Курсовая: Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии - текст курсовой. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Курсовая

Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии

Банк рефератов / Биология

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Курсовая работа
Язык курсовой: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Архив Zip, 39 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникальной курсовой работы

Узнайте стоимость написания уникальной работы

БЕЛОРУССКИЙ ГО СУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Биологический факульте т кафедра генетики и биотехнологии ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА МЕТОДОМ ПР ОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Курсовая работа студентки 3 ку рса ШУТ М.В. Научный руководитель : канд . биол . наук, доцент ГЛУШЕН С . В. Минск 2001г. ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………… ..3 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………… ………………… 4 1.Общие принципы проточной цитом етрии …………………… ..4 2. Анализ ДНК-гистограмм ……………………………………… .5 3. Анализ параметров клеточного цикла ………………………… .9 4.Наиболее употребительные методики , испо льзуемые в цитометрии клеточного цикла ……………………………… ..14 5.Применение цитометрии в молекулярной клинической диагностике ……………………………………… ..17 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………………………………………………… ..22 26 ЛИТЕРАТУРА ……………………………………………… … ..23 ВВЕДЕНИЕ Возможност и применения методов количественной цитометрии в биологических и медицинских исследованиях очень широки . Они включают множество задач , начиная от поиска наибол ее информати вных морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики ДНК в клеточном цикле и кончая многопараметрическим изучением гетеро генных популяций исследуемых объектов . Хотя э ти задачи могут решаться на различных экс периментальных моде л ях или клиническо м материале , общие принципы остаются одинаков ыми как для тех , так и других объектов. В настоящее время цитометрию принято подразделять на проточную и статическую . Пе рвый вариант цитометрии осуществляется с помо щью специальных приборов – п роточных цитометров и сортеров . Для статической цито метрии могут быть использованы конфокальные м икроскопы , а также более простые и дешевые системы анализа изображений , смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах . Существует много методик , которы е с одинак овым успехом можно воспроизводить как с помощью проточной , так и статической цитометр ии . Более того , статическая цитометрия в н екоторых случаях позволяет получить более обш ирную информацию о клетках , причем ее прои зводительность не намного мень ш е проточной. Настоящий обзор литературы посвящен при менению цитометрии для оценки параметров клет очного цикла на экспериментальном и клиническ ом материале . Хотя в обзоре в основном приводятся сведения , касающиеся проточной цитом етрии , с учетом изложенного выше они в значительной степени распространяются также и на статическую цитометрию . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.Общие принципы проточной цитометрии Метод проточной цитометрии сформи ровался за последние 30 лет на основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их размеров . В 1965 г . появило сь первое сообщение о клеточном сортере , а в 70-х годах стали выпускать приборы , с пособные измерять интенсивность флуоресценции пр и двух и более длинах волн и о пределять сразу несколько клеточных парам етров. В настоящее время выпускают два основных типа приборов для проточной цитометрии : 1) простые в испо льзовании аппараты , которые могут измерять фл уоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под уг лом около 10 є ( малоугловое прямое рассеяние ) и 90 є ; 2) большие клеточные сортеры , кото рые не только измеряют пять и более к леточных или ядерных параметров , но и сорт ируют частицы с заданным набором этих пар аметров. Принципы проточной цитометрии весьма прос ты . Клетки или ядра поодиночке пересекают сфокусированный с ветовой пучок , обычно лазерный . Свет определен ной длины возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей , связанных с различными клеточными компонентами , при этом при этом может происходить одновре м енное возбуждение нескольких разных красителей , что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров . Свет , испускаемый красителями , собирают с помощью системы линз и зеркал и разлаг ают на компоненты . Световые сигналы детектиру ют , преобразуют в элек т рические им пульсы и далее в форму , удобную для ко мпьютерной обработки и хранения информации. Методом проточной цитометрии можно получа ть самые разные данные : определять содержание в клетке ДНК и РНК , суммарное количес тво белков и количество специфических б елков , узнаваемых моноклональными антителами , исследовать клеточный метаболизм (например , и змерять внутриклеточный рН ), изучать транспорт ионов кальция и кинетику ферментативных ре акций ( M . G . Ormerod , 1990). В продаже имеются разные проточные ци тометры , и и зложить общие принципы их работы сложно . Можно отметить лишь нескол ько моментов , общих для всех приборов : – для анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток ; – клетки или ядра должны иметься в достаточном количестве ; – для устранения эфф ектов , связанных с возможной агрег ацией клеток , необходимо использовать всю дос тупную информацию , например данные по рассеян ию света в объеме и отношение площади пика к его ширине . 2. Анализ ДНК-гистограмм Измерение содержания ДНК – о дно из самых простых и распространенных применений проточной цитометрии . Первые ДНК-г истограммы , полученные в 1969 г .( M . A . Van Dilla , T . T . Trujillo , P . F . Mullaney , J . R . Coulter , 1969), позволили че тко различить клетки , находящиеся в G 1-, S - и G 2/М-фазах клеточного цикла . С тех по р появилось множество работ по измерению содержания ДНК в клиническом м атериале , полученном в основном от больных раком. Из ДНК-гистограмм можно получить два р ода данных . Во-первых , идентифицировать клетки с аномальным содержанием ДНК (рис .1, Б ), так назыв аемые анеуплоидные клетки . Во-вторых , определить долю клеток , находящихся в S -фазе ( SPF ), и оценить степ ень пролиферации . Как правило , в клеточной популяции с высокой пролиферативной активностью число клеток в S -фазе больше , чем обычно. Международный коми тет по аналитиче ской цитометрии ( W . Hoddeman , J . Schumann , M . Andreeff , B . Barlogie , C . J . Herman , R . C . Lief et . al , 1984) попытался станда ртизировать множество способов анализа ДНК-гистог рамм , и тем не менее для анализа продо лжают использовать различные подходы , часто с привлечением компьютерных прграмм . Далее будут рассмотрены некоторые из этих подход ов : Вычисление коэффициента вариации (CV) Самый пр остой способ оценки качества результатов осно ван на вычислении CV для G1-пика ДНК диплоидных клеток . Эта вели чина определяется из приведенн ого ниже соотношения в предположении , что G 1-пик следует нормальному распределению : CV = W / ( M · 2,35), Где W – ширина пи ка на уровне полувысоты , М – номер ка нала для максимума G 1 - пика . Чем меньше CV и чем лучше G 1 -пик отве чает нормальному распределению , тем качественнее резул ьтаты . В действительности качество ДНК-гистограмм , как правило , не очень высоко , и чтобы судить о достоверности результатов , полученн ых при клинических исследованиях , приходится оценивать средний CV и д иапазон его значений. Вычисление индекса ДНК Индекс Д НК для «анеуплоидного» пика (пиков ) на гис тограммах с двумя или более G 1-пиками (рис .1, Б ) вычисляю т , ориентируясь на «диплоидный» G 1 -пик . Так , на рис . 1, Б G 1 -пику для опухолевых клето к соответствует вдвое большее количество ДНК , чем G 1 -пику диплоидных клеток , поэтому индекс ДНК для него равен 2,0. Для анеупло идных клеток , содержащих на 50% больше ДНК , ч ем нормальные , индекс равен 1,5. Анеуплоидию можн о выявить только в тех случаях , когда на гистограмм ах имеется не менее двух G 1 -пиков . Чтобы установить , какой из близ ко расположенных друг к другу G 1 -пико в соответствует диплоидным клеткам из свежих образцов ткани , можно использовать внешний ДНК-стандарт . Если присутствуют только диплоидн ые клетки , то ИД с читают равным 1,0. Основная проблема при определении плоидно сти связана с трудностью выявления малого числа анеуплоидных стволовых клеток . Еще тр уднее идентифицировать малочисленные тетраплоидные стволовые клетки , поскольку такие клетки в G 1 -фазе по содерж анию ДНК равноценны диплоидным клеткам в фазе G 2. Так , в о тличие от рис 1, Б , на котором четко вид ен высокий «тетраплоидный» пик , на рис .1, А обнаруживается лишь слабый пик , соответствую щий четырем гаплоидным наборам ДНК . Определение доли клеток , на ходящи хся в S -фазе Для опре деления доли клеток в S -фазе используется метод Байсха и др .( H . Baisch , W . Gohde , W . A . Linden , 1975), модифицированный применительно к анеуплоидным клеткам . Суть метода состоит в построении прямоугольника , вписывающегося в пространс тво между G 1 - и G 2 -пиками . Высо та этого прямоугольника определяется числом к леток , приходящихся на 10 центральных каналов об ласти S -фазы , из которого вычисляется среднее число клеток на канал . Аналогичным способом можно опре делить долю анеуплоидных клеток в S -фазе при условии , что высоту прямоугольника (рис .1, Б ) можно вычислить , используя ту часть гистограммы , которая не перекрывается с областью , отвеча ющей диплоидным клеткам. 3. Анализ параметров клеточно го ци кла Благодаря фундаментальным исследованиям в области экспериментальной биологии и клинич еской медицины были получены факты , касающиес я кинетики клеточного цикла. К настоящему времени уже накоплен определенный опыт раб оты по данному вопросу . Практически не существует ни одного органа или ткани человеческого организма , экспериментального животного , который бы не подвергался цитометрическому или цитоспектрофотометрическому анализу . На основании этих данных установлено , что содерж ание Д НК нормальных соматических кл еток соответствует диплоидному набору хромосом (2с ) и характеризуется одним модальным класс ом на ДНК-гистограмме . Значение этого параметр а для одного и того же индивида может колебаться в пределах 30%. Наиболее выраженные вар и ации в содержании ДНК на блюдаются в клетках пролиферирующих органов – печени и селезенки . Эти данные были получены при определении содержания ДНК в ядрах клеток различных органов и тканей фенотически здоровых людей (130 проб – по 5 – 14 от каждого случая ) ( E . Muller , R . Weidhase , 1983). В изучаемых объектах схематически предста влены фазы митотического цикла и распределени е ДНК в различных тканях . Рассчитывалась к инетика клеточной пролиферации , а в патологич ески измененном органе – степень выраженност и процесс а , особенно в случае раковой опухоли. Благодаря использованию в исследованиях с канирующих и проточных цитофотометров определены важные данные , касающиеся классификации клет ок по фазам митотического цикла , а также получены результаты , позволяющие оценить пр одолжительность и дисперсию соответствующих фаз цикла G 1 , S , G 2 + M . Однопараметрический анализ кинетики клеточно го цикла по изучению содержания ДНК показ ал возможности количественной цитометрии и от крыл широкие перспективы относительно его исп ользования для исследования и углубления знаний по изучаемому вопросу. В настоящее время появились данные , ко торые значительно расширяют традиционное предста вление , касающееся распределения клеток в чет ырех последовательных фазах цикла . Одновременное изучение двух парам етров – ДНК и белка , ДНК и РНК – дает существенно больше информации о кинетике клеточного цикла , так как позволяет разделить сливающиес я фазы цикла , такие , как G 0 + G 1 , G 2 + M , а также ид ентифицировать дополнительные фазы в пресинтетич еском ( G 1 ) и постсинтети ческом ( G 2 ) п ериодах . При анализе пресинтетического периода в эксперименте и клиническом материале был а показана возможность использования АО (ДНК и РНК ) для дополнительной классификации G 1 -периода на GIQ , GIA , GIB и G 2 A , G 2 B ( Z . Darzynkiewicz , F . Traganos , M . R . Melamed , 1980). На культуре клеток Hela с использованием меченых радио активных изотопов и проточной цитометрии выд елены в постсинтетическом периоде клетки , отн осящиеся к ранней ( G 2 A ) и поздней ( G 2 B ) фазам клето чного цикла ( O . C . Blair , R . T . Winward , J . L . Roti , 1979). Pollack и др . ( A . Pollac , H . Moulis , N . L . Block , G . L . Irvin , 1984) при цитометрическом анализе Д НК и белка ( FITC / PI ) в клетках трех различных экспериментальных моделей , включающих культуру лейкозных опухолевых кл еток крыс FL 4, микрокультуру ли мфоцитов периферической к рови человека HPBL , не стимулированных и стимулированных ф итогемагглютинином (ФГА ), а также материала сол идной опухоли в виде перевивной аденокарцином ы предстательной железы крыс R 3327= Q показал возможность разделения пресинт етич еского периода на три фазы , выдели в в нем покоящиеся клетки GIQ , ранние GIA и поздние G 2 B клетки , в постсинтетическом периоде были соответственно выделены ранние G 2А и поздние G 2 B клетки . Для задержки вхождения клеток в S -фазу использовали актиномици дин D , оксимочев ину , для блока митотических клеток применяли колцемид. В работе также представлены данные , св идетельствующие о возможности классификации прол иферирующих лимфоидных и лейкозных опухолевых EL 4-клеток в различные сроки культивирования на соответст вующие S - фазы клеточного цикла с раздельным выделением в них M - и G 2 -фаз . Исходя из представленных данных , очевидно , что проточный цитометрический анал из по двум параметрам является одним из перспективных методов оценки кинетики клеточно го цикла , позволяющ ий провести идентифика цию клеток , находящихся в ранее неопределяемы х фазах цикла ( G 1 A , G 1 B и G 2 A , G 2 B ), и определить к летки , находящиеся в фазах M и G 2 . В некоторых работах клинического направле ния используется двухпараметрический анализ клет очного материа ла с достаточно успешной классификацией патологических процессов , например при распознавании доброкачественных и раковы х процессов мочевого пузыря , шейки матки , а также для классификации различных форм гемобластозов. В современной литературе весьма широко представлены данные по цитоспектрофотометрич ескому изучению интерфазных ядер . Следует отм етить , что особую ценность представляют работ ы , направленные на изучение митотических клет ок с последующим анализом хромосом . Известно , что изменения , регистрируемые в х ромосомах , могут быть определяющими диагностическ ими маркерами опухоли , особенно на начальных этапах возникновения злокачественного процесса . Однако используемые методы анализа хромосом ного материала сравнительно сложны и трудоемк и . Поэтому в последнее в ремя нар яду с обычными цитогенетическими методами исс ледования кариотипа нормальных и малигнизированн ых клеток стали применяться сканирующие и проточные цитометрические анализаторы . Приборы последнего типа обеспечивают достаточно высокую точность и скорос т ь измерения , а также воспроизводимость результатов . Скорост ь анализа хромосом в протоке составляет 1000 – 2000 хромосом в секунду . Проточный цитометриче ский анализ ДНК метафазных хромосом в сус пензии является совершенно новым методом кари отипирования . Поэ т ому в исследованиях такого рода основной акцент делается на разработке эффективных методов сепарации инт актных хромосом с сохранением их целостности и морфологической структуры. В представленных работах чаще всего и зучаемой моделью являются метафазные хром осомы , полученные из клеток китайского хомячк а и человека , приготовленные для прямого к ариотипирования , а также для анализа кариотип а с кратковременным или длительным культивиро ванием клеток . Для анализа генетического мате риала используются однопараметрич е ские проточные системы , где проводится анализ и сортировка хромосом по интенсивности флуорес ценции в комплексе с такими флуорохромами , как PI , EtBr , Ho 33258, а также применяются высокоразрешающие проточные цитометры с двухлазе рной системой , которые обесп ечивают бивар иантный анализ ДНК , меченный двумя флуорохром ами . Большей частью используют сочетание Но 33258, специфически связывающийся с АТ-богатыми учас тками ДНК , и хромомицин А 3 , селективно взаимодействующий с ГЦ- парами. Данные , полученные при помощи ав то матизированных систем , представляются в виде гистограмм , так называемых проточных кариограмм . О качестве анализа свидетельствует высокое разрешение гистограмм , Которые характеризуются множественными узкими пиками , относящимися к различным классам хромос о м . Количеств о пиков в большинстве случаев соответствует набору хромосом , которое характерно для д анного индивидуума . При исследовании клеток з ародыша китайского хомячка методом проточного кариотипирования на этапе экспоненциального ро ста были получены все 11 пиков , со ответствующие 11 парам хромосом самки , исследуемого животного ( J . A . Steinkamp , 1984). Обычно применяемые цитогенетические методы не позволяют идентифицировать Y -хромосому из G - и F -групп хромосом че ловека . Применение проточной цитометрии позволя ет решить эту задачу . Так , на лимфо цитах , выделенных из периферической крови дон оров-мужчин , с кратковременным культивированием (52 ч ) и добавлентем колцемида была показана во зможность определения позиции Y -хромосомы по интенсивности ДНК-флуоресценции (Но 33258) в виде пика на проточной кариограмме . У 17 обследуемых донор ов позиция Y - хромосомы на гистограмме варьировала . В некот орых наблюдениях пик Y -хромосомы находился между 19 и 20 хром осомами , в других – между 20-й и 17-й . В 70% случаев Y - хромосома была контаминирована с 20-й. Из работ , посвященных хромосомному анализ у , известно , что при использовании однолазерно й проточной системы может быть идентифицирова но около 15 хромосом человека , исключая Y -хромосому . Применение двухлазерной системы ( FACS -11) позво ляет по интенсивности флуоресценции распознать около 20 популяций хром осом в метафазных пластинках и , что особен но ценно , идентифицировать маленькие аутосомы человека ( M . Lalande , R . R . Schreck , R . Hoffman , S . A . Latt , 1985). В этом случае помимо флюорохромов Н о 33258 и хромомицина А 3 в комплекс субстр ат-флюорохром вводится третий краситель : нетропсин или дистамицин А . Это способствует получе нию дополнительной информации о специфике хро мосом , т.е . определению структурных особенностей нормальных и атипических хро мосом . В результате бивариантного проточного анализа с дополнительной окраской хромосом авторам уда лось на модели клеточной линии человеческих лимфобластов получить высокое разрешение мет афазных пластин с последующим изучением струк турной перестройки хром о сом и иде нтификацией аномальных. Проточный бивариантный анализ , используемый для кариотипа хромосом , апробирован на дост аточно широком спектре клинического и экспери ментального материала , включая опухоль прямой кишки , культуры клеток асцитической жидкости, лимфоцитов периферической крови и фибр областов человека ( V . G . Enchev , K . G . Tsanev , 1985). 4.Наиболее употребительные методики , использ уемые в цитометрии клеточного цикла. При проточной цитометрии можно сканироват ь от 100 до нескольких тысяч клеток в се к унду , что позволяет очень быстро полу чить достоверные результаты . Однако таким спо собом можно анализировать только очень разбав ленные клеточные суспензии . Солидные ткани не обходимо сначала дезагрегировать , что всегда сопровождается нарушением морфологии . К л етки монослоя обычно диспергируют обработкой трипсином в присутсвии ЭДТА. Дезагрегация свежих солидных опухолей Методы д езагрегации клеток можно подразделить на три группы : – методы , основан ные исключительно на механической обработке ; – ферментативные методы ; – методы выделен ия ядер Самые простые и быстрые методы дезагрегации вклю чают только механическую обработку тканей . Эт и методы особенно хороши для рыхлых ткане й (например , лимфатических узлов ) и позволяет получать густые суспензии клеток за неско лько минут . Для получения неочищенных клеточных суспензий можно использовать аспираты солидных опухолей , взятые с помощью шприц а. Ферментативный метод позволяет получить д остаточно концентрированную клеточную суспензию из разнообразных опухолей , но при бол ь ших затратах времени. Для выделения ядер (обычно из тканей , частично дезагрегированных механическим путем ) разработаны различные методы , основанные на использовании ферментов , детергентов или тех и других . Детальная процедура дезагрегации тканей , окрашив ания препаратов , получения результатов и их анализа для суспензии яд ер разработана Винделовом и др . ( L . L . Vindelov , I . J . Christensen , 1990). Цель дезагрегации состоит в п олучении с высоким выходом суспензии интактны х изолированных клеток или ядер , достаточно хорошо соответствующей исходному образцу ткани . Выбор способа дезагрегации зависит о т типа ткани , размеров препарата , целей ис следования , а иногда от быстроты и стоимос ти метода. Суспендирование архивных препаратов , залитых в парафин Методика исследования ДНК с помощью проточной цитометрии суспензии ядер , полученной из заключенных в парафин архи вных препаратов , была впервые описана в 1983 г . ( D . W . Hedley , M . L . Friedlander , I . W . Taylor , 1983). Эту методику можно использова ть в модифицированном виде для анализа самых разнообразных опухолей . Это дает целый ряд преимуществ : – можно проводит ь обширные ретроспективные клинические исследова ния ; – значительно уп рощается изучение редко встречающихся патологий ; – парафиновые ср езы легко транспортировать , что позволяе т проводить цитометрические исследования в спе циальных центрах. Недостатки метода состоят в том , что : – качество получ аемых результатов , как правило , не очень в ысокое ; – нельзя использ овать внутренний ДНК-стандарт. Качество результатов можно повысить , ес ли немног о усовершенствовать фиксацию тканей ( C . E . Gillett , R . S . Camplejohn , S . M . O ґ Reily , 1990). Хороший эффект дает фиксация в формалине при нейт ральном рН при 4 є С в течение ночи . Следует избегать нагревания ткани (если только оно не яв ляется абсолютно необ ходимым при ее о бработке ) или неоправданно длительной фиксации. Окрашивание ДНК При окрашивании клеточной ДНК с целью последующего определения ее содерж ания с помощью проточной цитометрии следует учитывать : – специфичность красителя по отношению к ДНК ; – его спектральны е характеристики : интенсивность флуоресценции и возможность ее регистрации имеющимися в пр одаже приборами ; – стоимость и удобство в работе (растворимость , стабильность и т.д .) Этим тре бованиям отвечает целый ряд флуорохромов . Дет альное их описание дано в работах Waggoner A . S . (1990), Crissman H . A ., Steincamp J . A . (1990), Laff S . A ., Langolis R . J . (1990). В проточной цитометрии для окрашивания ДНК чаще других флуорохромов и спользуется иодистый пропидий (ИП ) даже несмот ря на то , что он не стро го спе цифичен по отношению к ДНК . С помощью ИП можно окрашивать также двухцепочечную РНК . Спектральные характеристики ИП очень удобны для проточной цитометрии : для возбуждения флуоресценции используется обычный аргоновый л азер с рабочей длиной волны 488 н м , а максимум флуоресценции находится вбл изи 620 нм , что позволяет параллельно использова ть флуоресцеин при проведении многопараметрическ их измерений. Независимо от красителя последний должен находиться с ДНК в стехиометрических соо тношениях , т.е . количеств о связанного с ДНК красителя должно быть пропорционально содержанию ДНК в клетке . Чтобы красителем были заняты все доступные для связывания места , его следует брать в некотором избыт ке. Большинство флуоресцирующих красителей , связы вающихся с ДНК , в том чис ле и ИП , не могут проходить через мембраны инта ктных клеток . Чтобы повысить проницаемость ме мбран , клетки либо фиксируют спиртом , либо обрабатывают детергентами. Использование другой ДНК в к ачестве стандарта. Содержание ДНК , которой отвечает один из пиков на ДНК-гистограмме дл я исследуемого препарата , можно оценить , сравн ив этот пик с пиком для другой ДНК , содержание которой известно . Так , сравнение левого пика на рис .1 с пиком , отвечающим ДНК диплоидных лимфоцитов периферической крови человека , говорит о т ом , что мы имеем дело с диплоидными клетками . В докладе Комитета по номенклатуре в анали тической цитометрии рекомендуется использовать л имфоциты в качестве независимого стандарта ДН К . Известны и другие случаи , когда стандар том служат ядерные эритроциты не м лекопитающих , а других животных . Если используются ядра , выделенные из заключенных в парафин препаратов , то независи мые ДНК-стандарты применять нельзя . Это связан о с неодинаковым окрашиванием ДНК в ядрах , выделенных из разных парафиновых блоков , вследств ие различий в процедурах фиксаци и и обработки тканей . Если на ДНК-гистогра ммах препаратов , заключенных в парафин , наблюд ается два G 1 -пика , то левый из них усло вно считается соответствующим диплоидным клеткам (рис .1, Б ). Это не мешает выявлению анеуп лоидных клеток , поскольку все образцы со держат внутренний контроль – диплоидные кле тки (лимфоциты , эндотелиальные клетки и т . д .). Но в результате некоторые образцы ошиб очно классифицируются как «гиперплоидные» , хотя на самом деле являются «гипоплоидными» . Кли н и ческая значимость такой неправильно й классификации неизвестна , но в любом слу чае ее вероятность невелика. 5.Применение цитометрии в молекулярной к линической диагностике. На первых порах основным стимулом к развитию проточной цитометрии послужило желани е а втоматизировать цитологические методы , использующиеся для диагноза заболеваний , но б ольшинство опубликованных к настоящему времени работ посвящено применению этого метода дл я прогностических целей . Интенсивное развитие автоматизированных диагностических с и сте м сканирующего и проточного типов способствов ало быстрейшему внедрению цитометрического метод а исследования в клиническую практику . В п роцессе развития и освоения метода происходит его специализация по трем ведущим направ лениям . Первое – это массовые п р офилактические осмотры населения с целью выявления ранних стадий заболевания , второе – дифференциальная диагностика пограничных состояний и злокачественного роста , третье – контроль динамики опухолевого заболевания в ходе проведения лекарственной , лучевой и комбинированной терапии , а также хир ургического метода лечения . Особенно плодотворно ведутся цитометрические исследования в облас ти гематологии , гинекологии , урологии , пульмонологи и , гастроэнтерологии , метод также используется для диагностики патологиче с ких про цессов молочной и щитовидной желез. Из истории количественной цитометрии изве стно , что одним из первых объектов изучени я были форменные элементы крови и эпители альные клетки слизистой оболочки шейки матки . Данное обстоятельство связано с доступность ю получения диагностического материала , р азнообразием клеточных элементов , характеризующих нормальное физиологическое состояние исследуемых объектов , а также с трудностью морфологич еской идентификации их при различных патологи ческих процессах , особенно он к ологиче ских заболеваниях . Гинекология Достаточно большой опыт применени я количественной цитометрии в области гинекол огии позволяет выделить несколько этапов в развитии количественного метода оценки морфоло гических особенностей эпителиальных клеток шейк и матки . Первый этап характеризуется и сследованиями , в которых рассматривается возможно сть осуществления цитоскрининга , т.е . разграничение патологических процессов на две группы « норма – рак» . Второй этап связан с ди фференциацией пограничных состояний шей к и матки по анализу одного , двух кр итериев диагностики с последующим применением корреляционного анализа , построением двух - и трехпараметрических диаграмм зависимостей изучаемы х признаков . Третий этап исследований направл ен на углубленную идентификацию кле т ок с изучением их структурных особенн остей (интегральная оптическая плотность , содержан ие ДНК ), отражающих определенные состояния шей ки матки при диспластических , метапластических процессах , внутриэпителиальном и инвазивных фо рмах рака . Полученные резуль т аты м огут послужить основой изучения механизмов пе рестройки эпителиального пласта в процессе ег о озлокачествления и определения природы злок ачественной трансформации клетки . Характеризуя да нное направление , можно подчеркнуть значимость цитометрических исс л едований и в области осуществления контроля качества цитоло гической и гистологической диагностики заболеван ий шейки матки , а также оценки степени репарации ткани в процессе лечения . Исходя из фундаментальных исследований , посвященных оценке более чем 196 к ачественных и количественных признаков ядра и клетки и общего фона препарата , определяют , что более значимы параметры , характеризующие морфологическ ие особенности ядра (Б.М.Брамберга , И.Я.Зитаре , Д.П .Плегере , Э.Х.Смилтниекс ,1970). Поэтому при количественн о м анализе препаратов обычно исхо дят из информативности размерных и структурны х характеристик ядра : изучают его площадь , периметр , объем , диаметр , определяют коэффициент формы и оптическую плотность , содержание ДН К , РНК и белка в нем . На основании данных п р оточной цитометрии установле но , что среди обследуемых пациентов с разл ичной патологией шейки матки в 74,5% случаев имеются кондиломатозные изменения . Установлен про филь типичной ДНК-гистограммы для данной пато логии шейки матки с высоким содержанием Д НК в G 0 / G 1-фазе и ранней S - фазе клеточного цикла . Полагают , что наблюдаем ые изменения в ДНК-гистограмме можно рассматр ивать как проявление папилломо-вирусной инфекции в этиологии кондиломы шейки матки (K. C . Tsou , D . H . Hong , M . Varello et al , 1984). Кроветворная сис тема При цитометрическом анализе клето чных элементов крови используют критерии , кот орые включают довольно широкий спектр парамет ров . Это в первую очередь цитометрические маркеры с использованием специфических красителе й на РНК , ДНК , различных ферментативны х систем (эстеразу , фосфатазу ). Используются так же размерные критерии , которые включают объем , площадь , периметр и диаметр ядра и ци топлазмы клеток , а также ядерно-цитоплазматическое отношение. При исследовании диагностического материала при острых и хрони ческих формах лейкозов методами цитометрии обнаружены некоторы е различия для клеточных элементов той ил и иной группы гемобластозов . Используя морфом етрические методы оценки размерных признаков ядра и цитоплазмы бластных клеток , обнаружена строгая корреляц и я величины клет ок и FAB (фра нко-американо-британской )- классификации лейкозов . При сопоставлении количественных данных , полученных при исследовании клеточных элементов при о стрых лимфобластном и миелобластном лейкозах , классифицируемых по морфологическим п ризнака м на подгруппы М 1 – М 6 согласно FAB -классификации , определены различия между двумя вариантами лейкозов , кроме подгруппы М 2 . Регистрируемые различия в разме ре бластных клеток связаны с фазами клето чного цикла . Установлено , что клетки при о стром миело бластном лейкозе в S -фазе цикла характ еризуются большим размером ядра . Для этой же форме лейкоза , но подгруппы М 1 характерна более малая доля клеток в S -фазе клеточного цикла ( M . Efrench , P . A . Bryon , D . Fiere et al , 1981). Молочная железа С целью повышения ди агнос тических возможностей цитологического метода при добро - и злокачественных опухолях молочной железы , определения их гистологических варианто в , разработки прогностических критериев заболеван ия – также используются данные морфометрии и цитоспектрофотоме т рии . При объе ктивизации цитологических препаратов исходя из информативности следующих признаков : диаметр , п ериметр и площадь ядра и цитоплазмы , ядерн о-цитоплазматическое отношение , текстура хроматина , содержание ДНК и РНК . На основании цито метрических исс л едований установлены некоторые закономерности , характерные для злокаче ственных форм опухолей молочной железы . Это вариабельность ядерно-цитоплазматического отношения , нарастание размера ядра и содержания ДНК . Между двумя последними показателями обнаружена корреляционная зависимость , характеризующ аяся следующими особенностями . Показано , что к летки с некоторой атипией , которая выражается в увеличении площади ядра , распределяются различно по фазам клеточного цикла . Около 21% клеток , находящихся в области 4с Д Н К-гистограммы , имеют площадь ядер свыше 125 мкм 2 . При площад и ядер от 50 до 100 мкм 2 основная масса клеток находится в G 1-фазе цик ла и только около 5% клеток приходятся на гипердиплоидную область распределения ДНК ( C . J . Cornelisse , A . J . Van Driel - Kulker , F . Meyer , J . S . Ploem , 1985). Показатель ДНК (количество ДНК в 1 клетке опухоли на количество ДНК в нормальной клетке ) в различных типах злокач ественных опухолей молочной железы значительно варьирует , однако чаще наблюдается тетраплоидия (60 – 80%), доброкачест венные опухоли , как правило , диплоидные . Сравнительная оценка содержан ия ДНК в клетках молочной железы при доброкачественных и раковых процессах показала определенную зависимость между соотношением кл еток по фазам цикла . Установлено , что с прогрессировани е м процесса количество диплоидных клеток в G 1-фазе цикла убывает и при III – IV стадии ракового процесса составляет 64%. Количество тетраплоидных клеток нарастает в 2 раза и составляет око ло 17% общего количества клеток по сравнению с пролиферативной формой мастопатии и в 3 раза по отношению к непролиферативной форме мастопатии. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом , как проточная , так и статическая цитометрия позволяет иссле довать многие важные параметры клеточного цик ла . Наиболее распространенной з адачей , реш аемой с помощью данного класса приборов , я вляется идентификация и подсчет клеток , наход ящихся в различных периодах клеточного цикла . В последнее время параллельно с этими параметрами с помощью цитометров исследуют также динамику экспрессии мно г их важных клеточных маркеров , что может иметь диагностическое и прогностическое значение . Важно отметить , что принципиальных различий м ежду двумя типами цитометрии , по-видимому , не существует . Поэтому с помощью достаточно пр остых и недорогих приборов можн о воспроизводить весьма эффективные методики исс ледования клеточного цикла , первоначально разрабо танные для дорогостоящих проточных цитометров . Такие системы статической цитометрии включают в себя люминесцентный микроскоп , черно-белую или цветную телевизио н ную камеру высокой чувствительности , устройство для оци фровки телесигнала и компьютер . В последнее время в подобных системах все более ши роко применяются цифровые телекамеры , которые подключаются к компьютеру через высокопроизводит ельные порты нового поко л ения (уни версальный последовательный порт ). Это позволяет создавать недорогие и достаточно мощные си стемы для статической цитометрии , которые мог ут успешно конкурировать как с проточными цитометрами , так с конфокальными микроскопами . В целом можно сделать вывод о перспективности данного направления в цитоло гии , дающего возможность широкого применения методов количественной микроскопии в научных исследованиях и клинической практике. ЛИТЕРАТУРА 1. Брамберга Б. М ., Зитаре И.Я ., Плегере Д.П ., Смилтн иекс Э.Х . Терминологический словарь морфологических признаков клетки для автоматизации цитологическо й диагностики и оценки эффективности лечения . – Рига , 1970. – 160 с. 2. Введение в количественную цитохимию . М ., Мир , 1969, 439с. 3. Исаев В.Л ., Пинчук В. Г ., Исаева Л.М . Современные м етоды автоматизированных цитологических исследований . – Киев : Наук . думка , 1988. – 218 с. 4. Лимфоциты . М етоды / под пед . Дж . Клауса-М ., Мир , 393с. 5. Молекулярная клиническая диагностика . Методы / под ред . С.Х еррингтона , Дж. Макги . – М .: Мир , 1999. – 558с. 6. Полетаев А.И . Проточная цитометрия и сортировка в цито логии , молекулярной биологии , биотехнологии и медицине . М ., ВИНИТИ , 1989, 87с. 7. Baisch H., Gohde W., Linden W.A. (1975). Radiat. Environ. Biophis., 12, 31. 8. Blair O.C. Winward R.T., Roti J.L. The effect of hyperthermia on the protein content of Hela cell nuclei: A flow cytometric analysis // Radiat. Ress – 1979. – 78. – P. 474 9. Cornelisse C.J., Van Driel-Kulker A.J., Meyer F., Ploem J.S. Automated recognit ion of atypical nuclei in breast cancer cytology specimens by iterative image transformation // J. Microsc. (Gr. Brit.). – 1985. – 137, N 1. – P. 101 – 110. 10. Crissman H. A., Steinkamp J.A. (1990). ). In: Flow cytometry and sorting (2 nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 227 – 247. Wiley – Liss, New York. 11. Darzynkiewicz Z., Traganos F., Melamed M.R. New cell cycle compartments identified by multiparameter flow cytometry // Cytometry. – 1980. – 1, N 1. – P.98. 12. Efrench M., Bryon P.A., Fiere D. Et. Al. Quantitative cytology of acute adult leukemia // Transplant Clin immunol. – XIII, Excerpta Medica. – 1981. – P. 224 – 228. 13. Enchev V.G., Tsanev K.G. Comparative cytomorphometric and cytospectrophotometric investigations of gastric lesions // Ibid. – 1985. – 55, N 1. – P. 37 – 46. 14. Gillett C.E., Camplejohn R.S., Oґ Reily S.M. (1990). J. Pathol., 160, 173A. 15. Hedley D.W., Friedlander M.L., Taylor I.W., Rugg C.A., Musgrove E.A. (1983). J. Histochem. Cytochem., 31, 1333. 16. HoddemanW., Schumann J., Andreeff M., Barlogie B., Herman C.J., Lief R.C. et. Al. (1984). Cytometry, 5, 445. 17. Jacobberger J.W., Sramkoski R.M., Wormsley S.B., Bolton W.E. Estimation of kinetic cell-cycle-related gene expression in G1 and G2 phases from immunofluorescence flow cytometry data/ Cytometry, 1999, 35, 284-289. 18. Laff S.A., Langolis R.J. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2 nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp.249 – 290 . Wiley – Liss, New York. 19. Lalande M., Schreck R.R., Hoffman R., Latt S.A. Identification of inverted duplicated 15 chromosomes using bivariate flow cytometric analysis // Cytometry. – 1985. – 6, N 1. – P. 1 – 6. 20. Muller E., Weidhase R. Impulscytophotometrische Untersuchungen zu m DNS-Gehalt in Humanen Zellkernen // Wiss. Beitr. M. – Luther-Univ. Halle-Wittenberg. – 1983. – 32, N 2. – S. 3 – 8. 21. Ormerod M.G. (ed.) (1990). Flow cytometry; A practical approach. IRL Press, Oxford. 22. Pollack A., Moulis H., Block N.L., Irvin G. L. Quantitation of Cell Kinetic Responses Using Simultaneous Flow Cytometric Measurements of DNA and Nuclear Protein //Cytometry. – 1984. – 5, N 5. – P. 473 – 481. 23. Steinkamp J.A. Flow cytometry // Rev. Sci. Instrum. – 1984. – 55, N 9. – P. 1375 – 1400. 24. Tsou K.C., Hong D.H., Varello M. et. al. Flow cytometric DNA analysis as a diagnostic aid for cervical condyloma and cancer // Cancer. – 1984. – 54, N 9. – P. 1778 – 1787. 25. Van Dilla M.A., Trujillo T.T., Mullaney P.F., CoulterJ.R. (1969). Scien ce, 163, 1213. 26. Vindelov L.L., Christensen I.J. (1990). Cytometry, 11, 753. 27. Waggoner A.S. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2 nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 209 – 225. Wiley – Liss, New York.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
- Опять в стельку пьяная с корпоратива пришла?!
— Дорогой, я не могла не пить.. мне угрожали!
— Кааак?
— Если не выпью, то больше не нальют!
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, курсовая по биологии "Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru