Аллергические заболевания органов дыхания у детей
Полиморфизмы генов NO-синтаз и их ассоциация с бронхиальной астмой и патогенетическими признаками болезни у детей
Главными патогенетическими признаками бронхиальной астмы (БА) считают атопию и состояние бронхиальной гиперреактивности. Оксид азота играет важную роль в развитии БА, поскольку он, являясь сигнальной молекулой, участвует в механизмах формирования как атопии, так и гиперреактивности бронхов [Barnes P.J., 1998; Lundberg J.O.N., Weitzberg E.,1996].
Синтез NO осуществляется семейством NO-синтаз (КФ 1.14.13.39): нейро-нальной (NOS-I), эндотелиальной (NOS-III) и индуцибельной (NOS-II). Все они являются продуктами различных генов, расположенных на разных хромосомах [GINА, 2002].
Наиболее вероятным кандидатом на участие в развитии БА является ген NOS-I [Grasemann H. et all., 1999]. Существуют исследования, показывающие связь полиморфных вариантов генов NO-синтаз с уровнем вырабатываемого (эндогенного) оксида азота, что в свою очередь зависит от активности мРНК генов NO-синтаз. Учитывая вышесказанное, можно ожидать значительный вклад полиморфизмов промоторной области генов NO-синтаз как факторов риска в развитие заболеваний, при которых отмечается нарушение нормальной выработки NO, в частности при БА.
Цель данного исследования - изучение ассоциации полиморфизмов промоторной области генов NO-синтаз у детей, больных БА, с клиническими и функциональными характеристиками болезни. Нами обследовано 88 детей в возрасте от 7 до 13 лет (мальчиков, девочек), больных БА, находившихся на лечении в отделении аллергологии Областной детской больницы в 2002-2003гг. Средний возраст больных составил 10,5±1,8 лет. Диагноз БА верифицировался в соответствии с положениями Национальной программы «Бронхиальная астма у детей. Критерии лечения и профилактика». Средняя продолжительность заболевания к моменту обследования составила 3,3±0,5 года. Контрольную группу составили 26 практически здоровых детей того же возраста, проживающих в г.Томске.
Для оценки функции внешнего дыхания (ФВД) проводили анализ кривой поток-объем и показателей спирометрии. Исследование ФВД выполняли по стандартной методике на аппарате Master Lab Pro («Эрих Йегер», Германия). Степень реактивности дыхательных путей оценивали в мета-холиновом тесте (РС20). Измерение уровня общего сывороточного IgE было проведено с использованием твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартного набора («Вектор Бест», г.Новосибирск). Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Полиморфизм генов NO-синтаз в промоторной области определяли по следующей методике. Состав реакционной смеси (50 мкл): 67 мМ трис-НС1, рН 8,8; 16,7мМ сульфат аммония; 1,5 мМ хлорид магния; по 0,2 мМ каждого dNTP; 0,1 %
твин-20; 50-100 нг геномной ДНК человека; 2 ед. tag-полимеразы, по 5 пикомоль каждого из прай-меров, специфичных для NOS-I, NOS-II, NOS-II1:
NOS-I sense primer-5'-TTCGGCTGTGCTTTGATGGA-3'
NOS-I anti-sense primer-5'-GTTGACCGACTGGATTTAGGGCTCT-3'
NOS-II sense primer-(5'-GCCTTCTGGAACCTGGGATTT-3') и
NOS-II anti-sense primer-(5'-TTCGACTCGCTACAAAGTTAT-3');
NOS-III sense primer-5'-GCCAAGGGCACCGGCATCACCAGGA-3'
NOS-III anti-sense primer-5'-GTTACCAGCACCAGCGTCTCGT-3'
Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР): преднагрев: 95" С -5 мин.; основная программа - 38 циклов: 95° С- 15 с (денатурация); 55" С - 15 с (отжиг); 72° С-40 с (синтез 2-й цепи); заключительная стадия: 72' С - 1мин. Термоциклер - «Терцик» (ДНК-Технология, г.Москва). В результате ПЦР получали фрагменты ДНК длиной 656, 500, 260 пар нуклеотидов соответственно для NOS-I, NOS-II, NOS-III. Для выявления полиморфизмов использовали анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP, single-strand conformational polymorphysm).
Тотальную РНК выделяли с помощью коммерческого набора TRIZOL™ (GibcoBRL, Life Technologies). ПолиА-PHK получали на колонках с олиго-dTцеллюлозой (ICN, США) и проводили обратную транскрипцию в течение 1 ч при 37' С. кДНК амплифицировали с праймерами, специфичными для мРНК NOS-I, NOS-II, NOS-III, синтезированными на ДНК-синтезаторе ASM 800:
мРНК NOS-I sense-5'-ATGGCTTGCCCCTGGAAGTT-3'
мРНК NOS-I anti sense-5'-GCCACAACAGTGGCAACAT-3'
мРНК NOS-II sense-5'-AGTTTGACCAGAGGACCCAG-3'
мРНК NOS-II anti sense-5'-CGAGGAGGCTGCCCTGCAGA-3'
мРНК NOS-III sense-5'-GTTGATGCGGAGGGAACCGA-3'
мРНК NOS-III anti sense-5'-GAACTGGAAGTAACGTGCCG -3'
Глицеральдегид 3-фосфат дегидрагепаза (ГАФД) использована как положительный контроль экспрессии мРНК. Показатели экспрессии выражали в процентах относительно активности ГАФД, которая принималась за 100%. ГАФД:
Sense primer - (5'-GAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC-3');
Anti-sense primer - (5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCA-3').
Оценку специфичности продуктов амплификации проводили с помощью «nested-ПЦР». Оценку нормальности распределения полученных результатов по каждой величине проводили с помощью критерия Колмагорова-Смирнова. Статистическую обработку результатов для признаков с нормальным распределением проводили с использованием t-критерия Стьюдента, для признаков, не соответствующих нормальному закону распределения, применяли U-mecma Манна-Уитии. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия Пирсона. Сравнение распределения частот паттернов в группах обследованных проводили с использованием точечного критерия Фишера. Относительный риск (RR-Relative Risk) вычисляли по формуле:
RR=(a+0,5).(d+0,5)/(b+0,5Hc+0,5)
где а - число больных с наличием данного паттерна; b - с отсутствием данного паттерна; cud- число здоровых, с наличием и отсутствием данного паттерна соответственно; параметр 0,5 в этой формуле используется как поправка на малочисленность выборки. При оценке результатов было принято, что RR>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с данным полиморфным вариантом («фактор риска»), a RR<1 как отрицательную ассоциацию («фактор устойчивости»).
Результаты: При изучении уровня экспрессии NO-синтаз у детей, больных БА различной степени тяжести, установлена высокая активность матричной РНК (мРНК) NOS-I при тяжелой и среднетяжелой БА (р<0,05). В свою очередь активность мРНК NOS-III у всех больных детей, вне зависимости от тяжести заболевания, была достоверно выше (р<0,05), чем в группе контроля. Следует отметить, что при тяжелой БА активность мРНК NOS-II была достоверно выше, чем при БА легкой и средней степени тяжести, а также почти в 10 раз превышала уровень экспрессии NOS-II в контрольной группе (табл. 1).
Уровень экспрессии мРНК генов NO-синтаз у больных бронхиальной астмы различной степени тяжести
Уровень экспрессии мРНК генов NO-синтаз у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе
Уровень экспрессии мРНК |
NOS1 |
NOS2 |
NOS3 |
Уровень экспрессии мРНК (контрольная группа) |
4,4+0,18% |
16,37±0,61% |
1,48±0,16% |
Уровень экспрессии мРНК (БА легкой степени тяжести) |
4,0±0,22% |
29,0±2,72%* |
5,0±0,34%* |
Уровень экспрессии мРНК (БА средней степени тяжести) |
13,0±0,25% |
71,0+6,83%* |
2,0±0,3% |
Уровень экспрессии мРНК (БА тяжелой степени) |
14,0±0,39%* |
156,0±3,86%* |
4,0±0,26%* |
Примечание: * - р<0> |
Уровень экспрессии мРНК |
NOS-1 |
NOS-2 |
NOS-3 |
||||||||
паттерны |
|||||||||||
11 |
12 |
13 |
21 |
22 |
23 |
24 |
31 |
32 |
33 |
34 |
|
Уровень экспрессии МРНК (БА) |
6,29 ±0,33 |
6,77 ±0,49 |
6,31 ±0,5 |
92,3 ±4,08* |
94,5 ±2,5* |
86,7 ±2,36* |
151,25 ±2,3* |
3,9 ±0,29 |
4,5 ±0,01 |
2,75 ±0,26 |
4,47 ±0,58* |
Уровень экспрессии мРНК (контроль) |
3,86 ±0,09 |
4,75 ±0,25 |
5,8 ±0,2 |
15,8 ±1,46 |
19,3 ±1,67 |
15,7 ±0,63 |
— |
1,48 ±0,19 |
2,6 ±0,42 |
2,5 ±0,26 |
1,0 ±0,01 |
Примечание: * р<0> |
Методом корреляционного анализа установлена обратная связь между уровнем экспрессии NOS-II и показателями, характеризующими функцию легких, такими как ОФВ1(г=-0,5; р=0,0001), ФЖЕЛ (г=-0,4; р=0,001), ПВС% (г=-0,2; р=0,04). Наиболее высокий коэффициент корреляции получен между активностью мРНК NOS-I и изменениями, характерными для бронхиальной обструкции (ОФВ! (г=-0,6; р=0,0001), ОФВ/ ФЖЕЛ (г=-0,24; р=0,025)).
В рамках проводимого исследования было обнаружено три полиморфных варианта (паттерна) в промоторной области гена NOS-I: NOS-11, NOS-12 и NOS-13. В группе больных БА средней степени тяжести частота встречаемости паттерна NOS-13 была достоверно выше (р<0,05), чем в группе контроля и в группах с легкой и тяжелой БА.
В промоторной области гена NOS-II было идентифицировано четыре вида паттернов: NOS-21, NOS-22, NOS-23 и NOS-24. У больных среднетяжелой БА паттерн NOS-21 встречался в 1,5 раза чаще, чем в других группах (р<0,05). Обнаружено, что у здоровых детей и у детей с легкой Б А отсутствовал паттерн NOS-24, тогда как при тяжелой и среднетяжелой БА частота его встречаемости составляла 4,5% и 4,8% соответственно.
Для промоторной области гена NOS-III было получено четыре полиморфных варианта: NOS-31, NOS-32, NOS-33 и NOS-34. Установлено, что при БА легкой и средней степени тяжести значительно чаще встречался паттерн NOS-34 (30,4% и 23,8% соответственно против 11,5% в группе контроля). При тяжелой БА достоверно возрастала частота паттерна NOS-33 (р<0>
При наличии паттернов NOS-34 и (или) NOS-24 обнаружено достоверное повышение экспрессии мРНК по сравнению другими вариантами полиморфизмов в этих генах (р<0,05) (табл.2). Относительный риск (RR) для данных паттернов составлял 1,53 и 2,17 соответственно. Полученные результаты в данном случае доказывают наличие положительной ассоциации заболевания с полиморфными вариантами NOS-24 и NOS-34 («фактор риска»).
Наряду с этим у больных БА установлена положительная зависимость между уровнем IgE и наличием паттерна NOS-34 (г=0,2; р=0,04) и отрицательная при наличии NOS-31 (г=-0,2; р=0,04). Следует также отметить, что в контрольной группе частота обнаружения паттерна NOS-31 была достоверно выше, чем у детей с БА (80,8% и 68,6% соответственно) (р<0,05), a RR составил 0,64, что может рассматриваться как отрицательная ассоциация паттерна NOS-31 с данным заболеванием («фактор устойчивости»).
Таким образом, наличие у детей определенных полиморфных вариантов промоторной области генов NO-синтаз может оказывать влияние на феноти-пические проявления БА и важных патогенетических признаков болезни. В развитие астматического синдрома включено множество генов разных локу-сов, каждый из которых может вносить небольшой вклад в общую подверженность заболеванию. Гены NO-синтаз являются лишь одними из множества генов предрасположенности к БА, взаимодействующих между собой и с окружающей средой.