Курсовая: Масс-спектрометрический метод анализа - текст курсовой. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Курсовая

Масс-спектрометрический метод анализа

Банк рефератов / Химия

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Курсовая работа
Язык курсовой: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Архив Zip, 81 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникальной курсовой работы

Узнайте стоимость написания уникальной работы

ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Химический факультет Курсовая работа на тему «Ма сс-спектрометрический метод анализа» Выполнил: студент группы Х-202 Мен ьшенин А.Н. Проверила: Данилина Е.И. Челябинск 2007 Содержание 1. Содержа ние 2 2. ВВЕДЕНИЕ 5 3. Основы масс-спектрометрии 6 4. Принципиальное устройство масс-спектрометра 6 5. Способы ввода образца 7 6. Прямой перенос заряженной молекулы в газовую фазу 11 7. Отрыв электрона 11 8. За хват электрона 11 9. Спо собы ионизации 13 10. Ионизация электроспрея (ESI) 14 11. Растворители для электроспрея 19 12. Устройство прибора ионизации электроспрея 20 13. Ионизация наноэлектроспрея (nanoESI) 21 14. Химическая ионизация при атмосфе рном давлении (APCI) 22 15. Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI) 23 16. Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы (MALDI) 25 17. Таблица 1.4. Преимущества и недостатки метода лазе рнойдесорбции/ионизации при помощи матрицы (MALDI). 27 18. Десорбция/ионизация на кремнии (DIOS) 30 19. Бомбардировка быстрыми атомами/ионами (FAB) 31 20. Электронная ионизация (EI) 32 21. Химическая ионизация (CI) 34 22. Таблица 1.5. Сравнен ие основных характеристик способов ионизации. 37 23. Анал изаторы масс 39 24. Анализ м асс 39 25. Таблица 2.1. Краткий обзор прин ципов работы анализаторов. 42 26. Рабочие характеристики анализаторов 43 27. Точность 43 28. Разрешение (разрешающая сила) 44 29. Диапазон масс 45 30. Тандемный анализ масс (MS/MS или MSn) 45 31. Скорость сканирования 46 32. Конкретные виды анализаторов 47 33. Квадрупольный анализатор 48 34. Квадрупольная ионная ловушка 49 35. Линейная ио нная ловушка отличается от трёхмерной (рис. 2.6) тем, что она запирает ионы вд оль оси квадрупольного анализатора масс, используя двумерное (2D) радиоча стотное (RF) поле с потенциалами, приложенными к концевым электродам. Основ ное преимущество линейной ловушки перед 3D – больший объём анализатора, который сам по себе значительно увеличивает динамический диапазон и ул учшает диапазон количественного анализа. Ограничения ионной ловушки: с канирование иона-предшественника, «правило одной трети» и динамически й диапазон. 53 36. Главными ограничениями данных возможностей ио нной ловушки, которые удерживают её от того, чтобы быть совершенным сред ством для фармакокинетики и протеомики, являются следующие: 1) способнос ть давать высокую чувствительность одновременно для тройного квадрупо льного сканирования иона-предшественника, и для экспериментов со средн им затуханием невозможна для ионных ловушек. 2) Верхний предел соотношен ия между m/z предшественника и самого мелкого пойманного фрагмента соста вляет приблизительно 0.3 (также известно как «правило одной трети»). Иллюст рацией правила одной трети является то, что фрагментарные ионы от m/z 900 не б удут детектироваться при m/z меньше 300, накладывая значительные ограничени я на очередное секвенирование пептидов. 3) Динамический диапазон ионных ловушек ограничен тем, что при слишком большом числе ионов внутри ловушк и пространственные влияние зарядов ограничит представительность анал изатора. Чтобы обойти это, автоматические сканеры быстро пересчитывают ионы перед тем, как те попадут в ловушку, тем самым ограничивая число воше дших ионов. Но такой подход составляет проблему, если нужный ион сопрово ждается большим фоном других ионов. 54 37. Двуфокусирующий магнитный сектор 54 38. Квадрупольная-времяпролё тная тандемная масс-спектрометрия 55 39. Квадрупольная времяпролётная масс-сп ектрометрия 61 40. Масс-спектрометрия с Фурье-преобраз ованием (FTMS) 62 41. Таблица 2.2. Общее сравнение анализаторов масс, обычно использ уемых совместно с ESI. Эти значения могут меняться в зависимости от произво дителя прибора. 68 42. Детекторы 69 43. Электронный умножитель 69 44. Цилиндр Фарадея 70 45. Включает в себя уда р ионов по поверхности динода (BeO, GaP или CsSb), который вызывает выброс вторичны х электронов. Этот временный выброс электронов вызывает положительный заряд на детекторе, и поэтому ток электронов по направлению к детектору. Такой детектор не особенно чувствителен, давая очень ограниченное усил ение сигнала, но зато он устойчив к относительно высокому давлению. 70 46. Фотоумножитель с преобразующим динодом 70 47. Матричный детектор 72 48. Зарядовый (индуктивный) детектор 72 49. Таблица 3.1. Общее сравнение детекторов. 73 50. Вакуум масс-спектрометра 74 51. Выв оды 76 52. Список использованной литературы 77 1. ВВЕДЕНИЕ Масс-спектрометрию описывали как мельчайшие весы в мире, не из-за размера масс-спектрометра, но из-за того, что он взвешивает – мол екулы. За последнее время масс-спектрометрия претерпела потрясающий те хнологический подъём, позволяющий применять её для белков, пептидов, угл еводов, ДНК, лекарств и многих других биологически активных молекул. Бла годаря таким способам ионизации, как ионизация электроспрея ( ESI ) или лазерная десорбция/ионизация из матр ицы ( MALDI ), масс-спектрометрия стала не заменимым инструментом для биохимических исследований. Основы масс-спектрометрии Масс-спектрометр определяет массу молекулы, измеряя отно шение массы к заряду ( m / z ) её иона. Ионы генерируются при потере или получении заряда нейтральными частицами. После образования ионы элект ростатически направляются в анализатор массы, где они разделяются соот ветственно своему m / z и, наконец, детектируются. Результатом ион изации молекул, разделения ионов и детектирования ионов является спект р, по которому можно определить молекулярную массу и даже некоторую инфо рмацию о строении вещества. Можно провести аналогию между масс-спектром етром и призмой, как показано на рис. 1.1 . В при зме свет разделяется на компоненты по длинам волн, которые затем определ яются оптическим рецептором. Точно так же, в масс-спектрометре сгенериро ванные ионы разделяются в анализаторе массы, подсчитываются и определя ются в детекторе ионов (таких, как, например, электронный умножитель). Принципиальное устройство масс-спектрометра Четыре базовых компонента являются стандартными для большей части масс-спектрометров ( рис. 1.2 ): система ввода образца, устройство иониза- ции, анализатор массы и детектор ионов. Некоторые приборы комбинируют ввод образца и ионизацию, в других объединены анализатор ма ссы и детектор. Однако все молекулы образца претерпевают одинаковые воз действия независимо от конфигурации прибора. Молекулы образца вводятс я через систему впуска. Попав внутрь прибора, молекулы преобразуются в и оны в устройстве ионизации, а затем электростатически переносятся в ана лизатор массы. Ионы затем разделяются соответственно их m / z . Д етектор преобразует энергию ионов в электрические сигналы, которые зат ем поступают в компьютер. Способы ввода образца Ввод образца был одной из первых проблем в масс-спектроме трии. Для проведения анализа масс образца, который первоначально находи тся при атмосферном давлении (760 Торр), он должен быть введён в прибор таким образом, чтобы вакуум внутри последнего остался практически неизменны м (~10 -6 Торр). Основными методами ввода образц а являются прямое введение зонда или подложк и, обычно используемое в MALDI - MS , или прямое вливание или впрыскивание в устройство ионизации, как в методе ESI - MS . [1] Прямое введение : использование прямого введения зонда/подложки ( ри с. 1.3 ) – очень простой способ доставки образца в прибор. Обр азец сначала размещается на зонде, а затем вводится в ионизационную зону масс-спектрометра, обычно через вакуумный клапан. Образец после подверг ается необходимым процедурам десорбции, таким как лазерная десорбция и ли прямое нагревание, чтобы обеспечить испарение и ионизацию. Прямое вливание или впрыскивание : простой капилляр или капиллярная колонка используется д ля помещения образца в газообразной форме или в растворе. Прямое вливани е также удобно, потому что оно позволяет эффективно вводить малые количе ства вещества в масс-спектрометр без нарушения вакуума. Капиллярные кол онки обычно используются для разграничения систем разделения и устрой ства ионизации масс-спектрометра. Эти системы, включая газовую хроматог рафию (ГХ) и жидкостную хроматографию (ЖХ), также служат для разделения раз личных компонентов раствора, важных для анализа масс. В газовой хроматог рафии разделение различных компонентов происходит в стеклянной капилл ярной колонке. Как только пары образца покидают хроматограф, они направл яются прямиком в масс-спектрометр. В 1980-х годах невозможность совместного использования жидк остной хроматографии (ЖХ) с масс-спектрометрией была обусловлена, больше й частью, неспособностью устройств ионизации справляться с непрерывны м по- током ЖХ. Однако, ионизация электроспрея ( ESI ), химическая ионизация при атмосферном да влении ( APCI ) и фотоионизация при атмо сферном давлении ( APPI ) сейчас позвол яют совмещать ЖХ и масс-спектрометрию в повседневных анализах. Механизмы иони зации Протонирование – механизм ионизации, при котором к молекуле прис оединяется протон, сообщая ей заряд 1+ на каждый присоединённый протон. По ложительные заряды обычно локализуются на основных частях молекулы, та ких, как амины, с образованием стабильных катионов. Пептиды часто ионизи руются при помощи протонирования. Протонирование осуществляется при MALDI , ESI и APCI . Депротонирование – механизм ионизации, при котором отрицательный заряд 1- п олучается при отрыве протона от молекулы. Такой механизм ионизации обыч но осуществляется при MALDI , ESI и APCI и очень полезен для определения кислотных образцов, включая фенолы, карбо новые кислоты и сульфоновые кислоты. Спектр отрицательных ионов сиалов ой кислоты показан на рис 1.2 . Катионизация – механиз м ионизации, в котором заряженный комплекс образуется при координацион ном присоединении положительно заряженного иона к нейтральной молекул е. В принципе, пртонирование тоже подпадает под это определение, поэтому катионизацией считается присоединение иона, отличного от протона, напр имер щелочного металла или аммония. Кроме того, катионизация применима к молекулам, которые неспособны к протонированию. Связь катионов, в отлич ие от протонов, с молекулой менее ковалентна, поэтому заряд остаётся лок ализован на катионе. Это минимизирует размывание заряда и фрагментацию молекулы. Катионизация также может быть произведена при MALDI , ESI и APCI . Углеводы – лучшие вещества для т акого механизма ионизации, с Na + как обычным присоединённым катионом. Прямой перенос заряженной молекулы в газовую фа зу Перенос соединений, уже заряженных в растворе, легко дост игается при использовании десорбции или выбрасыванием заряженных част иц из конденсированной фазы в газовую. Обычно это осуществляется с испол ьзованием MALDI или ESI . Отрыв электрона Как видно из названия механизма, отрыв электрона придаёт молекуле 1+ положительный заряд при выбивании электрона, так что при этом часто образуются катион-радикалы. Наблюдаемый, в основном, при электронн ой ионизации, отрыв электрона обычно применяется для относительно непо лярных соединений с низкой молекулярной массой. Также известно, что он ч асто приводит к образованию значительных количеств фрагментарных ионо в. Захват электрона При захвате электрона, отрицательный заряд 1- сообщается м олекуле при присоединении электрона. Этот механизм ионизации в первую о чередь наблюдается для молекул с большим сродством к электрону, таких ка к галогенсодержащие соединения. Таблица 1.1 . Механизмы ионизации, их преимущества и недост атки . Механизм ионизации Преимущества Недостатки Протонирование (положительные ионы) · многие соединения присоединяют протон с получением заряда · многие способы ионизации, такие, как ESI , APCI , FAB , CI и MALDI производят такие частицы · многие соединения нестабильны в пр отонированной форме (например, углеводы) или с трудом присоединяют прото н (например, углеводороды) Катиониза ция (положительные ионы) · многие соед инения присоединяют катион, такой как Na + или K + с получением заряда · многие способы ионизации, такие, как ESI , APCI , FAB и MALDI производят такие частицы · опыты тандемной масс-спектрометрии на катионизированных молекулах часто даю т очень ограниченную информацию по фрагментации Депротонирование (отрицательные ионы) · многие полезные вещества в какой-то мере являются ки слотами · многие способы ионизации, такие, как ESI , APCI , FAB и MALDI производят такие частицы · приме нимо только для специфических соединений Перенос заряженных молекул в газовую фазу (положительные и отрицательные ионы) · полезно для соединений, которые уже заряжены · многие способы ионизации, такие, как ESI , APCI , FAB и MALDI производят такие частицы · приме нимо только для уже заряженных частиц Отрыв электрона (положительные ионы) · наблюдается при электронной ионизации и даёт информацию н е только о молекулярной массе, но и информацию о фрагментарных ионах · часто производит слишком сильную ф рагментацию · может быть непонятно, является ли ио н с наибольшей массой молекулярным ионом или же фрагментом Захват электрона (отрицательные ионы) · наблюдается при электронной иониза ции и даёт информацию не только о молекулярной массе, но и информацию о фр агментарных ионах · часто произ водит слишком сильную фрагментацию · может быть непонятно, является ли ио н с наибольшей массой молекулярным ионом или же фрагментом Способы ионизации Вплоть до 1980-х электронная ионизация ( EI ) была основным способом ионизации для ана лиза масс. Однако EI ограничивала хи миков и биохимиков малыми молекулами, масса которых намного ниже массы б ольшинства биоорганических соединений. Это ограничений побудило таких учёных, как Дж. Б. Фенн, К. Танака, Ф. Хилленкамп, М. Карас, Г. Кукс и М. Барбер, раз работать новое поколение способов ионизации, включая бомбардировку бы стрыми атомами/ионами ( FAB ), лазерную ионизацию при помощи матрицы ( MALDI ) и и онизацию электроспрея ( таблица 1.2 ). Эти спос обы совершили революцию в биомолекулярном анализе, особенно для больши х молекул. Среди них, ESI и MALDI стали по-настоящему «избранными», когда д ело касается биомолекулярного анализа. Таблица 1.2. Способ ионизации Аббревиатура События Ионизация электроспрея ESI испарение заряженных капель Ионизация наноэлектроспрея nanoESI Химическая ионизац ия при атмосферном давлении APCI коронный разряд и перенос протона Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы MALDI поглощение фотона/перенос протона Десорбция/ионизация на кремнии DIOS Бомбардировка быстрыми атомами/ионами FAB десорбция иона/перенос протона Электронная ионизация EI пучок электронов/перенос электрона Химическая ионизация CI перенос протона MALDI и ESI сейчас явл яются самыми распространёнными способами ионизаций для биомолекулярн ой масс-спектрометрии, с их превосходными диапазонами масс и чувствител ьностью ( рис. 1. 3 ). Сл едующий раздел будет посвящён основам способов ионизации, рассматрива я некоторые детали в практических аспектах их применения наряду с механ измами ионизации. Ионизация электроспрея ( ESI ) Идея электроспрея, хоть и не нова, была возрождена в связи с её настоящим применением к биомолекулам. Первые эксперименты с электр оспреем были проведены Чепменом в поздних 1930-х, а практическое развитие и онизации электроспрея для масс-спектрометрии было завершено Доулом в п оздних 1960-х. Доул также открыл важное явление множественной зарядки молек ул. Работы Фенна окончательно привели к современной технике ионизации э лектроспрея в масс-спектрометрии и её применению для биологических мол екул. Суть ESI заключается в следующем. Электрическое напряжение на игле при водит к большому электрическому градиенту на жидкости, который разделя ет заряды на поверхности. Это вынуждает жидкость выпячиваться с иглы в ф орме конуса Тейлора. Верхушка конуса вытягивается в нить до тех пор, пока не достигнет предела Рэлея, при котором поверхностное натяжение и элект ростатическое отталкивание сравняются и сильно заряженная капля не от орвётся от нити. Капли, которые оторвались от конуса, притягиваются к вхо ду в масс-спектрометр из-за большой разности потенциалов между иглой и в ходом в масс-анализатор. По мере продвижения капли к анализатору кулонов ское отталкивание на поверхности превосходит поверхностное натяжение и капля «взрывается», окончательно высвобождая ионы. [3] Ионизация электроспрея – метод, который обычно применяе тся для пептидов, белков, углеводов, малых олигонуклеотидов, синтетическ их полимеров и липидов. ESI производи т газообразные заряженные молекулы прямо из жидкого раствора. Ионизаци я происходит при создании тонкого спрея сильно заряженных капель в прис утствии электрического поля. Образец раствора распыляется из области с сильным электрическим полем на конце металлической форсунки, поддержи ваемой при потенциале между 700 и 5000 В. Форсунка (или игла), к которой приложен потенциал, служит для распыления раствора в тонкий спрей заряженных кап ель. Использование сухого газа, нагревания или оба этих способов применя ется к заряженным каплям при атмосферном давлении для испарения из них р астворителя. С уменьшением размера капель возрастает плотность заряда на их поверхности. Взаимное кулоновское отталкивание между одинаковым и зарядами на этой поверхности становится настолько велико, что превосх одит силы поверхностного натяжения и ионы вырываются из капли через «ко нус Тейлора» - рис. 1.5 . Другая возможность сос тоит в том, что капля взорвётся, высвобождая ионы. В любом случае свободны е ионы направляются в канал через электростатические «линзы», направля ясь в вакуум масс-анализатора. Так как ESI включает в себя непрерывную подачу раствора, он применим для испо льзования совместно с ВЭЖХ или капиллярным электрофорезом. [4] Ионизация электроспрея благоприятствует образованию е динично заряженных малых молекул, но также хорошо известно образование в ходе неё многократно заряженных экземпляров больших молекул. Это важн ое явление, т.к. масс-спектрометр измеряет отношение массы к заряду ( m / z ) и поэтому многократная зарядка делает возможным наблюдать очень большие молекулы при помощи инструмента с относительно малым диапазон ом масс. К счастью, программы, пригодные для всех масс-спектрометров с эле ктроспреем, позволяют произвести вычисления молекулярной массы, необх одимые для определения действительной массы многозарядных образцов. Рис. 1.6 и 1.7 пока зывают различные заряженные состояния двух различных белков, где кажды й пик в масс-спектрах может быть соотнесён с различными зарядовыми состо яниями молекулярного иона. Многократная зарядка имеет другие важные пр еимущества в тандемной масс-спектрометрии. Одно из преимуществ состоит в том, что после фрагментации вы наблюдаете больше фрагментарных ионов о т многозарядного предшественника, чем от однозарядного. Многократная зарядка: белок с массой 10000 дальтон и его теоре тический масс-спектр с зарядами до +5 показаны на рис. 1.8 . Масса белка остаётся такой же в то время, как отношение m / z меняется в зависимости от числа зарядов на белке. Ионизация белка есть обычно результат протонирования, что не только добавляет заряд, но также увеличивает массу белка на число добавленных протонов. Это действ ие на m / z применимо одинаково для любого механизма ионизации молекулы, образовавшего положительно или отрицательно заряж енный молекулярный ион, включая присоединение или отрыв несущих заряд ч астиц, отличных от протона (например, Na + и Cs + ). Многократные положительные заряды наблюдаются для белков, в то время как для олигонуклеотидов типично образование отрицательных з арядов (с ESI ). Хотя масс-спект рометры электроспрея снабжены программами, которые подсчитывают молек улярный вес, понимание, как компьютер производит эти вычисления для мног ократно-заряженных ионов полезно. Уравнения 1.1 – 1.5 и рис. 1.9 представляют простое объяснение, где мы принимаем, что пи ки p 1 и p 2 являются соседними и различаются одним зарядом, что эквивален тно добавлению одного протона. p = m/z p1 = (Mr + z1)/z1 p2 = Mr + (z1 - 1) /(z1 - 1) (1.1) (1.2) (1.3) p – пик в масс-спе ктре m – общая масса иона z – полный заряд Mr – средняя масса белка p 1 – значение m / z для p p – значение m / z для p z – за ряд для пика p Уравнения 1.2. и 1.3. могут б ыть решены для двух неизвестных, Mr и z . Для пиков в масс-спектре миоглобина, показанном на рис. 1.9 , p =1542, p =1696. 1542 z = Mr + z 1696 ( z - 1) = Mr + ( z - 1) Решив два уравнения, находим : Mr = 16,951 Da для z = 11 (1.4) (1.5) Растворители для электроспрея Многие растворители могут быть использованы в ESI и выбираются в зависимости от раст воримости исследуемых соединений, летучести растворителя и способност и растворителя к отдаче протона. Обычно, основными являются протонные ра створители, такие, как, метанол, 50/50 метанол/вода или 50/50 ацетонитрил/вода, в то время как апротонные сорастоврители, такие, как 10% ДМСО в воде, а также изоп ропиловый спирт, используются, чтобы улучшить растворимость для некото рых соединений. Хотя 100% вода и используется в ESI , её относительно низкое давление пара является определ яющим фактором чувствительности; лучшая чувствительность получается п ри добавлении летучего органического растворителя. Некоторые соединен ия требуют использования чистого хлороформа с добавлением 0.1% муравьино й кислоты для обеспечения ионизации. Такой подход, хоть и менее чувствит ельный, может быть эффективен для соединений, не растворимых другим обра зом. [5] Буферы, такие, как Na + , K + , фосфат и соли представляют проблему для ESI из-за снижения давления пара капе ль, ведущего к ослаблению сигнала из-за увеличения поверхностного натяж ения капель, ведущего к уменьшению летучести. Поэтому летучие буферы, та кие, как ацетат аммония, могут быть использованы более эффективно. [6] Таблица 1.3. Преимущества и недостатки ионизации электроспрея ( ESI ) Преимущества Недостатки § практический диапазон масс до 70000 дальтон § хорошая чувствительность от фемтомоль до нескольких пикомоль обычно § самый мягкий метод ионизации, способный генерировать нековалентные комплексы в газовой фазе § легко адаптируется к жидкост ной хроматографии § легко адаптируется к тандемн ым масс-анализаторам, таким, как ионные ловушки и тройные квадрупольные инструменты § многократная зарядка позволяет п роизводить анализ ионов с высокой массой на приборах с относительно низ ким m / z диапазоном. § нет помех от матрицы § присутствие солей и веществ, образующих ионные пары, как, н апример, ТФА может уменьшить чувствительность § сложные смеси могут уменьшит ь чувствительность § одновременный анализ смеси м ожет быть неудовлетворительным § многократная зарядка может б ыть запутанной, особенно при анализе смесей § важна чистота образца § перенос от образца к образцу Устройство прибора ионизации электроспрея Неосевая конфигурация ESI , которая сейчас используется во многих приборах для введени я ионов в анализатор (как показано на рис. 1.10 ), показала себя очень эффективной при использовании с большим по током жидкости. Основное преимущество такой конфигурации состоит в том, что скорость потока может быть увеличена без засорения или закупориван ия входного отверстия. Неосевое распыление важно, потому что вход в анал изатор более не насыщается растворителем, тем самым предохраняя капли о т попадания во входное отверстие и его загрязнения. Наоборот, только ион ы направляются ко входу. Это делает ESI ещё более совместимым с ЖХ при скоростях до мл/мин. Ионизация наноэлектроспрея ( nanoESI ) Электроспрей низкого потока, впервые описанный Вильмо м и Манном, называли наноэлектроспреем, наноспреем и микроэлектроспрее м. Такой способ ионизации является вариацией ESI , в которой игла спрея сделана очень маленькой и расположена близко к о входу в масс-анализатор (рис. 1.11). Конечным результатом такой простой корр ектировки становится увеличение эффективности, которое включает умень шение необходимого количества образца. Скорости потока для nanoESI обычно составляют ль десятков до сотен н анолитров в минуту. Чтобы получить такие малые скорости потока, nanoESI использует источники из вытянутого и, в н екоторых случаях, металлизированного стекла или плавленого кварца с ма лым входным отверстием (~ 5 мкм). Растворённый образец вносится в источник и к его концу прикладывается давление порядка 2 атм. Вытекание образца с о чень малой скоростью позволяет достигать высокой чувствительности. Та кже, источники расположены очень близко ко входу в масс-анализатор, поэт ому перенос ионов в масс-анализатор намного более эффективен. Например, анализ 5 mM раствора пептида при помо щи nanoESI займёт одну минуту, употребив ~50 фемтомоль образца. Такой же эксперимент с обычным ESI за то же время израсходует 5 пикомоль, т.е. в 100 раз больше, чем nanoESI. К тому же, так как капли для nanoESI обычно меньше, чем для обычного ESI ( рис. 1.11 .), необходимое для обра зования ионов испарение намного меньше. Следовательно, nanoESI менее чувствительно к солям и другим при месям, т.к. меньшее испарение означает, что примеси не будут концентриров аться так сильно, как при ESI . [7] Химическая ионизация при атмосферном давлении ( APCI ) APCI также стала важным способом иони зации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора и спос обна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и в электр оспрее, поток жидкости для APCI ( рис. 1.12 ) вытекает непосредственно в устройство ио низации. Однако сходство здесь заканчивается. Капли не заряжают ся и APCI устройство содержите на гретый испаритель, который обеспечивает быстрое разделение/испарение капель. Молекулы образца в паре проходят через зону ионно-молекулярной р еакции при атмосферном давлении. В APCI ионизация возникает из-за возбуждения/ионизации растворителя ко ронным разрядом. Т.к. ионы растворителя существуют при атмосферном давле нии, химическая ионизация молекул аналита очень эффективна; при атмосфе рном давлении молекулы аналита сталкиваются с ионами реагента очень ча сто. Перенос протона (для реакций протонирования MH + ) образует положительные ионы, а перенос электрона или отщепление протона ([ M - H ] - ) даёт отрицательные. Сглаживающее влияние сольватных оболочек на ионах реагента и высокое давление газа уменьшают фрагментацию во время ионизации и ведут к образованию практически только нетронутых молекул ярных ионов. Многократная зарядка обычно не наблюдается, скорее всего, п отому что процесс ионизации более энергичен, чем при ESI . [8] Фотоионизация при атмосферном давлении ( APPI ) Фотоионизация при атмосферном давлении ( APPI ) стала сейчас важным способом ионизац ии, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора с относит ельно малым фоновым сигналом и способна к анализу относительно неполяр ных соединений. Так же, как и APCI , п оток жидкости для APPI ( рис. 1.13 ) вводится прямо в устройство ионизации. Основное различие между APCI и APPI состоит в том, что в APPI парообразный образец проходит через ультрафиолетовый свет (обычная криптоновая лам па испускает от 10.0 эВ до 10.6 эВ). Часто APPI является намного более чувствительным, нежели ESI или APCI и показывает б олее высокое соотношение сигнал/шум из-за более низкой ионизации фона. Н изкий сигнал фона во многом обусловлен высоким потенциалом ионизации с тандартных растворителей, таких, как метанол и вода (10.85 и 12.62 эВ, соответстве нно), которые не ионизируются криптоновой ла мпой. Недостатком ESI и APCI я вляется то, что они образуют фоновые ионы растворителей. В дополнение к э тому, ESI особенно подвержен эффекта м подавления ионов, а APCI требует исп арения при температурах 350-500° C , что м ожет вызвать термическое разложение. APPI производит ионизацию двумя механизмами. Первый – простое фотовозбуждение, иниции рующее испускание электрона с образованием молекулярного катион-радик ала ( M + ). APPI устройство воздействует светом с энерги ей выше, чем потенциалы ионизации (ИП) большинства целевых молекул, но ниж е, чем ИП для большинства молекул растворителей и воздуха, тем самым искл ючая их как помехи. К тому же, из-за малой избыточной энергии, сообщаемой м олекулам, достигается минимальная фрагментация. Второй механизм – фотоиндуцированная химическая иониз ация при атмосферном давлении, которая похожа на APCI в том, что она включает перенос заряда при протонировани и ( MH + ) или потере про тона ([ M - H ] - ). Для инициирования химической ионизации фотоионизирующ ийся реагент добавляется к элюенту. После фотоионизации реагента проис ходит перенос заряда на аналит. Типичными реагентами для положительной ионизации являются ацетон и толуол. Ацетон также служит реагентом для от рицательной ионизации. Механизм ионизации ( M + или [ M + H ] + ), которы й претерпевает молекула, зависит от сродства к протону аналита, раствори теля и типа используемого дополнительного реагента. [9] Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы ( MALDI ) Масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией при помощи матрицы ( MALDI - MS ) впервые была использована в 1988 году Танако й, Карасом и Хилленкампом. С тех пор он стал широко распространённым мето дом для пептидов, белков и большинства других биомолоекул (олигонуклеот идов, углеводов, природных веществ и липидов). Эффективный и направленны й перенос энергии во время акта индуцированной лазером десорбции при по мощи матрицы приводит к большому выходу ионов незатронутого аналита и п озволяет проводить измерения соединений с субпикомолярной чувствител ьностью. Вдобавок, удобство MALDI для а нализа гетерогенных образцов делает его очень привлекательным для мас с-анализа сложных биологических образцов, как, например, гидролизат белк ов. Хотя точный механизм десорбции/ионизации для MALDI неизвестен, принято считать, что MALDI вызывает ионизацию и перевод образца из к онденсированной фазы в газовую посредством лазерного возбуждения и ин дивидуализации молекул образца из матрицы (рис. 1.14). В MALDI анализе аналит сначала сокристаллизует ся с большим молярным избытком матричного соединения, обычно УФ-поглоща ющей слабой органической кислотой. Облучение такой смеси аналита с матр ицей лазером приводит к испарению матрицы, которая несёт аналит в себе. М атрица играет ключевую роль в этом методе. Сокристаллизованные молекул ы образца также испаряются, но без прямого поглощения энергии лазера. Мо лекулы, чувствительные к лазерному излучению, поэтому защищены от прямо го возбуждения УФ-лазером. Матрица MALDI – нелетучий твёрдый материал, обеспечивающий процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения. Как результат, и матрица, и любой образец, встроенный в неё, испаряются. Матриц а также служит для того, чтобы минимизировать ущерб образцу от лазерного излучения, поглощая большую часть падающей энергии. Оказавшись в газовой фазе, десорбированные заряженные мо лекулы затем электростатически направляются из MALDI устройства ионизации в масс-анализатор. Времяпролётны е ( TOF ) масс-анализаторы часто исполь зуются для разделения ионов по отношению массы к заряду ( m / z ). И мпульсная природа MALDI очень удобна для TOF анализаторов, т.к. начальный м омент времени можно засекать как момент лазерного импульса. Было разработано несколько теорий для объяснения десорб ции посредством MALDI . Модель термиче ских пиков предполагает, что выброс неповреждённых молекул обусловлен слабым колебательным взаимодействием между матрицей и аналитом, что ми нимизирует перенос колебательной энергии от матрицы к модам молекул ан алита, тем самым минимизируя фрагментацию. Теория импульсного давления предполагает, что создаётся градиент давления, перпендикулярный повер хности, и десорбция больших молекул вызвана передачей импульса при их ст олкновениях с быстро движущимися молекулами матрицы. Обычно считается, что ионизация происходит посредством передачи протона или катионизаци и во время процесса десорбции. Полезность MALDI для ан ализа биомолекул основана на её способности давать информацию о молеку лярном весе неповреждённых молекул. Способность давать точную информа цию может быть чрезвычайно важна для определения и характеристики белк ов. Например, белок часто может быть однозначно определён точным анализо м масс составляющих его пептидов (полученных химическим или же фермента тивным воздействием на образец). [4] Таблица 1.4. Преимущества и н едостатки метода лазернойдесорбции/ионизации при помощи матрицы (MALDI) . Преиму щества Недостатк и § практический диапазон масс до 300000 Da . Экземпляры со значительно большей массой наблюдались при помощи детектора высокого тока; § обычная чувстви тельность порядка нескольких фемтомоль или даже пикомоля. Возможна чув ствительность до аттомоля; § мягкая ионизаци я с малой фрагментацией; § нечувствителен к солям в ко нцентрациях до миллимолярных; § удобен для анализа сложных смесей § фон матрицы, который может быт ь проблемой для соединений с массой ниже 700 дальтон. Помехи этого фона сил ьно зависят от материала матрицы; § возможно фоторазложение пр и лазерной десорбции/ионизации; § кислотные матрицы, использу емые в MALDI могут вызывать разложение некоторых соединений Приготовление об разца и матрицы ок азывает значительное вл ияние на качество ма сс - спектров MALDI белков и пептидов ( рис . 1.15 ). Среди большого ра знообразия известных методов пр иготовления наиболее часто уп отребляемым является метод вы сушенной ка пли . В этом случае насыщенный ра створ матрицы смешивается с раствором аналита так , чт обы соотношение ма трицы к аналиту бы ло около 5000:1. Аликвота (0.5-2.0 мкл ) та кой смеси затем по мещается на место об разца , где затем вы сушивается . Ниже приведена ме тодика такого приготовления : · отобрать пипеткой 0.5 мкл образца на подложку; · отобрать пипеткой 0.5 мкл матрицы на подложку; · перемешать образе ц и матрицу втягиванием их в пипетку и выпусканием; · позволить высо хнуть на воздухе. § Для пептидов, небольших белков и большинства других соеди нений: насыщенный раствор б -циано-4-гидрок сикоричной кислоты в 50:50 ацетонитрил:вода с 0.1% ТФА. § Для белков и друг их тяжёлых молекул: насыщенный раствор синапиновой кислоты в 50:50 ацетонит рил:вода с добавлением 0.1% ТФА. § Для гликопептидо в/белков и маленьких соединений: насыщенный раствор 2,5-дигидроксибензо йной кислоты ( DHB ) в 50:50 ацетонитрил:вод а. Рис. 1.15. Обычно используемые в MALDI матрицы и подложка для MALDI с показанным располо жением матрицы. Одним из преимуществ MALDI является то, что множество образцов может быть подготовлено в одно и то же время, как видно по этой многообразцовой подложке. Также образцы могут быть приготовлены последовательным способом. В тонкослойном методе сначала на цель наносится гомогенная «п лёнка» матрицы, а затем туда добавляется образец, который абсорбируется ей. Этот метод даёт хорошую чувствительность, разрешающую способность и точность определения. Аналогично, в толстослойном методе нитроцеллюло за ( NC ) используется как добавка к ма трице. После образования единого слоя NC -матрица на цели добавляется образец. Этот метод приготовления пре дотвращает образования щелочных аддуктов и значительно увеличивает чу вствительность определения, особенно для пептидов и белков, экстрагиро ванных из гелей. Сэндвичевый метод – другой вариант в этой категории. То нкий слой кристаллов матрицы приготовляется как в тонкослойном методе, затем последовательно добавляются капли ( a ) водного 0.1% ТФА, ( b ) образца и ( c ) матрицы. Десорбция/ионизация на кремнии ( DIOS ) DIOS – свободный от матрицы метод, ко торый использует импульсную десорбцию/ионизацию на кремнии ( рис. 1.16 ). Поверхности структурированного кремния, та кого, как пористый кремний или кремниевое нановолокно являются УФ-погло щающими полупроводниками с большой площадью поверхности (сотни м 2 /см 3 ). При примене ния в масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией, строение стр уктурированного кремния обеспечивает каркас для накопления молекул ра створителя и аналита, а поглощение УФ даёт механизм для передачи энергии лазера аналиту. Такая удачная комбинация свойств позволяет DIOS быть применимым для большого разнообраз ия биомолекул, включая пептиды, углеводы и небольшие органические соеди нения различных типов. В отличие от других прямых безматричных методов д есорбции DIOS позволяет проводить де сорбцию/ионизацию с малым разложением аналита или вообще без него. DIOS сильно связ ан с MALDI . Оборудование для DIOS - MS тр ебует только незначительной настройки для использования в MALDI ; чип просто закрепляется на обработанной MALDI -подложке и вставляется в масс-сп ектрометр. Та же длина волны лазера (337 НМ), обычно применяемая в MALDI , подходит и для DIOS . Хотя DIOS сравним с MALDI в отношении чувствительности, у н его есть несколько преимуществ из-за отсутствия мешающей матрицы: низки й фон на малых диапазонах массы, такое же размещение водных образцов, упр ощённая подготовка образцов. Вдобавок, компоновка в чипах легко адаптир уется к автоматической подготовке образца, при которой лазер быстро обр абатывает чип, переходя от одного участка к другому. DIOS может, таким образом, ускорить и упростить крупные анализы соединений с низкой молекулярной массой, так же, как MALDI для макромолекул. Так как массы мног их низкомолекулярных соединений могут быть легко измерены, DIOS - MS пр именим для анализа превращений малых молекул, как ферментативных, так и химических. [3] Бомбардировка быстрыми атомами/ионами ( FAB ) Бомбардировка быстрыми атомами/ионами, или FAB – метод ионизации, схожий с MALDI , так как в нём используется матрица и пучо к высокоэнергетических частиц для десорбции ионов с поверхности. Важно, однако, обозначить различия между MALDI и FAB . В MALDI , энергетический пучок представляет собой импульсный л азерный свет, в то время как FAB испол ьзует непрерывный пучок ионов. В MALDI матрица обычно твёрдая кристаллическая, а в FAB обычно использует жидкую матрицу. Также нужно отметить, что FAB примерно в 1000 раз менее чувствител ен, нежели MALDI . Бомбардировка быстрыми атомами – м ягкий способ ионизации, который требует пря мого введения зонда для подачи образца и пучок нейтральных атомов Xe или ионов Cs + для распыления образца и матрицы с поверхност и зонда для подачи. Обычно в FAB спект ре обнаруживаются ионы матрицы, наряду с протонированными или катиониз ированными (например, M + Na + ) молекулярными ионами ана лита. Матрица FAB . Способст вующая процессам десорбции и ионизации, матрица FAB – нелетучая жидкость, которая служит, чтобы постоянно в осполнять поверхность новым образцом по мере того, как он бомбардируетс я пучком ионов. Поглощая большую часть падающей энергии, матрица также м инимизирует разложение образца из-за высокоэнергетических частиц обра зца. Две наиболее часто употребляющихся матрицы для FAB – м -нитробензиловый спирт и глицерин. Быстрые атомы или ионы сталкиваются с матрицей, вынуждая матрицу и аналит десорбироваться в газовую фазу. Об разец может быть уже заряженным и только потом быть переведённым в газов ую фазу, или же может стать заряженным в ходе десорбции посредством FAB посредством реакций с окружающими мол екулами или ионами. Оказавшись в газовой фазе, заряженные молекулы могут быть электростатически перемещены в масс-анализатор. [1] Электронная ионизация ( EI ) Электронная ионизация – один из наиболее важных спосо бов ионизации для повседневных анализов малых гидрофобных термически стабильных молекул и до сих пор широко используется. Так как EI обычно даёт большое число фрагментар ных ионов, это «жёсткий» способ ионизации. Однако, фрагментарная информа ция также может быть очень полезной. Например, используя базы данных, сод ержащие свыше 200000 масс-спектров электронной ионизации, возможно определи ть неизвестное соединение в течение нескольких секунд (конечно, если оно есть в базе данных). Эти базы данных, а также объём памяти и поисковые алго ритмы современных компьютеров позволяет быстро просматривать такие ба зы (как, например, база NIST ), таким о бразом значительно облегчая идентификацию малых молекул. Устройство электронной ионизации п рямолинейно ( рис. 1.18 ). Образец должен поставл яться в газообразной форме, что осуществляется «выкипанием» образца по средством термической десорбции или введением газа через капилляр. Кап илляр часто является выходом капиллярной колонки прибора газовой хром атографии. В этом случае капиллярная колонка обеспечивает разделение (э то также известно как газовая хромат-масс-спектрометрия – GC / MS ). Де сорбция твердых или жидких образцов производится нагреванием в вакуум е масс-спектрометра. После перехода в газовую фазу соединения переносят ся в устройство электронной ионизации, где электроны возбуждают молеку лу, тем самым вызывая ионизацию отрывом электрона и фрагментацию. Применимость электронной ионизации значительно уменьш ается для соединений с молекулярной массой свыше 400 дальтон, потому что не обходимая термическая десорбция образца ведёт к температурному разлож ению до того, как происходит испарение. Принципиальными проблемами, связ анными с термической десорбцией при электронной ионизации являются 1) не летучесть больших молекул, 2) термическое разложение, 3) избыточная фрагме нтация. Механизм отрыва электрона при образовании положительно го иона осуществляется следующим образом: · Образец термически испаряется . · Электроны испускаются нагретым катодом и ускоряются электрическим полем с разностью потенциалов в 70 В, ч тобы образовать непрерывный пучок электронов. · Молекулы образца проходят чер ез пучок электронов. · Электроны с кинетической энерги ей 70 эВ передают часть своей энергии молекулам. Эта передача вызывают ион изацию (отрыв электрона) так, что ион сохраняет обычно не более 6 эВ избыто чной энергии. · Избыток внутренней энергии (6 эВ) в молекуле ведёт к некоторой фрагментации. Электронный захват обычно нам ного менее эффективен, чем отрыв электрона, хотя иногда используется так им же способом, с высокой чувствительностью работая для соединений с бол ьшим сродством к электрону: M + e -
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Собрались Меркель и Олланд лететь на переговоры с Путиным по Украине. Олланд уже давно в самолете сидит, а Меркель все нет и нет. Наконец, она прибегает, вся такая запыхавшаяся. Олланд ей говорит:
- Перед тем как лететь, я зашел в Собор Дома Инвалидов в Париже, чтобы у гробницы Наполеона спросить у великого императора совет, как вести переговоры с русскими.
- А я весь Берлин оббегала, но могилу Гитлера так и не нашла.
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, курсовая по химии "Масс-спектрометрический метод анализа", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru