Курсовая: Клонирование и анализ генов стерляди - текст курсовой. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Курсовая

Клонирование и анализ генов стерляди

Банк рефератов / Медицина и здоровье

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Курсовая работа
Язык курсовой: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Microsoft Word, 375 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникальной курсовой работы

Узнайте стоимость написания уникальной работы

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНОВ ЛЕГКИХ ЦЕ ПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ СТЕРЛЯДИ . ВВЕДЕНИЕ В основе функционирования гуморального иммунитета у млекопитающих лежит сложный комп лекс молекулярно-генетических и физиологических м еханизмов , обеспечивающих реорганизацию , мутагенез и клональную экспрессию генов иммуноглобулинов . Возникновен ие этой подсистемы иммунитет а связывают с появлением хрящевых рыб . На ранних этапах эволюции гены ИГ были организованы в виде повторяющихся кла стеров V-J-C генных сегментов . При подобной органи зации разнообразие продуцируемых антител основыв алось , прежде всего , на количестве имевши хся в геноме кластеров , каждый из которых кодировал один вариант полипептидных субъеди ниц ИГ . В ходе дальнейшей эволюции произош ел переход от кластерной к сегментарной о рганизации , обеспечивающей дополнительный источник разнооб р азия за счет комбинативной рекомбинации генных сегментов . Предполагается , что этот переход также имел важное зна чение для регуляции экспрессии генов и ос уществления механизмов клонального отбора антите лопродуцирующих клеток в ходе иммунного ответ а. Настоя щая работа представляет собой часть проекта , направленного на изучение эволюции механизмов изотипического исключения ге нов легких цепей ИГ у низших позвоночных . Целями работы являлись изучение структуры и организации генов легких цепей ИГ ст ерляди (Acipen s er ruthenus), представителя филогенетическ и древней группы костно-хрящевых рыб . СТРОЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Иммуноглобулины выполняют в организме п озвоночных функцию гуморальных антител и анти ген-связывающих рецепторов В-лимфоцитов . Особенностью этого класса белков является огромное разнообразие , позволяющее им вступать во взаимодействие с фактически любыми биологическим и макромолекулами. Типичная молекула ИГ состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух идентичных ле гких (L) полипептидных цепей . H- и L-цепи по строены из нескольких доменов , каждый из к оторых состоит примерно из 110 аминокислотных ос татков . У млекопитающих существует пять класс ов H-цепей : , m, , , и . Каждая H-цепь построена из одного N-концевого и нес кольких (трех или четырех ) C-концевых доменов . N-концевые домены различаются в разных моле кулах и называются вариабельными (V) доменами . C-к онцевые домены имеют одинаков ую структуру у молекул одного класса и называются константными (С ) доменами (Пол , 1987). Среди L-цепей млекопитающих различают два типа : лямбда и каппа . Каждая L-цепь сос тоит из одного вариабельного и одного кон стантного доменов . В индивидуальной молекуле ИГ присутствует только один тип L-це пи (Roitt et al., 1993). Гигантское разнообразие ИГ обеспечивается прежде всего тем , что V и C области кодиру ются разными генами (генными сегментами ), физич ески разнесенными в зародышевой ДНК. В формировании вариабельн ых доменов H-цепей участвуют три генных сегмента : вар иабельный (V), D-сегмент (от англ . diversity- разнообразие ) и J-сегмент (от англ . joining- соединяющий ). С-области Н-цепей разных классов кодируются отдельными генами (Roitt et al., 1993). В формировани и зрелого гена L-цеп и участвуют три генных сегмента : V-сегмент и J-сегмент кодируют V-домен , C-сегмент кодирует константный домен . На поздних стадиях разви тия В-лимфоцита генные сегменты , кодирующие ва риабельные домены , объединяются в различных с очетаниях, образуя матрицу для экспрессии L- и H-цепей (Seidman et al., 1979; Durdik et al., 1984). ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ Различные виды млекопитающих имеют сход ную схему организации и экспрессии генов ИГ . Одним из на иболее изученных в этом отношении видов является человек . Лямбда и каппа цепи ИГ у человека кодируютс я генами , расположеными в разных локусах и на разных хромосомах . Каппа локус состоит из большого количества V генных сегмент ов , собраных в группы , пяти J и одного С сегмента .. Та кой тип организации называется сегментарным . Лямбда локус состоит из группы V сегментов , точное количество ко торых неизвестно , и семи пар J -C сегментов . Три из них (JC 4 - JC 6) являются псевдогенами (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993). В процессе развития В-лимфоцита в кр оветворных органах один из V сегментов соединя ется с одним из J сегментов посредством са йтспецифической рекомбинации (Schatz et al., 1992). В этот процесс вовлекаются специальные олигомерные последовате льности : гепта- и нонамеры , фланкирующие с 3' стороны V сегмент и с 5' стороны J сегм ент (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989). Отличительной особенностью лямбда и каппа локусов является конфигурация пром ежутков между гепта - и нонамерами , называемых спейсерами . С V и J генными сегмен тами лямбда типа ассоциированы 23 пн и 12 пн спейсеры соответственно , а с V и J сегментам и каппа типа - 12 пн и 23 пн спейсеры (Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985). Последовательность , в которой рекомбинируют локусы L-цепей , стр ого упорядочена во времени . Показано , что первыми перестраиваютс я локусы каппа типа , причем если в одн ой хромосоме перестройка оказалась нефункциональ ной , тоесть не привела к появлению полноце нного гена , то рекомбинация происходит в к аппа локусе на гомоло г ичной хромо соме . В случае повторной абортивной перестрой ки аналогично происходят перестройки в лямбда локусах . Если в клетке непродуктивно пере строились все четыре локуса , то она превра щатся в 0-клетку и подвергается апоптозу . Е сли же перестройка одного и з ло кусов привела к образованию функционального г ена , то рекомбинация остальных локусов блокир уется . Детали механизма блокирования неизвестны , однако установлено , что необходимым условием для него является транскрипция продуктивно перестроенного гена . В ре з ультате в каждом индивидуальном лимфоците синтезируетс я только один тип L-цепей , каппа или ля мбда , и экспрессия гена происходит только на одной из двух гомологичных хромосом . Эт и феномены , называемые изотипическим и аллель ным исключениями лежат в основе к л ючевого принципа функционирования иммунной системы - принципа клональной селекции (Пол , 1987; Strob, 1987). В организме млекопитающих генерируется свыше десяти миллионов вариантов антител , хот я в геноме содержится значительно меньшее количество генных сег ментов , которые мо гут участвовать в формировании вариабельных д оменов . В случае L-цепей , основным источником разнообразия является комбинативное сочетание V и J сегментов . Дополнительным источником является смещение рекомбинационной рамки в месте их соеди н ения . Кроме того , V генные сегменты могут обмениваться участками ДНК с псевдогенами посредством генной конверсии . Очень существенный вклад в разнообразие сп ецифичностей антител вносит соматическое мутиров ание вариабельных генных сегментов в сайтах , участв у ющих в формировании антиг енсвязывающего центра . Соматическое разнообразие генерируется при вторичном иммунном ответе пу тем включения гипермутационного механизма в к летках памяти в зародышевых центрах лимфатиче ских узлов (Tonegawa 1983; Roitt et al., 1993). ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ Хрящевые рыбы . Гуморальный иммунный ответ в виде сп ецифических антител обнаруживается только у п озвоночных . Наиболее примитивными видами , у ко торых обнаружена способность синтез ировать ИГ , являются хрящевые рыбы . Представители тр ех основных таксонов (акулы , скаты и химер ы ) продуцируют антитела в ответ на введени е широкого спектра антигенов . Однако , в от личие от млекопитающих , гетерогенность сывороточн ых антител у хрящевых рыб вы р ажена очень слабо . Кроме того , у них не обнаружено созревание иммунного ответа - при вторичном введении антигена спектр антител не меняется (Flajnik, 1996). Результаты исследований пос ледних лет продемонстрировали , что организация генов ИГ у хрящевых рыб т акже имеет ярко выраженные особенности. У хрящевых рыб обнаружены гены трех типов L-цепей , локализу ющиеся в разных локусах . В каждом локусе геные сегменты организованы в кластеры , и меющие по одному V, J и C генному сегменту . Так их кластеров содержится нес колько десятко в или даже сотен в одном локусе на расстоянии 12-15 тпн друг от друга (Rast et al., 1994). Гены первого типа найдены у разнозуб ой акулы ( Heterodontus francisci ) (Shamblott and Litman, 1989) и малого ската ( Raja erinacea ) (Anderson et al., 19 95). У акулы кластеры имеют размер 3-6 тпн . V и J, J и C генны е сегменты разделены примерно 0,5 и 4 тпн соо тветственно . У ската V и J сегменты слиты в зародышевой ДНК . Гены второго типа обнаружены у пятни стой химеры ( Hydrolagus colliei ) (Maisey, 1984), п есчаной акулы ( Carcharhinus plumbeus ) (Hohman et al., 1992; Hohman et al., 1993), разнозубой акулы и малого ската (У всех изученных видов в кластерах этого типа V и J генные сегменты соединены уже в зародышевом ген оме . V и C г eнные сегменты разделены 2-3 т пн. Третий тип генов L-цепей найден у акулы-няньки ( Gynglimostoma cirratum ) (Greenberg et al., 1993) и разнозубой акулы (Rast et al., 1994). В класт ерах этого типа V и J, J и C генные сегменты разделены , как и в кластерах первого ти па , примерно 0,5 и 4 тп н соответственно . V и J генные сегменты фланкируются сайтами специф ической рекомбинации со спейсерами 12 и 23 пн , что соответствует конфигурации спейсеров в л окусах каппа типа млекопитающих . По первичной структуре гены третьего типа тоже наибол ее близки к генам каппа типа в ысших позвоночных (гомология по аминокислотной последовательности составляет около 60%). Гены этих трех типов имеют между собой низкую степень гомологии :40-50% по нуклео тидной последовательности С сегментов и 50-60% по последовательности V сегментов (Hohman et al., 1993). Полученные данные показывают , что у хрящевых рыб имеется очень большое количество генных сегментов . Однако специфика организац ии генов исключает комбинативное сочетание се гментов . Все разнообразие антител у хрящевых рыб формируется только за счет экс прессии большого количества кластеров. Данные о нуклеотидных последовательностях из разных локусов выявили низкую гетероген ность генов (85-95%), что указывает на отсутствие соматического мутагенеза (Rast et al., 1994). Кос тистые рыбы . Анализ сывороточных антител пещерного с омика ( Ictalurus punctatus ) по казал наличие трех типов L-цепей с различн ыми молекулярными массами : 26, 24 и 22 кДа . Два ви да антител мыши , 3F12 и 1G7, захватывают более 90% о т общего количества иммуногл обулинов в реакции иммунопреципитации . При этом 3F12 антитела связываются с молекулами , содержащими L-цепи массой 24 и 22 кДа , а 1G3 антитела с другой субпопуляцией , содержащей L-цепи массой 26 кДа . На основе этих данных L-цепи разделяют на два класса , на з ываемые F и G (Lobb et al.,1984). Геномная организация локуса L-цепей G типа имеет кластерный тип . В каждом кластере содержится по одному J и C сегменту и д ва V сегмена . Вариабельные генные сегменты расп оложены всегда в противоположной транскрипционно й по лярности к J и C сегментам . В ряд е геномных клонов один V сегмент располагался с 3' стороны от C генного сегмента . Размер кластера равен примерно 3 тпн , расстояние ме жду кластерами около 6 тпн (Ghaffari and Lobb, 1993; Bengten, 1994). Хотя гены L-цепей с омика имеют низкую гомологию с генами других позвоночн ых (40-50% по нуклеотидной последовательности ), их м ожно отнести к каппа типу высших позвоноч ных , так как сходство по первичной структу ре с лямбда типом ниже . Кроме того , кон фигурация спейсеров имеет х а рактер каппа типа : 12 пн спейсер ассоциирован с V, 23 пн спейсер с J сегментом (Ghaffari and Lobb, 1993). У радужной форели ( Oncorhynchus mykiss ), представителя другого семе йства костистых рыб , также обнаружены два типа L цепей (Daggfeldt et al., 1993). Один из них (L1) высокого мологичен G типу сомика по структуре V и C об ластей и соответствующий локус имеет сходную организацию. По-видимому , у этих видов объединение V и J сегментов происходит только за счет инверсий с восстановлением единой полярности тр анскрипции . Разнообразие вариабельных домен ов образуется в результате комбинативного соч етания V и J сегментов в пределах одного кла стера . Не исключается , что в перестройки м огут вовлекаться и соседние кластеры. Интересной особенностью костистых рыб я вляе тся очень высокая пропорция мРНК , представляющей так называемые стерильные транскр ипты (Ghaffari and Lobb, 1993). Эти транскрипты включают в себя только С-сегменты и фланкирующие их 5 ’ и 3 ’ -нетранслируемые участки . Количество стерильных транскриптов у соми к а и форели в 5 раз превышает количество полных VJC-тран скриптов. Амфибии. У шпорцевой лягушки ( Xenopus laevis ) выявлено три семейства г енов L-цепей ИГ , кодирующих три различных и зотипа : L1 (ро ), L2 (сигма ) и L3. Все три локуса имеют сегментарный ха ракте р организации . L1 локус содержит множес твенные V L1 сегме нты , разделенные в геноме 2.1 - 3.6 тпн , пять J L1 сегментов , три из которых идентичны , и один C L1 генный сегмент (Stewart et al., 1993). J L1 и V L1 сегменты фланкируютс я каноническими гепта - и нонамерн ыми с игнальными последовательностями , разделенными 12 пн у V L1 и 23 пн у J L1 сегментов (Sakano et al., 1980). Локус генов второго типа разделяется на два семейства , 1 и 2, которые в геноме расп ол агаются отдельно . Геном лягушки содержит множ ественные V 1 и несколько V 2 геных сегментов , одну пару J 1 -C 1 и пару J 2 -C 2 (Schwager et al., 1991). Расположение генов этого ти па друг относительно друга точно не опред елено. Недавно был обнаружен третий тип ген ов L-цепей у лягушки . В геноме лягушки содержится шесть семейств V сегментов этого типа . Общее количество V L3 элементов составляет по меньшей мере 30 копий . Каждый V L3 элемент может рекомбинировать с одной из двух пар JC L3 генных сегментов (Haire et al., 1996). Гены трех типов значительно различаются : гомология на ами нокислотном уровне с оставляет приблизительно 30% (Zezza et al., 1991). В то же время , ряд признаков позволяет соотнести гены L1 и L3 типа с каппа и лямбда типами млеко питающих. Семейство генов первого типа можно о тнести к каппа типу по нескольким причина м (Zezza et al., 1992): а ) высокая гомология первичной с труктуры (более 50%); б ) существенное сходство гено мной организации локуса (много V L1 и один C L1 генный сегмент ); в ) к офигурация спейсеров между гепта - и нонамерым и соответствует каппа типу ; г ) J L1 и C L1 генные сегменты разделены пр имерно 3.5 тпн , что приблизительно равно расстоя нию между J L и C L элементам и человека (Sakano et al., 1979; Hieter et al., 1982) и значительно больше че м расстояни е между J L и C L млекопитающих (Blomberg et al., 1982; Udey, 1987). Третий тип генов L-цепей лягушки боле е близок к лямбда типу млекопитающих : а ) более высокая гомология с генами лямбда типа мле копитающих (около 50% с - и 30-40% с -типом по аминокислотной последовательности ); б ) J L3 и C L3 генные сементы экспресс ируются всегда парами J L3 1-C L3 1 и J L3 2-C L3 2, что напоминает с итуацию в лямб да локусе человека и мыши (Haire et al., 1996). Гены второго типа L-цепей лягушки н езначительное и приблизительно одинаковое сходст во с генами каппа и лямбда типов млек опитающих (30-40% и 25-40% по нуклеотидной последовательност и , соответствено ) (Schwage r et al., 1991). Генетическое разнообразие у лягушки дос таточно велико и сравнимо с разнообразием генов у млекопитающих . Однако репертуар ант ительных специфичностей в сыворотке крови зна чительно уступает репертуару высших позвоночных (Hsu et al., 1991). Э тот парадокс можно объяснить н аличием механизма соматической селекции клонов В-лимфоцитов , который элиминирует клетки , несущи е антитела , специфичные к собственным антиген ам организма , а также те клетки , которые продуцируют несколько типов антител (Wilson e t al., 1992). Основной вклад в формирование разнообра зия L-цепей антител у лягушки дают первое и третье семейства генов , имеющие высокий комбинативный потенциал и большое разнообраз ие зародышевых V генных (Haire et al., 1996). Второе семейство имеет неско лько слабо отличающихся друг от друга V L2 элементов и не играет существенной роли в формировании разнообразия (Stewart et al., 1993). Таким образом , разнообразие генов L-цепей у лягушки а создается посредством : а ) комбинативного соединения V и J генных сег ментов ; б ) с мещения рекомбинационной рамки при соединении V и J сегментов . Нельзя исключить , что определе нный вклад в разнообразие может вносить с оматический мутагенез . Во всяком случае , налич ие этого механизма показано для генов H-це пей лягушки (Zezza et al., 1992). ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ Согласно наиболее популярной в настоящи й момент гипотезе гены ИГ и Т-клеточных рецепторов произошли от одного предкового гена , кодировавшего один домен путем различны х вариантов последовательных дупликаций. В эволю ции генов ИГ можно выд елить три основных события. 1. Разделение предкового V-подобного гена на V и J сегменты и возникновение механизма генерации разнообразия путем соматической реко мбинации . Предпологается , что это событие связ ано с внедрением транспозон а в предко вый ген и осуществилось до разделения ИГ и Т-клеточных рецепторов у предков хрящев ых рыб (Gilbert, 1990). Наличие в геноме акул и ск атов слитых VJ генов в локусах L-цепей классо в I и II, является , по-видимому , вторичным событием и , возможно , обу с ловлено фиксацие й генов , кодирующих антитела строго определен ной специфичности (Anderson et al., 1995). 2. Возникновение механизмов соматического м утагенеза генов ИГ . У млекопитающих соматичес кий мутагенез обеспечивает как минимум полови ну разнообразия а нтител , являясь основой аффинного созревания антител при вторичном иммунном ответе (Пол , 1987). Достаточно выражен соматический мутагенез также у птиц (Thompson and Neiman, 1987; Reynaund et al., 1987). Ряд данных позволяет предполагать , что соматический мутагенез может осуществляться у хрящевых рыб и у амфибий , но эт и результаты нуждаются в более тщательном изучении . В частности , у хрящевых рыб по лучение достоверных свидетельств затруднено нали чием множественых кластеров генов , что не позволяет надежно с о относить данные по геномной структуре и структуре кДНК (Litman et al., 1993). 3. Переход от кластерной к сегментарной организации генных сегментов . Сегментарная о рганизация может иметь несколько преимуществ . Во-первых , увеличивается разнообразие продуциру емых антител за счет дополнительных в озможностей комбинирования разных V и J сегментов . Во-вторых , уменьшается размер локуса за сче т резкого сокращения количества C генов . В-треть их , подобная организация позволяет упростить регуляцию экспрессии различных л окусов . Ключевым принципом функционирования иммунно й системы является принцип клональной селекци и иммунокомпетентных клеток , несущих рецептор определенной специфичности . Ряд косвенных данных позволяет считать , что у акул гуморальный иммунный ответ клонал ьно ограничен (Shankey and Clem, 1980). Однако неизвестно , каким образом и наск олько эффективно осуществляется это ограничение (Flajnik, 1996). У млекопитающих принцип “одна клетка - одно антитело” обеспечивается благодаря изоти пическому и аллельному искл ю чению . При сегментарной организации генов продуктивна я перестройка в одном из локусов ведет к блокированию перестройки других локусов и , тем самым к их инактивации . Однако , в случае наличия множественных VJC кластеров , в части из которых VJ сегменты слиты в зародышевой ДНК , механизмы контроля выборочной экспрессии могут быть более сложны ми или не столь эффективными . Таким образо м , переход от кластерной к сегментарной фо рме организации генов ИГ мог иметь принци пиальное значение для формирования полноценной с истемы гуморального иммунитета. Вопрос о том , на каком этапе фило генеза произошел этот переход остается открыт ым . Уже у амфибий гены ИГ L- и Н-цепей организованы сегментарно . При этом , в случае L-цепей наблюдается два основных типа орг анизации : каппа-подо бный (один С ген , се мейство J сегментов и семейство V сегментов ) и лямбда подобный (несколько пар JC и семейство V сегментов ). По всей видимости , различные т ипы L-цепей амфибий произошли от различных типов L-цепей хрящевых рыб , однако относительно невысок а я гомология по первичной структуре не позволяет утверждать этого с определенностью (Gilbert, 1990). У сомика и радужной форели , представ ителей костистых рыб , организация генов L-цепей и Н-цепей отличается . Гены Н-цепей костист ых рыб организованы подобно м лекопитающим сегментарно (Bengten et al., 1991). Организация генов L-цепей и меет кластерный характер . В то же время , в отличие от хрящевых рыб , транскрипционная ориентация V генов у них изменена . Следует отметить , что сомовые и лосо севые являются довольн о специализированной группой , возникшей в эволюции относительно недавно . Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966). В связи с этим особый интерес пр едставляет изучение стру ктры и организаци и генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб . Костно-хрящевые являются архаичной группой кос тистых рыб , возникшей значительно раньше наст оящих костистых . Несмотря на то , что сущес твуют различные мнения относительно последовател ьности появлени я костно-хрящевых и д воякодышащих (предков наземных позвоночных ) (Ромер и Парсонс , 1992; Юдкин И . И ., 1941), очевидно , что костно-хрящевые в большей степени чем кос титстые сохранили черты древних первично-костных рыб и , соответственно , с большим основани ем могут рассматриваться как промежут очное звено между хрящевыми рыбами и амфи биями. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В агарозном геле. Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере ТАЕ , имеющем с остав : 0.04 М трис-ацетат , 2 мМ Na 2 ЭДТА (Маниатис и др ., 1984). В полиакриламидном геле. Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакрила мидном геле в 0,5-кратном буфере ТБЕ , имеющем состав : 0,089 М трис-борат , 0,089 М борная кислота , 2 мМ Na 2 ЭДТА . Для полимеризации геля к 50 мл раствора доба вляли 300 мкл 10% раствора персульфата аммо ния и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др ., 1984). ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе. Гель окрашивали в растворе бромистого этидия , участок геля с полосой ДНК выре зали , помещали в камеру и п ереносили ДНК на диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0,5-кратном буфере ТБЕ (см . Электрофорез ДНК (2)) при напряжении 40 В /см . Элюцию ДНК с диэтиламино этилцеллюлозы проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70 о С в буфере , имеющем состав : 2 мМ NaCl, 1 мМ Na 2 ЭДТА , 40 мМ трис рН 8,0 (Маниатис и др ., 1984). Адсорбция на кремниевой пудре. Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия , вырезали участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойн ым объемом 6 М раствора KI в течение 10 мин при 55 о С . Затем добавляли суспензию кремниевой пудр ы (силики ) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг /мл из расчета 300 мкг силики на 1 м кг ДНК и инкубировали в течение 2 мин п ри 55 о С . После этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и дважд ы промыва ли суспендированием в растворе , содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ трис -HCl, рН 8,0, 2,5 мМ Na 2 ЭДТА и 50% этиловый спирт . Элю ировали ДНК с силики суспендированием в в оде (Boyle, Lew, 1995). Замораживание - оттаивание. Агарозный гель с ДНК 10 мин инк убировали в жидком азоте и осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин , по сле чего добавляли к супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при 12000 g в течение 10 мин. ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ 500 нг ДНК-матри цы и 100 нг праймера денатурировали в 10 мкл воды при 100 о С в течение 10 ми н и быстро охлаждали до 0 о С . Затем добавляли 10 мк л 10-кратного буфера (40 мМ KP0 4 рН 7,5, 6,6 мМ MgCl 2 и 1,0 мМ 2-меркаптоэтанол ), 0,1-0,5 мКи 32 Р -dATФ , 10 мкл 2 мМ раствора трех д ругих немеченых дН TФ до концентрации 200 мкМ . Объем реакци онной смеси доводили водой до 100 мкл , добавл яли 3 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (10-12 е. а .) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин . Очистку зонда проводили методом гел ь - фильтрации на колонке с биогелем П -10 (Маниатис и др ., 1984). ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Клетки Escherichia coli , выращенные в среде Луриа-Бертани (1% NaCl, 1% ба кто-триптон , 0,5% бакто-дрожжевой экстракт , рН 7,5) (среда LB) с ампициллином (50 мкг /мл ), осаждали ц ентрифугированием при 4000 g. Затем осадок суспендиров али в буфере STET (8% сахароза , 0,5% тритон X-100, 10 мМ три с -HCl и 50 мМ Na 2 ЭДТА , рН 8,0) и добавляли лизоцим до к онцентрации 0,8 г /мл . Смесь инкубировали при комнатной температуре в течен ие 5 мин и при 100 о С в течение 1 мин . После этого клеточный де брис осаждали центрифугированием при 16000 g в тече ние 15 мин. Для осаждения плазмидной ДНК к супер натанту добавляли 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия , равный объем изопропанола и центр иф угировали при 16000 g в течение 15 мин при 20 о С . Затем промывали осадок добавлением 80% этанола и по вторным центрифугированием в течение 5 мин при 20 о С (Маниати с и др ., 1984). ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕС НОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТ НО СТИ CsCl На каждые 10 мл раствора плазмидной ДН К , полученного после осаждения лизированных к леток (см . Выделение плазмидной ДНК ), добавляли 1 г сухого CsCl, соль растворяли , после чего на каждые 10 мл раствора добавляли 0,8 мл ра створа бромистого этиди я с концентрацией 10 мг /мл . Смесь помещали в центрифужные пробирки Beckman, заполняли доверху раствором CsCl и бромистого этидия той же плотности и цент рифугировали в роторе Ti 60 при 45000 об /мин и температуре 20 о С в течение 36 часов . После этого отбирали кольцевую ковалентно замкнутую плазмидную ДНК и экстрагировали бромистый этидий из раствора до полного обесцвечивания равным объемом н-бутанола , предварительно насыщенного 1 М раствором NaCl. ДНК осаждали центрифугированием при 15000 g, до бавив равный об ъем 1 М раствора NH 4 Cl и два объема этанола . После промывания этанолом осадок ДНК растворяли в воде до концентрации 1 мкг /мкл (Маниатис и др ., 1984). ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК Химическая трансформация. Для подготовки компетентных клеток E. coli штамм XL-1 Blue MRF ' и выращивали в 100 мл 2-кратной среды Лур иа (2% бакто-триптон , 1% бакто-дрожжевой экстракт , 0,1% NaCl, 0,4% гл юкоза , рН 7,0) при 37 о С до оптической плотности D 550 =0,35. Клеточную суспензию в ыдерживали при 0 о С в течение 2 часов . З атем клет ки осаждали центрифугированием при 4000 g, температуре 4 о С и су спендировали в 50 мл ледяного буфера А (100 мМ CaCl 2 , 70 мМ MnCl 2 , 40 мМ NaAc, рН 5,5). П осле этого суспензию клеток выдерживали при 0 о С в те чение 30 мин , после чего клетки осаждали и суспендировали в 5 мл буфера А с 15% глицерина. Для трансформации к 200 мкл суспензии к омпетентных клеток добавляли 30 нг плазмидной Д НК , растворенной в 100 мкл воды и выдерживали при 0 о С в течение 30 мин . Затем инкубировали при 37 о С в течение 5 мин , посл е чего добавляли 3 мл сре ды LB и инкубировали при 37 о С еще 90 мин . Клетки собирали центрифугированием и высевали на селективную среду (Мазин и др ., 1988). Электротрансформация. Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF ' выращив али в 100 мл среды LB (см . Химическая тран сформация ) при комнатной температуре до оптич еской плотности D 550 =0,45. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, 4 о С и промывали суспендированием последовательно в 100 мл , 50 мл и 10мл 10% раствора глицерина при 0-4 о С . По сле этого клетки суспендировали в 240 мкл ле дяного раствора GYT (10% глицерин , 0,125% бакто-дрожжевой экст ракт , 0,25% бакто-триптон ). Для трансформации к 40 мкл суспензии к омпетентных клеток добавляли 1 мкл ДНК вектора (50 нг ) при 0-4 о С и пр опускали электрический разр яд (U=18000 В ). Затем добавляли 1 мл SOC (2% бакто-триптон , 0,5% бакто-дрожжевой экстракт , 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2 , 10 мМ MgSO 4 , 20 мМ глюкоза ), пере мешивали , переносили в 3 мл среды SOC, прогретой до 42 о С , и инкубиро вали при 37 о С в течение 1 часа (Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995). ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ РЫБ Кровь собирали на холоду через кауда льную артерию с добавлением на каждые 5 мл крови 1 мл 2,7% раствора Na 2 ЭДТА , рН 7,4. К выделенной крови добавлял и равный объем трис-солевого буфе ра (TBS) (0,14 М NaCl, 5 мМ KCl, 25 мМ трис -HCl, рН 7,4). Смесь на носили при комнатной температуре на равный объем среды для выделения лейкоцитов , содер жащей 24 части 9% фикола и 10 частей 34% верографина . После центрифуги р ования при 400 g в течение 30 мин отбирали слой лейкоцитов и разводили в большом объеме буфера TBS. После повторного центрифугирования при 300 g в течение 40 мин для лизиса остаточных эритроцитов кле тки суспендировали в растворе , содержащем 9 объ емов 0,83 % раствора NH 4 Cl и 1 объем 2,06% раствора трис -HCl, р Н 7,62, до концентрации 10 8 кл /мл и добавляли 5 объемов сре ды . После осаждения клеток при 300 g в течение 10 мин процедуру очистки повторили (Фримель , 1987). ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ Осад ок лейкоцитов после выделения и очистки суспендировали в 10 объемах (1 мл ) раствора 1, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат , 25 мМ цитрат натрия , рН 7,0, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол , при комнатной температуре . За тем добавляли 0,1 мл 2 М раствора N aAc, рН 4,0, 1 мл фенола , 0,2 мл хлороформа и перем ешивали . Затем центрифугировали при 10000 g в течен ие 20 мин при 4 о С , отбирали водную фазу , добавляли к ней равный объем изопропанола и осаждали РНК центрифугированием при 15000 g в течение 15 ми н при 4 о С (Chomczynski and Sacchi, 1987). ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ЭУК АРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК 1 г печени стерляди , замороженной в жидком азоте , растирали в тонкий порошок и гомогенизировали в 15 мл раствора , содержащего 0,5 М Na 2 ЭДТА , рН 8,0, 0,5% саркоз ила , 100 мкг /мл протеиназы К и нагретого до 65 о С . Затем инкубировали при 50 о С течение 3 часов при легком покачивании . Затем , избегая резки х встряхиваний , экстрагировали ДНК равным объ емом фенола три раза , каждый раз разделяя фракции центрифугированием при 4000 g и к омнатной температуре . Фенол предварительно очищал и перегонкой и насыщали буфером , содержащим 1 М трис -HCl, один раз и два раза буферо м , содержащим 0,1 М трис -HCl и 0,1% 2-меркаптоэтанол . Диализ ДНК проводили при 10 о С в течение 12 часов против 4 л буфера , имеющего состав : 50 мМ трис -HCl, рН 8,0, 10 мМ Na 2 Э ДТА, 10 мМ NaCl. Затем обрабатывали пробу РНКазой , свобод ной от ДНКазы,при 37 о С в течение 1 часа в концентрации 100 мкг /мл . После этого экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороф орм (1:1) два раза и проводили диализ при 10 о С в течение 36 ча сов против 10 л буфера TE (10 мМ трис -HCl, 1 мМ Na 2 ЭДТА , рН 7,5), меня я буфер через каждые 12 часов (Маниатис и др ., 1984). КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК Выделение поли (A) + РНК. Для ингиб ирования РНКазы все рас творы , не содержащие трис , обрабатывали 0,1% диэти лпирокарбонатом 12 часов при 37 о С и автоклавировали . Посуду прокаливали при 250 о С в течение 4 часов . Поли (A) + РНК выделяли из суммарной РНК лейкоцитов стерляди методом хроматографии на олиго (dT)-целлюлозе . Для э того РНК растворяли в воде , прогревали при 65 о С в те чение 5 мин , добавляли равный объем 2-кратного буфера для нанесения РНК (40 мМ трис -HCl, рН 7,6, 1 М NaCl, 2 мМ Na 2 ЭДТА , 0,2% SDS) и трижды пропускали через кол онку с олиго (dT)- целлюлозой . Затем промывал и колонку 5-10 объемами буфера для нанесения и 4 объемами этого же буфера , содержащего 0,1 М NaCl. После этого элюировали поли (A) + РНК в 2-3 объемах воды , обработанной диэтилпирокарбонатом , добавляли 2,2 объема этанола и осаждали ц ентрифугир ованием в течение 10 мин при 12000 g при 4 о С (Маниатис и д р ., 1984). Синтез кДНК. Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом фирмы Stratagene. По матрице поли (A) + РНК синтезиров али первую цепь кДНК. Реакционная имела состав : 5 мкл 10- кратного буфера для синтеза первой цепи, 3 мкл смеси метил -dН TФ, 2 мкл раствора праймер-линкера (1.4 мкг /мкл ), 1 мкл ингибитора РНКазной активности, 1.5 мкл фермента обратная транскриптаза (50 е.а ./мкл ), вода до суммарного объема 50 мкл. Смесь и нкубировали при 37 о С в течение 1 ча са . Затем охлаждали до 0 о С и добляли компоненты для синтеза второй цепи кДНК : 20 мкл буфера для синтеза второй цеп и, 6 мкл смеси dН TФ, 88,9 мкл стерильной воды, 2 мкл 32 Р -dН TФ (800 Ки /мМ ), 2 мкл раствора РНКазы H (1.5 е.а ./мкл ), 11.1 мкл ДНК полимеразы I. Смесь инкубировали при 16 о С в течение 2,5 часов , затем охлаждали до 0 о С и добавляли компоненты для застройки “липких” концов : 23 мкл смеси дН TФ, 2 мкл Pfu ДНК полимеразы (2,5 е.а ./мкл ). Смесь инкубировал и при 72 о С в течение 30 ми н. Затем проводили экстракцию равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и равным объемом хлороформа , после чего отбирали водную фазу , добавляли 20 мкл 3М NaAc и 400 мкл 96% этанола и осаждали кДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин . Сшивка молекул кДНК с вектором. кДНК растворяли с EcoR I адапторами и инк убировали при 4 о С в течение 30 мин . Затем добавляли компоненты для сшивки молекул адапторов и молеул кДНК : 1 мкл 10-кратного буфера лигирования, 1 мкл 10 мМ р A TФ, 1 мкл фермента ДНК лигазы фага Т 4 (4 е.а ./мкл ). Смесь инкубировали при 4 о С в течение 2-х сут ок , после чего инактивировали лигазу прогрева нием при 70 о С в течение 30 мин , охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для фос форилирования к онцевых нуклеотидов : 1 мкл 10-кратного буфера лигирования, 2 мкл 10 мМ р ATФ, 6 мкл стерильной воды, 1 мкл фермента полинуклеотидной киназы фага Т 4 (10 е.а ./мкл ). Реакционную смесь инкубировали при 37 о С в течение 30 мин . Затем охлаждали до комнатно й тем пературы и добавляли компоненты для образован ия липких концов по сайту рестрикции эндо нуклеазы Xho I: 28 мкл буфера 4, 3 мкл Xho I (40 е.а ./мкл ). Смесь инкубировали при 37 о С в течение 1,5 часа . Затем добавляли 5 мкл 10-кратного буфера STE (1 М Na Cl, 200 мМ трис -HCl, рН 7,5, 100 мМ Na 2 ЭДТА ) и пропускали чере з колонку с гелем сефакрил С -500. Фракции , содержащие молекулы с размером более 500 пн объединяли и экстрагировали ДНК равным объ емом смеси фенол-хлороформ (1:1) и равным объемом хлороформа . Зат ем добавляли двойной о бъем этанола , осаждали кДНК центрифугированием , промывали 80% этанолом и растворяли в 10 мкл воды . Для лигирования брали 5 мкл раствора кДНК (600 нг ) и 2 мкл раствора вектора pBluescript KS(+) (1 мкг ), имеющего "липкие " дефосфорилиро в ан ные концы по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR I и Xho I. Затем добавляли 1 мкл 10-кратного буфера 3, 1 мкл 10 мМ раствора р ATФ и 1 мкл фермента лигазы фага Т 4 (4 е.а ./мкл ). Смесь инкубир овали при 4 о С в течение 2-х суток , после чего экстра гировали ра вными обьемами фенол-хлороформа и хлороформа. Амплификация библиотеки. Электротрансформацию проводили как описано в п . Трансформация прокариотических клеток , после чего высевали 1/1000 объема (2,5 мкл ) среды SOC на селективную среду с ампициллином (50 мкг /мл ) для определения количества тра нсформированных клеток . Остальную часть помещали в 100 мл среды LB с ампициллином (50 мкг /мл ) и инкубировали при 37 о С при перемешивании до тех пор , пока оптическая плотность не достигнет величины D 550 =2-2,5. Затем отби рали 1,6х 10 11 клеток , осаждали их центрифуг ированием , суспендировали в 4 мл среды LB и п еремешивали с 4 мл глицерина . Полученную библио теку хранили при -70 о С. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ Реакционная смесь полимеразной цепной р еакции (ПЦР ) содержала сле дующие компонент ы : 100 нг ДНК матрицы, 100 нг невырожденного праймера, 500 нг вырожденного праймера, 5 мкл 2 мМ раствора дН TФ, 5 мкл 1-кратного буфера (10 мМ трис -HCl, рН 8,8, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2 , 0,001% желатин ), 1 мкл Taq полимеразы, во да до конечного объема 50 мкл (Dieffenbach and Dveksler, 1995). Температурный режим ПЦР. Реакционную смесь инкубировали при 95 о С в течение 5 мин , после чего добавляли Taq полимеразу и и спользовали температурный режим , при котором в течение первых 18 цик лов температуру отжига праймеров понижали на 3 о С черех каждые три цикла : 1 й -18 й циклы 95 о С - 1 мин (денатурац ия ДНК ), 50-35 о С - 1 мин (отжиг праймеров ), 72 о С - 2 мин (полимеризация ). 19 -й -30 -й циклы : 95 о С - 1 мин, 50 о С - 1 мин, 72 о С - 2 мин. 31 -й цикл : 95 о С - 1 мин, 50 о С - 1 мин, 72 о С - 10 мин. СУБКЛОНИРОВАНИЕ ДНК Фрагмен ты ДНК , полученные в резу льтате ПЦР , разделяли в 1% агарозном геле и выделяли как описано в п . Выделение Д НК из геля . Затем осаждали ДНК этанолом , растворяли в 5-10 мкл воды и добавляли ком поненты для удаления выступающих нуклеотидов с 3' конца ДНК : 1 мк л 10-кратного буфера (200 мМ трис -HCl, рН 8,2, 100 мМ KС l, 60 мМ (NH 4 ) 2 SO 4 , 20 мМ MgCl 2 , 1% тритон Х -100 и 100 мкг /мл бычий сывороточный альбумин ), 1 мкл 10 мМ dН TФ, 1 мкл Pfu ДНК полимеразы (2,5 е.а ./мкл ), воду до конечного объема 10 мкл. Смесь инк убировали 30 мин при 72 о С после чего охлаждали до 0 о С и добавляли компоненты для сшивки с вектором pBluescript KS(+) по сайту рестрикции Sma I: 1 мкл расщепленного вектора (0,5 мкг ), 1 мкл 10-кратного буфера (50 мМ трис -HCl, рН 7,5, 7 мМ MgCl 2 , 1 мМ Д ТТ ), 1 мкл 10 мМ д ATФ, 1 мкл ДНК лигазы фага Т 4 и воду до конечного объема 10 мкл . Смесь инкубировали одни сутки при ко мнатной температуре и затем использовали для химической трансформации клеток E.coli . Трансформированные клетки высевали на селекти вную среду : 1,5% LB-агар с ампициллином (50 мкг /мл ), тетрациклином (15 м кг /мл ), ИПТГ (2 мМ ), X-Gal (500 мкг /мл ) и инкубиров али 14 часов при 37 о С . После этого отбирали колонии белого цвета (Маниатис и др ., 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995). СКРИНИНГ Б ИБЛИОТЕКИ кДНК Библиотеку кДНК высевали на чашки Пе три с 1,5% LB-агаром с ампициллином (50 мкг /мл ) из расчета 4000 колоний на чашку и инкубир овали при 37 о С до тех пор пока колонии не достигнут 0,5-1 мм в диаметре . Колонии переносили на нейлоновую мембран у и инкубировали при комнатной температуре в денатурирующем раств оре (0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl) в течение 7 мин и два раза по 2 мин в нейтрализующем растворе (1,5 М NaCl, 0,5 М трис -HCl, рН 7,5). Затем споласкивали мембра ну в 2-кратном буфере SSC (0,3 М NaC l , 0,03 М цитрат натрия ), высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучение м с длиной волны 310 нм . После этого мемб рану помещали в 50 мл предгибридизационного рас твора (раствор 1), содержащего : 6-кратный SSC (0.9 М NaCl, 0,09 М цит рат натрия ), 5-кратный раствор Денхардта (0,1% бычий сыво роточный альбумин , 0,1% фикол , 0,1% поливинилпиролидон ), 0,5% SDS, 10% декстран сульфат, 500 мкг денатурирированной ДНК цыпленка, и инкубировали 1 час при 55 о С . После этого добавля ли меченую 32 P-д ATФ ДНК зонда и инкубировали 12-18 часов при 55 о С пр и постоянном покачивании . После гибридизации проводили промывание мембраны два раза по 10 мин в 200 мл 2-кратн ого SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре , 15 мин в 1- кратном SSC + 0,1% SDS% при 55 о С и два раза по 10 мин в 0,1-кратно м SSC + 0,1% SDS при 55 о С . Экспонирование проводилось в течение 12 часов при -70 о С с рентгеновской пленкой (Маниатис и др ., 1984). ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК Нуклеотидную последовательность ДНК о пределяли по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977). 5 мкг плазмидной ДНК , очищеной гель-фильтрацией на колонке с биогелем П -10, денатурировали в 50 мкл 0.2 М NaOH при 37 о С в течение 30 мин , затем добавляли 5 мкл 3 М NaAc, рН 5,1, двойной объем этанола и и нк убировали 30 мин при температуре -70 о С . После этого осаждали ДНК центрифугированием при 12000 g в течен ие 12 мин и промывали осадок 100 мкл 80% этанола . Осадок ДНК высушивали при комнатной темп ературе и растворяли в 7,5 мкл воды , добавлял и 2 мкл 5-кратного буфера (200 мМ трис -HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl 2 , 250 м М NaCl), 0,5 мкл праймера (50 нг ) и инкубировали 30 мин при 37 о С . После этого пробирку помещали в лед и добавляли 1 мкл 0,1 М ДТТ , 2 мкл 1,5 мкМ дН T Ф без д ATФ , 0,5 мкл раствора 35 S-д ATФ и 2 мкл ДНК полим еразы фага Т 7 (2,5 е.а ./мкл ). Затем инкубировали 3 мин при 20 о С и сразу отбирали по 3,5 мкл в четыре пробирки , каждая из которых содержала по 2,5 мкл 80 мкМ смеси четырех дН TФ , 50 мМ NaCl и 8 мкМ одного из ддН TФ . Инкубировали 5 мин при 37 о С и добавляли по 4 м кл стоп-раствора (95% формамид , 20 мМ Na 2 ЭДТА , 0,05% бромфеноловый синий , 0,05% ксилен цианол ). Полученные образцы инкубиро вали 3 мин при 100 о С , быстро охлаждали до 0 о С и отбирали по 2 м кл для электрофореза в денатурирующем полиакр иламидном геле , имеюще м состав : 6% акриламид, 8 М мочевина, 1-кратный глицерин-толерантный буфер (1,1% трис , 0,36% таурин , 0,02% Na 2 ЭДТА ). Электрофорез проводили при напряжении 40 В /см . Затем гель выдерживали 30 мин в 10% ук сксной кислоте , высушивали и экспонировали 12 ч асов при комнатной температуре с рент геновской пленкой (Маниатис и др ., 1984). САУЗЕРН БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ 10 мкг геномной ДНК , выделенной из п ечени стерляди , инкубировали в течение 2 часов с эндонуклеазами рестрикции Pst I и Pvu II (по 50 е.а .) при 37 о С в буфере , соде ржащем 100 мМ NaCl, 10 мМ трис -HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl 2 , 100 мкг /мл бычий сывороточный альбумин , 6 мМ 2-меркаптоэтанол . Зате м экстрагировали ДНК последовательно равными объемами фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа , осаждали ДНК двумя объемам и этанола , растворял и в воде и наносили на 1% агарозный гел ь . Электрофорез проводили при напряжении 1 В /см и температуре 12 о С в течение 12 часов . Затем гель инкубировали при комнатной температуре 30 мин в 0,25 М HCl, 30 мин в денатурирующем растворе (0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl) и 10-15 мин в растворе 1 (0,25 М NaOH, 1,5 M NaCl). По сле этого ДНК переносили на нейлоновую ме мбрану методом вакуумного переноса в растворе 1. Мембрану споласкивали в 2-кратном SSC, высушивал и и фиксировали ДНК в течение 10 мин ул ьтраф и олетовым излучением с длиной волны 310 нм . Предгибридизацию проводили при 55 о С в течение 1 ча са в растворе 1 (см . Скрининг библиотеки кДН К ). Гибридизация длилась 12-16 часов при 55 о С с концентрацией зонда не более 10 нг /мл. Отмывку проводили два раза по 10 мин в 2-кратном SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре и один раз 15 мин в 1-кратном SSC + 0,1% SDS при 55 о С . Экспонирова ние длилось 12 часов при -70 о С (Маниатис и др ., 1984). РЕЗУЛЬТАТЫ КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ СКРИНИНГ В качестве и сточника мРНК брали лейкоциты периферической крови стерляди . На основе этой мРНК синезировали кДНК . Получ енные молекулы кДНК клонировали в плазмидном векторе pBluescript KS(+), после чего трансформировали эти м вектором клетки E.coli штамма XL-1 Blue MRF ’ . В результате э того была получена библиотека кДНК представит ельностью 6 миллионов клонов . Библиотеку амплифицир овали до объема 5 х 10 11 клеток. Cуммарную плазмидную ДНК библиотеки вы деляли и использовали в ПЦР с парой п раймеров , один из которых гомологичне н участку вектора вблизи сайта клонирования молекулы кДНК и располагается в кодирующей ориентации . Второй праймер вырожденный , соответ ствующий наиболее консервативному участку послед овательности J-сегментов L-цепей ИГ позвоночных в некодирующей ориентации. Один из фрагментов ДНК , полученных в результате ПЦР , соответствовал ожидаемому ра змеру (370 пн ). Этот фрагмент выделяли и субкл онировали в векторе pBluescript KS(+). Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента показало , что он гомологичен генам V области L-цепей ИГ . Этот фрагмент был использован в каче стве зонда для скрининга библиотеки кДНК лейкоцитов стерляди . Скрининг 4000 колоний библиотеки кДНК в мягких условиях гибридизации позв олил выявить пять клонов с размером встав ки кДНК от 80 0 до 1050 пн . Для четкого разделения клонов проводили вторичный скрининг библиотеки кДНК , после чего выделенные кл оны амплифицировали. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ Определена нуклеотидная последовательность вставки кДНК клона В 1. кДНК клона В 1 ра зме ром 1050 пн представляла собой полноразме рную копию зрелого гена L-цепи ИГ и сод ержала 5 ’ -нетранслируемую область , последовательность кодирующую лидерный пептид , V область , С об ласть , а также 3 ’ -нетранслируемую область . На основе первичной структуры клон а В 1 сконструировали и синтезировали три прай мера , соответствующих консервативным районам V и C области и использовали их для определения нуклеотидной последовательности клонов Е 4 и С 2. Последовательность клона Е 4 была опред елена только в области , примыкаю щ е й к Т 3 промотору вектора . За исключением 2 нуклеотидов она полностью идентична последова тельности В 1. Последовательность клона С 2 имела химерный характер . В области Т 3 промотора она содержала фрагмент соответствующий 3 ’ части С сегмента клона B1 с замена м и нескольких нуклеотидов . В то же время использование для определения последовател ьности праймеров V и C области показало , что эта вставка содержит дополнительно перестроенный ген легкой цепи , содержащий большую часть V сегмента и второй С сегмент , отлича ю щийся от первого в одной поз иции . Поскольку пока не удалось определить последовательность в области стыка этих дв ух фрагментов вставки , нельзя сказать , находят ся ли они в одной или разных ориентац иях . По-видимому , сходный химерный характер име ет последова т ельность клона D2 (данные не показаны ). СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ Нуклеотидную и предсказанные аминокислотные последовательности клона В 1 сравнивали с последовательностями V и C генов L-цепей ИГ други х видов позвоночных . На аминокислотн ом уровне V область имеет наибольшее сходство с V-областями L-цепей класса F и G пещерного сом ика и с V-областью L1 класса ИГ форели (63-71%). И те и другие относятся к каппа-типу L-цепей . При поиске гомологов в полном б анке последовательностей ИГ млекоп и та ющих первые 100 позиций с наибольшим сходством представляли собой также V каппа области. С-область клона В 1 имеет на аминокисл отном уровне приблизительно одинаковое и не очень значительное сходство с широким сп ектром С-областей L-цепей ИГ хрящевых и кос тистых рыб (41-44%). На нуклеотидном уровне наиболее близкими гомологами В 1С гена явл яются гены III класса хрящевых рыб (65%). АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ Геномную организацию локуса генов L-цепей ИГ стерляди оценивали методом Саузерн бл от гибридизации . Геномную ДНК выделяли и з печени стерляди . ДНК расщепляли эндонуклеаз ами рестрикции Pst I и Pvu II. После электрофоретического разделения и перенос а фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили гибридизацию в мягких условиях . В качестве зонда на V-гены использов али фрагмент , полученный в результате ПЦР (см . Конструирование библиотеки кДНК и ее скрининг ). В качестве С-зонда использовали учас ток кДНК клона В 1, кодирующий C L сегмент , который вырезал и по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR V- Xho I. V-зонд выявлял более 20 гибридизующихся ф рагментов ДНК , в то время как С-зонд ги бридизовался только с 3-4 фрагментами. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В результате проведенной работы идентиф ицирован локус генов , кодирующих L-цепи ИГ стерляди , представителя под класса костно-хряще вых рыб . Сравнительный анализ структуры V генов этого локуса указывает , что он относится к каппа типу . Результаты сравнительного а нализа С областей менее информативны , что само по себе не удивительно , так как С- гены L-цепей ИГ значитель н о менее консервативны чем V-гены . Тем не менее , тот факт , что на нуклеотидном уровне С-ген стерляди имеет наибольшее сходство с кап па-подобными генами III класса хрящевых рыб , такж е свидетельствует о том , что обнаруженный локус относится к каппа типу. кДН К клонов В 1, С 2, Е 4, а так же фрагмент , полученный с помощью ПЦР , сод ержат близкородственные V-гены . Различия между ними сконцентрированы в основном в области 3-го гипервариабельного района . Последовательности двух обнаруженных J-сегментов отличаются по 10 нуклеотидам , т.е ., они представляют собой различные геномные сегменты . Незначительные различия обнаружены также между тремя по следовательностями С-генов . С-сегмент клона В 1 о тличается от полного С-сегмента клона С 2 п о 9 позициям , из которых 5 ведут к заме н е аминокислоты . По-видимому , эти п оследовательсти также представляют собой разные зародышевые гены. Анализ структурной организации локуса с помощью Саузерн блот-гибридизации указывает , что у стерляди имеются множественные V L гены . Точная оценк а их количес тва невозможна , но наличие более 20 полос гибридизации с разной интен сивностью сигнала , по аналогии с многочисленн ыми литературными данными , позволяет говорить о нескольких десятках копий. При использовании С-зонда количество пол ос в мягких условиях гибри дизации не превышает 4-х . Учитывая возможность аллелизма можно говорить о наличии в этом локу се 2-4х генов. Ярко выраженное количественное превосходств о V генов над С-генами является характерным признаком сегментарной формы организации локус а . У хрящевых и костистых рыб с кластерной организацией генов L-цепей количество V и С генов очень велико и приблизительн о одинаково , что отражается в сходной карт ине блот-гибридизации . Полученные нами результаты являются серьезным основанием для того , ч тобы утверждать, что у стерляди организа ция генов L-цепей каппа-подобного типа имеет сегментарный характер , подобный организации кап па локуса млекопитающих. Эти данные указывают на то , что п ереход от кластерной к сегментарной организац ии произошел в филогенезе позвоночны х очень рано , возможно уже у древних перв ично-костных. ВЫВОДЫ 1. Сконструирована библиотека кДНК лейкоцит ов стерляди представительностью 6х 10 6 независимых клонов . ПЦР ДНК библиотеки с помощью вырожденного пр аймера , соотвествующего J сегменту генов ИГ , п озволил выявить фрагмент ДНК длиной 370 пн , гомологичный V генам ИГ позвоночных. 2. Из библиотеки кДНК с использованием продукта ПЦР в качестве зонда выделено пять клонов , содержащих вставки кДНК генов L-цепей ИГ . Сравнительный анализ первичной структуры кДНК клонов показал , что он и являются членами одного семейства генов и имеют наибольшее сходство с генами к аппа типа. 3. Согласно результам геномного блот-анализа идентифицированное семейство содержит несколько десятков V генов и только 2-4 С гена , что ук азывает на сегментарную форму его организации. 4. Полученные данные указывают что пере ход от кластерного типа организации генов ИГ , характерного для хрящевых рыб , к сег ментарному , присутствующему у всех млекопитающих , произошел в эволюции в период появлен ия первично-костных рыб. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Мазин А . В ., Кузнеделов К . Д . и др . Методы молекулярной генетики и генной инженерии . Новосибирск , 1988. 333 с. Маниатис Т ., Фрич Э ., Сэмбрук Д . Мол екулярное клонирование . М .: Мир , 1984. 480 с. Пол У . (ред .) И ммунология . М .: Ми р , 1987. Т . 1. 476 с. Ромер А . С . и Парсонс Т . С . Ана томия позвоночных . М .: Мир , 1992. 358 с . Фримель Г . (ред .) Иммунологические методы . М .: Медицина , 1987. 472 с. Юдкин И . И . Ихтиология . Москва-Ленинград : Пищепромиздат , 1941. Aguile ra R. J., Akira S., Okazaki K.,Sakano H. A pre-B cell nuclear protein wich specifically interacts with the immunoglobulin V-J recombination sequeces // Cell. 1987. V. 51. P. 909-917. Anderson M. K., Shamblott M. J., Litman R. T., Litman G. W. Generation o f immunoglobulin light chain gene diversity in Raja erinacea is not associated with somatic rearrangement, an exception to a central paradigm of B cell immunity // Journal of Experimental Medecine. 1995. V. 182. P. 109-119. Bengten E. The immunoglobulin g enes in Atlantic cod ( Gadus morhuna ) and rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss ) // Dissertations from the Faculty of Science and Technology. 1994. V. 19. Bengten E., Leanderson T., Pilstrom L. Immunoglobulin heavy chain cDNA from Atlantic cod ( Gadus morhuna L.): nucleotide sequences of secretory and membrane form show an unusual splicing pattern // European Journal of Immunology. 1991. V. 21. P. 3027-3033. Blomberg B., Tonegawa S. DNA sequences of the joining regions of mouse light chain immunoglobulin genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 530. Boyle J. S., Lew A. M. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 1. p. 8. Chomczynski P. and Sac chi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical biochemistry. 1987. V. 162. P. 156-159. Daggfeldt A., Bengten E., Pilstrom L. A claster type organization of the loci of the immunoglobul in light chain in Atlantic cod ( Gadus morhuna L.) and rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss Walbaum) indicated by nucleotide sequences of cDNAs and hybridization analysis // Immunogenetics. 1993. V.38. P. 199-209. Dieffenbach C. W. and Dveksler G. S. (edit). PCR primer. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. 714 p. Durdik J., Moore M. W., Selsing E. Novel light-chain gene rearrangements in mouse light-chain-pro ducing B limphocytes // Nature. 1984. V. 307. P. 749-752. Flajnik M. F. The immune system of ectothermic vertebrates // Veterinary Immunology and immunopathology. 1996. V. 54. P. 145-150. Ghaffari S. H. and Lobb C. J. Structure and genomic organization o f immunoglobulin light chain in the channel catfish // The Journal of Immunology. 1993. V. 151. P. 6900-6912. Gilbert W. Evolution of antibodies: the road not taken // Nature. 1990. V. 320. P. 485. Greenberg A. S., Steiner L.,Kasahara M., Flajnik M. F. I solation of a immunoglobulin light chain cDNA clone encoding a protein resembling mammalian light chains: Implications for the evolution of light chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 10603-10607. Haire R. N ., Ota T., Rast J. P., Litman R. T., Chan F. Y., Zon L. I., Litman G. W. A third Ig light chain gene isotype in Xenopus laevis consists of six distinct VL families and is related to mammalian genes // The Journal of Immunolo gy. 1996. V. 157. P. 1544-1550. Hesse J. E., Lieber M. R., Mizuuchi K., Gellert M. V(D)J recombination: the functional difinition of the joining signals // Genes Dev. 1989. V. 3. P. 1053-1061. Hieter P. A., Hollis G. F., Korsmeyer S. J., Waldmann T. A., Leder P. Clastered arrangement of immunoglobulin constant region genes in man // Nature. 1981. V. 294. P. 536. Hieter P. A., Maizel J. V., Leder J., Leder P. Evolution of human immunoglobulin J region genes // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 1516. Hohman V. S., Schluter S.F., Marchalonis J. J. Complete sequence of a cDNA clone specifying sandbar shark immunoglobulin light chain: Gene organization and implications for the evolution of light ch ains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 276-280. Hohman V. S., Schuchman D. B., Schluter S.F., Marchalonis J. J. Genomic clone for sandbar shark light chain: Generation diversity in the absence of rearrangement // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 9882-9886. Hsu E., Lefkovits I., Flajnik M., Pasquier L. D. Light chain heterogeneity in the amphibian Xenopus // Molecular Immunology. 1991. V. 28. P. 985-994. immunoglobulin genes and the antibody repertoir e // Molecular Biology Evolution. 1993. V. 10(1). P. 60-72. Litman G. W., Rast J. p., Shamblott M. J., Haire R. N., Michele H., Roess W., Litman R. T, Hinds-Frey K. R., Zilch A., Amemiya C. T. Phylogenetic diversification of Lobb C. J., Olson M. O. J., Cl em W. L. Immunoglobulin light chain classes in a teleost fish // The Journal of Immunology. 1984. V. 132. P. 1917-1923. Lundqvist M., Bengten E., Stromberg S., Pilstrom L. Ig light chain gene in the siberiah sturgeon ( Acipenser baeri ) // The Journal of I mmunology. 1996. V. 157. P. 2031-2038. Maisey J. G. Chondrichthyan phylogeny: a look at the evidence // J. Ven. Paleont. 1984. V. 4. P. 359-371. Rast J. P., Anderson M. k., Ota T. Litman R. T., Margittai M., Shamblott M. J., Litman G. W. Immunoglobulin l ight chain class multiplisity and alternative organizational form in early vertebrate philogeny // Immunogenetics. 1994. V. 40. P. 83-89. Reynaund C. A., Anquenz V., Grimal H., Weill J. C. A hyperconversion mechanism generates the chicken light chain prei mmune repertoire // Cell. 1987. V. 48. P. 379-388. Roitt I., Brodstoff J., Male D. Immunology. London: Mosby-Year Book Europe, 1993. Romer A. S. Vertebrate Paleontology. Chicago: University Chicago Press, 1966. Sakano H., Huppi K., Heinrich G., Tonegawa S. Sequences at the somatic recombination sites of immunoglobulin light-chain genes // Nature. 1979. V. 280. P. 288. Sakano H., Maki R., Kurosawa Y., Roeder W., Tonegawa S. Two types of somatic recombination are necessary for the generation of complete i mmunoglobulin heavy-chain genes // Nature. 1980. V. 286. P. 676. Sanger F., Niklen, S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1977. V. 74. P. 5463-5467 Schatz G. D., Oettinger A. M., Schlissel M. S . V(D)J recombination: molecular biology and regulation // Annual Review of Immunology. 1992. V. 10. P. 359-383. Schwager J., Burckert N., Schwager M., Wilson M. Evolution of immunoglobulin light chain genes: analysis of Xenopus IgL isotypes and their con tribution to antibody diversity // The EMBO Journal. 1991. V. 10. P. 505-511. Seidman J. G., Max E. E., Leder P. A. A immunoglobulin gene is formed by site - specific recombination without further somatic mutation // Nature . 1979. V. 280. P. 370. Shamblott M. J. and Litman G. W. Genomic organization and sequences of immunoglobulin light chain genes in a primitive vertebrate suggest coevolution of immunoglobulin gene organization // The EMBO Journal. 1989. V. 8. P. 3733-3739. Shankey T.V. and Clem L.W. Phylogeny of immunoglobulin structure and function. IX. Intramolecular heterogeneity of shark 19S IgM antibodies to the dinitrophenyl hapten // J. Immunol. 1980. V. 125. P. 2690-2698. Stavnezer J., Kekish O., Batter D., Grenier J., Balazs I., Henders on E., Zegers B. J. Aberrant recombination events in B cell lines derived from -deficient human // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 3495-3514. Stewart S. E., Pasquier L. D., Steiner L. A. Diversity of expressed V and J regio ns of immunoglobulin light chains in Xenopus laevis // European Journal of Immunology. 1993. V. 23. P. 1980-1986. Strob U. Transgenic mise with immunoglobulin genes // Annual Review of Immunology. 1987. V. 5. P. 151-174. Thompson G. B. and Neiman P. E. S omatic diversification of the chicken immunoglobulin light chain gene is limited to the rearranged variable gene segment //Cell. 1987. V. 48. P. 369-378. Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity // Nature. 1983. V. 302. P. 575-581. Udey J. A. , Blomberg B. Human light chain locus: organization and DNA sequences of three genomic J regions // Immunogenetics. 1987. V. 25. P. 63. Wai Lin Tung, King-C. Chow. A modified medium for efficient electrotransformation of E. coli // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 4. Р . 128-129. Wilson M., Hsu E., Marcuz A., Courent M., Pasquier L. D., Steinberg C. What limits affinity maturation of antibodies in Xenopus: the rate of somatic mutation or the abilityto select mutants? // T he EMBO Journal. 1992. V. 11. P. 4337. Zezza D. J., Mikoryak C. A., Schwager J., Steiner L. A. Sequence of C region of L chains from Xenopus laevis Ig // The Journal of Immunology. 1991. V. 146. P. 4041-4047. Zezza D. J., Stewart S. E., Steiner L. A. Gen es encoding Xenopus laevis Ig L chains. Implications for the evolution of and chains // The Journal of Immunology. 1992. V. 149. P. 3968-3977.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Женщины — это слабый пол. Но жёны в эту категорию НЕ ВХОДЯТ!
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, курсовая по медицине и здоровью "Клонирование и анализ генов стерляди", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru