создать условия для регистрации тока только через каналы интересующего нас типа . Во-вторых, влияние последовательного сопротивления может приводить к различию между истинным мембранным и поддерживаемым потенциалом . В-третьих , накопление ионов в примембранной области может вызывать зависящее от времени изменение тока через отдельные каналы . И , н аконец , потенциал-зависимость проводимости открытого канала может быть ошибочно принята за потенциал-зависимость активации канала. Литература : 1. Медведев С.С . Электрофизиология растений . – СПб .: Изд-во С-Петебург . ун-та , 1998. – 184 с. 2. Регистрация одиночных каналов / под ред . Сакмана Б. и Неера Э . – М .: “Мир” , 1991 3. Эккерт Р ., Рэнделл.Д , Огастин Дж . – Физиология животных , механизмы и адаптация . – М .: “Мир” ,1991 4. Hedrich R., Schroeder.J.I. and Fernandez J.M. – Patch-clamp studies on higher plant cells: a perspective. // Trends biochemistry science. – 1987. – v.12. pp. 49-52 &
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Знаете, как мой сын мне ответил, когда я ему сказала - а ты знаешь, что теперь в школе главными предметами будет физ-ра и ОБЖ?
- Мать! Ты же должна понимать, ЧТО РАБ ДОЛЖЕН БЫТЬ ЗДОРОВ И ПОНИМАТЬ,
КАК СПРЯТАТЬСЯ ВО ВРЕМЯ УГРОЗЫ ЖИЗНИ?
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, реферат по биологии "Методы измерения ионных токов", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru