Курсовая: Хроматографическое разделение углеводов - текст курсовой. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Курсовая

Хроматографическое разделение углеводов

Банк рефератов / Химия

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Курсовая работа
Язык курсовой: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Microsoft Word, 2924 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникальной курсовой работы

Узнайте стоимость написания уникальной работы

- 21 - - 21 - “Хроматографическое разделение углеводов” ВВЕДЕНИЕ: ХРОМАТОГРАФИЯ Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos - цвет, краска), ф и зико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компоне н тов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через непо д вижную. Историческая справка. Метод разработан в 1903 М. Цветом, который показал, что при пропу с кании смеси растительных пигментов через слой бесцветного сорбента индивидуальные вещ е ства располагаются в виде отдельных окрашенных зон. Полученный таким образом послойно окрашенный столбик сорбента Цвет назвал хроматограммой, а метод - хроматографией. Вп о следствии термин "хроматограмма" стали относить к разным способам фи к сации результатов многих видов хроматографии. Однако вплоть до 40-х гг. хроматография не получила должн о го развития. Лишь в 1941 А. Мартин и Р. Синг открыли метод распределительной хромат о графии и показали его широкие возможности для исследования белков и углеводов. В 50-е гг. Мартин и американский учёный А.Джеймс разработали метод газо-жидкостной хроматогр а фии. ПУТИ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА И ВОЗМОЖНОСТИ КЛАССИФИКАЦИИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ За последние годы в развитии теории и практики хроматографии имеются определенные успехи. Теория хроматографии получила успешное развитие в работах сове т ских ученых С.Е. Бреслера, А.А. Жуховицкого, В.В. Рачинского, С.3. Рогинского, Г.В. Са м сонова, О.М. Тодеса и Н.Н. Туницкого. Однако теория хроматографии нуждается в дальнейшем углубленном развитии, в ос о бенности в направлении предсказания оптимальных условий разделения сложных смесей в отдельных конкретных случаях, а также и в отношении учета особенностей со р бентов и носителей. Для решения сложных дифференциальных уравнений в настоящее время мо ж но применять компьютерные методы, что позволяет значительно продвинуться в о б ласти теории хроматографии, освобождая исследователей от необходимости примене ния пр и ближенных методов решения. Недостаточно развивается также теория зависимости адсор б ции и распределения веществ от их химиче ского строения. В этом направлении были до с тигнуты успехи в работах А.В. Киселева, акад. П.А. Ребиндера. П.А. Ребиндер вывел также правило уравнивания полярностей, имеющее важное знач е ние для хроматографии. Хроматографические процессы на колонках и в толще бумаги в известной степени примыкают к области физико-механических процессов фильтрации и с тинных и коллоидных растворов, фильтрации и сорбции макромолекул, мицелл, эмульсий и суспензий. Метод хроматографического анализа представляет собой один из видов физико-химического анализа, который отличается от других видов анализа в той же мере, в к а кой, например, весовой анализ от объемного. Характерной чертой хроматографического метода является распреде ление разделяемых веществ между двумя несмешивающимися фазами, приводящее к разделению компоне н тов данной смеси. При этом одна фаза может быть твердой, а другая газообра з ной или жидкой, или же обе фазы могут быть жидкими и помещенными на какой-либо носитель. Вещества, заключающиеся в разделяемой смеси, в процессе хрома тографического ра з деления перемещаются из одной фазы в другую. Процесс хроматографического разделения смеси веществ состоит в пространс т венно-различном распределении каждого компонента данной смеси между двумя фазами, с последующим полным разделением смеси путем применения операции в ы мывания или вытеснения выделяемого вещества или получения осадка. Причиной такого разделения являются различия во взаимодействии каждого из компонентов данной смеси веществ, находящихся в первой фазе (растворитель), со второй фазой, называемой сорбентом (твердым или жидким), или с осадителем, помещенным на носителе. Теоретически можно ожидать двух способов осуществления хроматографического пр о цесса: 1) жидкая или газообразная фаза проходит через неподвижную твердую фазу (через колонку или мембрану); 2) твердый сорбент в виде зерен или мембраны перемещается в не подвижной жи д кой или газовой фазе, подвергаемой разделению. Таким образом, нужно учитывать не только движение жидкости или газа через колонку сорбента или носителя, но и возможность движения сорбента или носителя через непо д вижную жидкость или газ. Вероятно, могут быть предложены еще некоторые варианты хроматографических разделений, не укладывающиеся в эти типы разделений. В основном хроматография является методом количественного раз деления и определ е ния компонентов сложной смеси. Это ее целевое на значение. Поэтому усилия теории хромат о графии должны быть направлены на достижение наибольших успехов в решении этой зад а чи, путем выяснения оптимальных условий разделения. Формулировка особенностей хроматографического процесса должна предусматр и вать не только первоначальное распределение, но и последу ющее промывание хроматограммы («проявление» по терминологии М. С. Цвета), обеспечивающее наиболее полное раздел е ние компонентов данной смеси. Предложенная формулировка общих особенностей хрома тографического процесса обращает внимание не только на причину разделения, но и уч и тывает характерные различия процессов разделения. В реальном процессе хроматографии часто сочетаются различные виды сорбции, н а пример молекулярная и ионообменная. Первая существенная особенность хроматографических процессов — это многократное повторение актов сорбции — десорбции, ионного обмена или распределения между фаз а ми и динамический характер этих процессов. Вторая особенность — наличие большой поверхности сорбента и большой поглот и тельной емкости. Адсорбционной хроматографии применяется или промывание или вытеснение, в распределительной хроматографии — только промывание, в ионообменной — только выте с нение. Необходимо указать, что непосредственное получение зон чистых веществ в ос а дочной хроматографии объясняется тем, что операция проявления или вытеснения заменяется процессом выделения вещества в осадок, т. е. образованием новой, отдифференц и рованной фазы; пока не закончится выделение осадка одного состава, не начнется выделения оса д ка другого состава (Пример: две различные кристаллические модификации и о дида ртути образуются на осадочных хроматограммах раздельно, так как они имеют различную раствор и мость). На практике трудно осуществить в чистом виде только молекулярную, только полярную или только гомеополярную сорбции. Они всегда сочетаются в реальном хроматографическом процессе. Нужно принимать во внимание особенности сорбентов и носителей, уч и тывая, что не существует несорбирующих носителей, и что различные механизмы хроматографического пр о цесса протекают одновременно и параллельно. В свете высказанных соображений очень интересна работа В. И, Па рамоновой с сотрудн и ками, предложившей изучать состояние вещества в растворе методом выходных кривых. Этим методом удалось доказать одновременное существование в растворе исследуемого х и мического эле мента — катионов, анионов, коллоидных частиц и нейтральных молекул. При этом примен я лись также и другие методы исследования, как, например, ультрафильтрование, диализ, эле к тродиализ. В работе В.А. Алесковского описан метод тонущих частиц, при меняемый для анализа весьма разбавленных растворов и представляю щих пример движения сорбента через толщу раств о ра. Различные приемы хроматографии в настоящее время получают все большее примен е ние, как методы химического анализа. В особенности ценно то, что хроматография открывает новые во з можности системати ческого или дробного бессероводородного метода анализа. Различные виды хроматографических процессов могут быть сопо ставлены на следующей схеме (табл. 1). Вид хромат о графии Адсорбционная Ионообменная Распределительная Осадочная Окислительно-во с становительная Комплексообразовательная Действующие силы Молекулярные Молекулярные Ионные Ионные Переход электронов Гомеополярные св я зи Агрегатное состояние сорб и рующей фазы Твердая Жидкая Твердая Жидкая В 1951 г. Стрейн предложил различать четыре вида хроматогра фии (табл. 2). Неподвижная хроматографи-рующая фаза Поверхностно-активная твердая фаза Ионообменная см о ла или пермутит Связанные гели или жидкости Химически реа к ционно-способные в-ва Вид хроматогр а фии Адсорбционная хроматография Ионография, ради о ионография Распредели-тельная хроматография Хемихроматогр а фия Наряду с этим Стрейн дал также классификацию подвижной жидкой фазы, применя е мой в различных видах хроматографических процессов (табл. 3). Вид растворителя жидкой подвижной фазы Аполярные растворители (неи о низирубщие) Ионизирующие полярные раств о рители Растворители, имеющие сро д ство к сорбенту Растворители, реагиру ю щие с растворенным в е ществом Вид хроматогр а фии Хроматография аполярных раств о ренных в-в Ионой обмен и электромиграция Анализ выте с нением Образование новых с о единений с различными коэффициентами распр е деления и зарядами, п у тем комплексообразов а ния Методы распределительной и ионообменной хроматографии целесооб разно сопоставить с другими методами анализа, например с такими, как микрокристаллоскопический, капел ь ный, дробный и др. Деление хроматографии на молекулярную, ионообменную, распреде лительную, осадо ч ную и другие ее виды можно сравнить с подразде лением количественного объемного анализа на методы нейтрализации, окисления-восстановления, осаждения и комплексообразования. С о вре менная хроматография оказалась применимой как для качественных, так и для количестве н ных определений./1/ Термины и определения СОРБЕНТ — твердое вещество, жидкость или их смеси, способные поглощать или удерж и вать газы, пары или растворенные вещества и используемые в хроматографии в качестве н е подвижной фазы. АДСОРБЕНТ — твердый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества. Адсорбентом заполнена хроматографическая колонка, в к о торой, в свою очередь, происходит разделение смеси веществ на отдельные компоненты. СОРБАТ — компонент анализируемой смеси, внесенной в хроматографическую колонку. ЭЛЮЕНТ — растворитель или смесь растворителей, предназначенная для прокачки анализ и руемой смеси через хроматографическую колонку (подвижная фаза). ЭЛЮАТ — раствор, выходящий из хроматографической колонки. ХРОМАТОГРАММА — графический результат хроматографического процесса. Хромат о граммой (с точки зрения аппаратурного оформления) можно назвать зависимость отклика д е тектора хроматографа от времени при прохождении элюата через ячейку детектора. Хромато грамма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответствует о д ному компоненту анализируемой пробы (рис.2). Площадь или высота пика должна быть пр о порциональна концентрации компонента в элюате. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из хроматографической колонки, заполненной определенным адсорбентом, через которую при определенной температуре прокачивается элюент определенного состава. ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ ВЕЩЕСТВА — вр е мя пребывания исследуемого вещества в хроматографе. На практике время удерживания определяют от м о мента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала д е тектора. Каждое вещество при одних и тех же хроматографических условиях имеет свое время удерживания. ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ НЕСОРБИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА — время удерживания вещес т ва, которое не адсорбируется (не удерживается) адсорбентом. Рис. 1 Хроматограмма. А — амплитуда отклика детектора, Т — время, мин., tRi — времена удерживания хроматографических пиков, t ’ R 1 — исправленные времена удерживания, tM — время удерживания несорбируемого вещ е ства. Углеводы Углеводы - один из основных компонентов кл еток и тканей живых организмов, о беспечив а ют все живые клетки энергией (глюкоза и ее запасные формы - крахмал, гликоген), участвуют в защитных реакциях организма (иммунитет). Из пищевых п родуктов наиболее богаты углев о дами овощи, фрукты, мучные изделия ( крупы, овощи, фрукты и бобовые ) . Пища человека состоит примерно на 70% из углеводов. Углеводы и спользуются в качес т ве лекарств (гепарин, сердечные гликозиды, некоторые антибиотики). Повышенное содержание некоторых углев о дов в крови и моче служит важным диагностическим признаком отдельных заболеваний (сахарный диабет). Суточная потребность человека в углев о дах составляет 400-450 г. Углеводы входят в состав клеток и тканей всех растительных и животных организмов и по массе составляют основную часть органического вещества на Земле. На долю углеводов приходится около 80% сухого вещества растений и около 20% животных. Растения синтез и руют углеводы из неорганических соеди нений - углекислого газа и воды . Углеводы являю т ся очень распространенными природными соединениями, входят в состав растений и живых органи з мов. В растениях они образуются в результате фотосинтеза: Углеводы относятся к той группе органических соединений, важнейшими представител я ми которой являются сахариды, крахм ал, целлюлоза и камеди (гумми). Углеводы являются основным источником энергии для поддержания всех функций организма, в особенности де я тельности мозга, и необходимы для метаболизма всех остальных питательных веществ. Углеводы синтезируются всеми зелеными растениями, и в организме человека либо усваив а ются напрямую, либо откладываются в виде гликогена . Кроме того, углеводы могут форм и роваться в самом организме из некоторых аминокислот и глицероловой составляющей ж и ров. /2/ Углеводы - органические соединения, состав которых обычно выражается общей формулой С n (Н 2 О) m ( n и m > 4). /2/ Известны также соединения, относящиеся к углеводам, состав которых не соответствует общей формуле, например сахар рамноза С 6 Н1205. Углеводы обычно подразделяют на моносахариды, олигосахариды (продукты конденс а ции двух или нескольких молекул моносахаридов) и полисахариды. Среди олигосахаридов наибольшее значение имеют дисахариды (диозы) - продукты конденсации двух молекул монос а ха р идов. /2/ Моносахариды Моносахариды - твердые вещества, легко растворимые в воде, плохо - в спирте и совсем нерастворимые в эфире. Водные растворы имеют нейтральную реакцию на лакмус. Больши н ство моносахаридов обладают сладким вкусом, однако меньшим, чем свекловичный сахар. Мон о сахариды проявляют свойства спиртов и карбонильных соединений. (Примеры: глюкоза, фру к тоза) ./2/ Дисахариды Дисахариды (биозы) при гидролизе образуют два одинаковых или разных моносахарида. Для установления строения дисахаридов необходимо знать: из каких моносахаридов он п о строен, какова конфигурация аномерных центров у этих моносахаридов ( я - или я -), каковы ра з меры цикла (фураноза или пираноза) и с участием каких гидроксилов связаны две молекулы мон о сахарида. Дисахариды подразделяются на две группы: восстанавливающие (мальтоза) и нево с станавливающие (сахароза) . /2/ Полисахариды Полисахаридами, или полиозами, называются углеводы, молекула которых при гидролизе распадается с образованием молекул моносахаридов (как известно, неспособных гидролиз о ваться). Таким образом, схематически полисахариды можно представить как ангидридоподо б ные соединения, образующиеся при выделении воды из нескольких молекул моносах а ридов: п молекул моносахаридов— ( n — 1)Н 2 О 1 молекула полисахарида В зависимости от молекулярной массы и свойств полисахариды делят на две группы: 1. Олигосахариды (от греческого слова олигос — немногий) — низкомолекулярные полисах а риды, молекула которых при гидролизе образует небольшое число молекул моносахар и дов. Они растворимы в воде, способны кристаллизоваться, часто обладают, подобно моносахар и дам, сладким вкусом. 2. Высшие полисахариды — высокомолекулярные вещества, мало растворимые или совсем нерастворимыев воде, в большинстве случаев не кристаллизуются и не обладают сладким вк у сом. Четкой границы между олигосахаридами и высшими полиозами не существует — все они представляют собой непрерывный ряд полимерогомологов с постепенно увелич и вающейся степенью полимеризации. Обычно к олигосахаридам относят полисахариды со степенью п о лимеризации до 8— 10. Разделение полисахаридов на группы олигосахаридов и высших полиоз оправдано не только с позиций оценки их молекулярной массы и указанных различий свойств, но и с позиции техн и ки их исследования. Если при изучении олигосахаридов применяются обычные классические методы органической химии, то при исследовании высших полиоз помимо н а званных методов используются и приемы работы с высокополимерами. (Примеры: крахмал, це л люлоза). /3/ ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА УГЛЕВОДОВ /3/ Выделение и очистка высших полиоз и углеводсодержащих биополимеров представляет с о бой исключительно трудную задачу. В природных условиях эти соединения находятся в виде сложных смесей с низкомолекулярными веществами, молекулами неуглеводной природы, н а конец, с другими высокополимерными углеводами. Трудности возрастают в связи с тем, что, будучи весьма лабильными веществами, полисахариды под влиянием даже слабых воздейс т вий легко подвергаются различным изменениям: часто происходят их деполимеризация, окисление и другие изменения. Факторами, вызывающими такие измен е ния, помимо применяемых реагентов (обычно щелочной или кислой природы) являются кислород возд у ха (в связи с этим иногда выделение приходится вести в атмосфере азота), ферменты, находящиеся в клетке, ча с то связанные с самими полисахаридами (как, например, фэсфорилаза и амилаза, связанные с гранулами крахмала). ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ / 4 / Основные принципы физического разделения С разделением веществ приходится сталкиваться при каждом химическом синтезе, и оно является обычной стадией анализа. Как правило, разделение должно предшествовать идентификации вещества. Разделение относительно просто, если отдельные компоненты смеси находятся в разли ч ных фазах. В этом случае оно может быть достигнуто фильтрацией, осаждением, центр и фугированием и т. д. Напротив, если несколько веществ находятся в одной фазе, то ну ж но добиваться либо образования новой фазы путем химического превращения (напр и мер, перевода в осадок), либо применять физические методы разделения. Физические методы разделения основаны на использовании кинетических явлений или фазовых равновесий. Фазовые равновесия лежат в основе таких методов раздел е ния, как дистилляция, сублимация, кристаллизация, экстракция и адсорбция из газообразной или жидкой фазы. В этих процессах молекулы разделяемых веществ переходят через гр а ницу раздела фаз в обоих направлениях, причем они стремятся к такому состоянию распределения, при котором, несмотря на продолжающееся молекулярное движение ч е рез границу, в каждой из фаз устанавливается постоянная концентрация составляющих в е ществ. В других методах разделения, где используются кинетические явления (например, при молекулярной дистилляции или диализе), напротив, происходит перенос вещества ч е рез поверхность раздела фаз по меньшей мере за счет одного сорта молекул и только в одном направлении, потому что перешедшие через границу молекулы уд а ляются от нее. Такие методы разделения имеют незначительную эффективность. Если разделяемые компоненты мало различаются в отношении свойств, решающих для выбранного метода (например, давление пара, растворимость, адсорбируемость или размер молекул), то концентрирования вещества практически не происходит. В этом случае достаточного разделения можно достигнуть путем многократного использов а ния элементарного акта разделения. Наглядным примером такого процесса может сл у жить многократная экстракция. При дистилляции в ректификационной колонне с н а садкой или тарелками также осуществляется ряд последовательных равновесных состо я ний между жидкостью и паром. Увеличение числа элементарных актов разделения огран и чивается требованиями, которые предъявляются ко времени разделения, размерам а п паратуры и соответственно к расходу веществ. Кроме того, высокого обогащения о д ной из равновесных фаз желательным компонентом достигают только для пр о стых (не выше тройных) систем. В случае многокомпонентных смесей наряду с чистыми веществами всегда получаются смеша н ные фракции. Основной принцип хроматографического разделения Значительное повышение степени разделения возможно, если эффект, вызванный повто р ным установлением фазовых равновесий, налагается на разделяющий эффект, об у словленный кинетическими явлениями. В данном случае улавливание и удаление мол е кул, выходящих с поверхности раздела фаз (из неподвижной фазы), осуществляется благодаря постоянному движению одной из фаз (а именно подвижной фазы). Вых о дящие из неподвижной фазы молекулы, как и при фазовом равновесии, попадают в нее снова, однако при достаточно быстром движении подвижной фазы они не достигают прежнего элемента объема неподвижной фазы, а попадают в ближайший элемент объема в направлении потока. Высокая эффективность разделения может быть достигнута только благодаря ча с тым фазовым переходам, поэтому неподвижная и подвижная фазы должны иметь большую поверхность соприкосновения, а внешние условия должны быть выбраны так, чтобы молекулы разделяемых веществ были способны к быстрому обмену между дв у мя фазами. Так как эффективность разделения снижается вследствие диффузио н ных явлений, то обе фазы всюду должны иметь небольшую толщину слоя, а поток подвижной фазы до л жен быть ламинарным. Эти требования в первом приближении проще всего осуществляются, например, если по д вижная фаза протекает под действием перепада давления в трубке, наполненной мелко раздробленным сорбентом в качестве неподвижной фазы. Такая трубка, наполненная со р бентом, называется хроматографической колонкой (подобно ректификационной к о лонке в случае дистилляции). Подлежащая разделению смесь вводится в подвижную фазу и вм е сте с ней поступает в колонку. Там каждый из компонентов смеси стремится распред е литься между подвижной фазой и сорбентом в определенном отношении, соответству ю щем его адсорбируемости. Однако еще до того, как такое распределение успеет произо й ти, некоторая часть компонента в подвижной фазе продвинется дальше и на другом эл е менте поверхности неподвижной фазы должно возникнуть уже новое соотношение ко н центрации. Истинное равновесие между двумя фазами достигается в тем меньшей ст е пени, чем больше скорость подвижной фазы. Так как компоненты см е си, погло щенные в данный момент сорбентом, не участвуют в движении подвижной фазы, то к а ждому из них для прохождения колонки в общем требуется больше времени, чем для любой из м о лекул подвижной фазы. Разделение смеси достигается, если комп о ненты смеси обладают различными коэффициентами распределения между обеими фазами, т. е. если неподвижная фаза по-разному препятствует их прохождению по к о лонке. Разделение веществ, основанное на этом принципе, называют хроматографией (что при буквальном переводе на русский означает «цветописание»). Первое хроматографич е ское разделение провел русский ботаник Цвет (1903 г.), который разделил этим сп о собом хлорофилл на отдельные окрашенные компоненты. В настоящее время хроматография применяется со многими методическими изменени я ми, которые имеют одну общую основу: разделение происходит вследствие частого пер е хода молекул отдельных компонентов смеси между двумя фазами, из которых одна явл я ется неподвижной фазой с развитой поверхностью, а вторая фаза (подвижная) перемещ а ется относительно нее. Благодаря различному распределению разделяемых веществ ме ж ду неподвижной и подвижной фазами они испытывают разное замедл е ние в своем движении вдоль колонки. РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ Подвижная и неподвижная фазы могут быть образованы различными веществами. В зависимости от их свойств и вида воздействия на разделяемые вещества различаю т ся и виды хроматографии. Подвижная фаза, естественно, должна быть образована только веществами малой вязкости — газами или маловязкими жидкостями, причем хромат о графия с газообразной или жидкой подвижными фазами имеет совершенно разное экспериме н тальное оформление и различается по элементарным процессам. С этим обстоятельством связано разделение хроматографии на два основных вида. По агрегатному состоянию подвижной фазы различают газовую хромато графию и жидкос т ную хроматографию. Жидкая подвижная фаза в вертикальной колонке может протекать под действием собственного веса. Поскольку скорость диффузии разделяемых веществ в жидкости нев е лика по сравнению со скоростью диффузии в газе, то жидкую подвижную фазу необх о димо пропускать через колонку медленно. Это влечет за собой увеличение продолжительн о сти анализа, но позволяет также увеличить диаметр колонки и количество пр о бы без потери эффективности разделения. Напротив высокая скорость диффузии в случае г а зообразной подвижной фазы позволяет увеличить скорость потока этой фазы (можно работать с колонками с длиной более 10м) и уменьшить количество пробы и диаметр колонки. В эти х условиях может быть достигнута значительно более высокая эффе к тивность разделения, чем в случае жидкой подвижной фазы, так называемой разделя ю щей жидкости. Это явление аналогично экстракции, при которой также осущест в ляется распределительное равновесие. Преимущество распределительной хроматографии состоит, во-первых, в том, что жидких неподвижных фаз с различными свойствами намного больше, чем адсорбе н тов, и, во-вторых, в том, что в данном случае неподвижная фаза обладает гомогенной повер х ностью, тогда как поверхность даже самых лучших адсорбентов содержит различные це н тры повышенной адсорбционной способности. Эта неоднородность поверхности адсо р бента препятствует равномерной адсорбции или десорбции, снижая тем самым эффективность разделения колонки и, кроме того, делая почти невозможным разделение сильно адсорб и руемых веществ. В случае жидкой неподвижной фазы, напротив, сильно адсорб и руемые вещества могут быть разделены без труда. Так как имеются неподви ж ные фазы самой различной полярности, то в настоящее время хроматография может быть пр и менена практически ко всем веществам, поскольку они в какой-то степ е ни растворимы и летучи. Чтобы осуществить хроматографическое разделение пары веществ, доста точно иметь подходящую неподвижную фазу, в которой данные компоненты имели бы различную ра с творимость.Хотя распределительная хроматография была открыта как метод жидкостной хроматографии, преимущества ее полностью проявились только при использовании в газовой хром а тографии, для которой характерны высокая разделяющая способность, малая в е личина проб и широкая область температур. Идея распределительной хроматографии с газообразной подвижной фазой была высказана еще Мартином и Сингом в 1941 г., но экспер и мен тально развита только Джеймсом и Мартином в 1952 г. Для специальных целей разделения представляет интерес такой вид распределител ь ной хроматографии, при котором используется различная способность компонентов к обратимому комплексообразованию с неподвижной фазой или с добавленным к ней вещес т вом. Этот вид хроматографии ( хроматограф ия , основанн ая на комплексообразовании) делает возможным селективное разделение индивидуальных веществ или классов соедин е ний. Как показали Кремер и Мюллер (1951 г ), при применении адсорбентов в качестве неподвижной фазы в некоторых случаях переход вещества про исходит не между подви ж ной фазой и адсорбентом, а ме ж ду подвижной фазой и адсорбционным слоем, покрыва ю щим адсорбент (хроматография с использованием адсорбционных слоев). Розелиус (1957) д о бился разделения инертных газов на адсорбционном слое из двуокиси углерода. Следов а тельно, неподвижной фазой в данном случае был газ. Описанные виды хроматографии почти все экспериментально осуще ствлены как с газообразной, так и с жидкой подвижными фазами. Целесооб разно принять следу ю щие их названия: распределительная газовая хроматография, газоадсорбционная хроматография на м о лекулярных ситах, адсорбционно-жидкостная хроматография, обменно-жидкостная хр о матография. На практике наблюдаются многочисленные промежуточные виды хро матографии. Хроматография, основанная на комплексообразовании, всегда связывается с распредел и тельной хроматографией, потому что комплексообразователь находится в жидкости. Между а д сорбционной и распределительной хроматографиями не существует резкого разгранич е ния. С одной стороны, на поверхности носителя, как покрытой, так и не покрытой жидкостью, может иметь место адсорбция, с другой — адсорбционную хромат о графию можно частично приблизить к распределительной путем модификации адсорбентов. Примером этого может служить хроматография на адсорбционных слоях. Наконец, при низких те м пературах колонок может проявиться адсорбция на поверхности жидкой неподви ж ной фазы. Четкое разграничение отдельных видов хроматографии, очевидно, невозможно. Де с ти (1957) предложил в связи с этим классификацию только на основе агрегатного состо я ния обеих фаз: хроматография газ — жидкость (ГЖХ), хроматография газ — твердое тело (ГТХ), хроматография жидкость — жидкость (ЖЖХ), хроматография жидкость — твердое тело (ЖТХ). Принцип действия жидкостного хром а тографа Рис. 2 Схема жидкостного хроматографа. Любой жидкостной хроматограф состоит из сл е дующих частей: 1 — насос; 2 — узел ввода пробы; 3 — хроматографическая колонка; 4 — детектор; 5 — регистратор (самописец, интегратор или ко м пьютер); 6 — термостат колонок; 7 — узел подготовки элюента с емкостями для эл ю ента; 8 — слив элюата или коллектор фракций. Принцип действия хроматографа заключается в следующем: раствор анализируемой см е си с помощью УЗЛА ВВОДА ПРОБЫ вводится в верхнюю часть хроматографической КОЛОНКИ. С помощь НАСОСА анализируемая смесь прокачивается элюентом через хромотографическую КОЛОНКУ, в которой происходит разделение анализируемой смеси на о т дельные вещества (компоненты). Вытекающий из колонки ЭЛЮАТ, содержащий отдельные компоненты анализируемой смеси, детектируется ДЕТЕКТОРОМ, показания которого регис т рируются РЕГИСТРАТОРОМ. Рис.3. Схема газохроматографической установки. 1 — баллон со сжатым газом-носителем; 2 — вентиль; 3 — регулятор и измеритель скорости газа-носителя; 4 — дозатор; ,5 — проба; 6 — хроматографическая коло н ка; 7 — детектор; 8 — выход газа; 9 — питание детектора; 10 — преобразователь сигн а лов; 11 — ленточный самописец; 12 — терморегулятор; 13 — термостат. ПРИМЕРЫ ХРОМА Т ОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ 1. Хроматография на колонках с углем /5/ Колоночная хроматография на угле была впервые описана в 1950 г.Уистлером и Дерсо. Они использовали этот метод для разделения углеводов на классы в зависимости от ст е пени их полимеризации, т. е. моносахариды, дисахариды, трисахариды и т. д. Согласно работе, разделение проводилось как ступенчатое элюирование углеводов во д ным спиртом из колонки, содержащей смесь угля с целитом. Этот метод получил распростр а нение и особенно широко применялся для разделения серии гомологичных олигос а харидов. Однако разделения более сложных смесей, например олигосахаридов одного и того же класса, необходимо градиентное элюирование. Хроматография на колонках с углем пригодна не только для разделения олигосахар и дов, она также применялась для разделения кислых углеводов, многоатомных спиртов и их ацетатов, олигосахаридов, содержащих аминосахара, и метиловых эфиров с а харов . В ка ждом случае хроматография на угольных колонках, по-видимому, превосходит все другие методы, так как позволяет добиться желаемого разделения; о д нако, если нужно разделить сложную смесь, обычно необходимо предварительное градиентное элюиров а ние. Новый метод разделения дисахаридов был опубликован в 1955 г.; он основан на способности нек о торых дисахаридов образовывать в мягких условиях метилфуранозиды. Эти метилглюкоз и ды абсорбируются сильнее свободных са ха ров. Хроматография на угольной колонке удобна еще и тем, что угольная колонка обладает высокой емкостью, а это позволяет количественно выделить компоненты и разделить бол ь шие количества материала. На эффективность разделения не влияет присутствие неорган и ческих солей или степень разведения раствора сахара. В лабораториях некоторых исслед о вателей для дезактивации угля применялась концентрированная соляная кислота. Элм, Вильям с и Тизелиус насыщали уголь стеариновой кислотой (1% кислоты в 96%-ном спирте). Предварительная дезактивация или насыщение увеличивает возврат введенных в к о лонку веществ почти до 100%, позволяет элюировать сильно адсорбирующиеся высшие олиг о сахариды и улучшает разрешение зон. Чтобы исключить малое количество растворенного неорган и ческого вещества, вносимое с наполнителем, указанные авторы часто считали удобным г о товить колонки без целита. Если исключить целит проведение операций значительно упр о щается в том случае, когда вместе целита применяют уголь двух степеней измельчения: смесь крупнозернистого угля и обычного дарко G -60. МЕТОДИКА . ( описано применение колонки, содержащей только уголь. ) . Равные вес о вые части угля дарко G -60 и целита № 535 смешивают в сухом виде, к смеси пр и бавляют воду и полученную жидкую пасту помещают в стеклянную хроматографическую колонку, закр ы тую снизу стеклянной ватой. Через колонку медленно, по каплям пропускают концентрированную соляную кислоту, чтобы дезактивировать уголь и о т мыть следы железа и золы. После этого через колонку пропускают дистиллированную в о ду до получения нейтрального элюата. Для уменьшения длительности операций на этой и всех последу ю щих стадиях можно применять отсасывание. Сахара вводят в колонку в виде водного обычно 1— 10%-ного раствора. Для эффекти в ного разделения на каждый грамм смеси сахаров берут 150 мл смеси угля и целита. Разд е ление сахаров можно проводить как ступенчатым, так и градиентным элюированием. Напр и мер, смесь, содержащая по 1 г d -глюкозы, мальтозы и рафинозы, была разделена в к о лонке 3,4 X 17,0 см последовательным элюированием 800 мл воды, 1500 мл 5%-ного спирта и 700 мл 15%-ного спирта. Для того чтобы избавиться от растворенного неорганического вещества, которое неи з бежно сопутствует в целит е , обычно применяют два метода. Так как неорганическое вещество становится относительно мало растворимым, после того как оно было высушено, иссл е дуемый образец выпаривают досуха, смешивают с небольшим количеством воды и фильтр у ют. Такую операцию повторяют трижды, и этого обычно достаточно для удаления неорг а нического вещества. Другой способ заключается в следующем: к водному раствору пр и бавляют метиловый или этиловый спирт, смесь нагревают до 60° и выпавший хлопь е видный осадок удаляют фильтрованием. 2. Хроматография на колонке с целлюлозой /5/ Распределительная хроматография была впервые применена для разделения углеводов в 1949 г. С тех пор этот метод широко исполь зуется в препаративной химии угл е водов. Область применения этого метода в химии углеводов настолько обширна, что нет нео б ходимости рассматривать частные примеры его использования. МЕТОДИКА . В качестве колонок можно использовать обычные хроматографич е ские трубки. Успех всякого разделения на распределительной колонке с целлюлозой зависит от четкости границ зон и объемного разделения между зонами. Че т кость границ возрастает, если диаметр колонки уменьшается. Объемное разделение между зонами улучшается при возрастании высоты колонки. Но по мере того как высота колонки возрастает и уменьшается ее диаметр, уменьшается и количество материала, кот о рое можно разделить на колонке, возрастает капиллярное сопротивление и уменьш а ется скорость потока жидкости, орошающей колонку. Эмпирически найдено, что соотнош е ние высоты и диаметра колонки должно быть равно 9:1. Количество вещества, которое можно ввести в колонку, зависит от легкости разделения компонентов. Загрузка для каждого индивидуального компонента приблиз и тельно пропорциональна величине его. Наполнение колонки является наиболее важной при проведении хроматографии на целлюлозе. На фарфоровый фильтровальный диск, который служит дном обычной хр о матографической колонки, вначале помещают либо кусочки фильтровальной бумаги, либо стеклянное волокно. После этого в колонку загружают промытый водой и в ы сушенный стандартный порошок целлюлозы. Для заполнения колонки можно применять сухой порошок целлюлозы, суспензию целлюлозы. Для приготовления суспензии обычно и с пользуют ацетон. Порошок целлюлозы смешивают с ацетоном в гомогонизаторе Уори н га до тех пор, пока не получится однородная суспензия средней консистенции. Полученную суспензию переносят в стеклянную трубку. Ацетон стекает ч е рез дно трубки, а суспензию медленно перемешивают стеклянной палочкой как раз над линией осед а ния для равномерного заполнения трубки и что бы предупредить образование трещин. Хром а тографическая трубка все время должна быть почти доверху заполнена суспензией. Когда колонка заполнена на нужную высоту, ац е тону дают стечь, тщательно следят за тем, чтобы не обнажалась поверхность целлюлозы. Сверху на слой целлюлозы помещают кусочек п о ристой фильтровальной бумаги. После этого колонку в течение нескольких дней тщательно промывают растворителем, который будет применяться для орошения колонки при хром а тографировании. Колонка должна быть всегда заполнена жидкостью, так как, если она ст е чет или испарится, объем целлюлозы может уменьшиться и у стенок трубки могут образ о ваться зазоры. Когда растворитель проходит через колонку, частички целлюлозы поглощ а ют воду и разбухают, образуя плотный слой. Плотность заполнения определяется консистенцией применяемой суспензии. Если суспе н зия слишком жидкая, набивка будет слишком плотной и возможно частичное фракцион и рование целлюлозы по размерам частиц. Если нужно приготовить колонку для хроматографирования с большей скоростью п о тока, при заполнении ее вместо ацетона можно применить более вязкий растворитель н-бутанол. Для колонок с менее плотной набивкой некоторые исследователи предпочитают готовить суспензию на том же растворителе, который будет применяться для колонки при хр о матографировании. При работе с препаративными колонками, в частности с колонками значительной высоты, в тех случаях, когда желательно увеличить скорость тока раствора, лучше пр и менять избыточное давление. Применение вакуума в последнем случае часто приводит к уменьш е нию количества растворителя в нижней части колонки и последующему нарушению раздел е ния в этой зоне. Равномерность заполнения колонки можно проверить, пропуская через нее раствор крас и теля, например метилрота, в растворителе, который будет применяться. Для этого раств о рителю дают стечь с верха к олонки, после чего добавляют из медицинской капельницы пр и готовленный раствор красителя, равномерно распределяя его по поверхности целлюл о зы, а затем вымывают растворителем, возвращая на место резервуар с растворителем, как только окрашенная зона начнет двигаться вниз вдоль колонки. Если краситель движется вдоль к о лонки как горизон тальная окрашенная зона, колонка заполнена равномерно и годна к употреблению. Если окрашенная зона движется неровно, колонка заполнена непр а вильно и ее нужно заполнить снова. Наиболее удобные растворители для колонки определяются посредством хроматографии на бумаге. Большинство растворителей, применяемых в хроматографии на бумаге, можно и с пользовать для колонки при хроматографировании на целлюлозе. Однако муравьиная кисл о та, если ее применять в течение длительного времени для колонки с целлюлозой, вызывает деструкцию целлюлозы и колонка становится неприемлемой для дальнейшей работы. Кроме того, муравьиную кислоту трудно удалить из элюата, поэтому применения ее следует изб е гать. Если используемый растворитель содержит кислоту (например, уксусную) или основ а ние (например, пиридин), их следует удалить из илюата, прежде чем начать упаривание последнего, чтобы избежать изменений выделяемых сахаров или их произво д ных. С этой целью элюат обычно встряхивают в делительной воронке с равным объемом в о ды, а затем водный слой экстрагируют эфиром в течение нескольких часов в эк с тракторе. Эта методика не применима к таким производ ным сахаров, как, например, метиловые эфиры, и в этих случаях для удаления кислот и оснований нужны особые методы. Все органические растворители, которые применяются для колонок при хроматогр а фировании на целлюлозе, перед употреблением следует перегнать, чтобы избежать появл е ния масел и смол при последующем концентрировании фракций. Колонку следует помещат ь в комнате с постоянной температурой — обычно 20— 25°, хотя иногда необходима и более высокая температура, так как при этом возрастает скорость потока и можно использовать более высокие концентрации реагентов. Необх о димо избегать колебаний температуры, так как понижение температуры может привести к в ы делении воды из раствора и нарушить разделение. Это обстоятельство особенно существенно при применении в качестве растворителя н-бутанола, н а сыщенного водой. Образец, свободный от неорганических солеобразных веществ растворяют в минимал ь ном количестве воды (фиксируя ее объем). К раствору добавляют сухой порошок це л люлозы в таком количестве, чтоб ы порошок был увлажнен, и к полученной смеси пр и бавляют дополнительное количество органических компонентов элюента. Пол у ченную суспензию помещают в колонку поверх слоя целлюлозы. После того как образец н е много осядет, поверх него осторожно помещают слой сухого порошка целлюлозы толщ и ной 2,5 см, накрывают кружком из пористой фильтровальной бумаги и начинают пр о пускать растворитель для колонки. Отбор фракций производится с помощью различных автоматически коллекторов; они работают по принципу измерения веса, объема фракций или времени элю и рования. Компоненты можно определить с помощью различных общих цветных реакций. Га р делл применял построение концентрационных кривых элюата и сравнивал их с аналогичными кривыми, полученными для стандартных растворов сахара в том же с а мом растворителе. Наиболее простой качественной пробой, по-видимому, является капельная пр о ба: на фильтровальную бумагу помещают каплю элюата и обрабатывают бумагу щ е лочным раствором нитрата серебра. Во многих случаях желательно помещать капли вытекающего элюата на хромат о графическую бумагу и проявлять ее обычным способом. 3. Тонкослойная хроматография / 6 / 3.1. КАЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ САХАРОВ Качественный анализ смесей методом ТСХ позволяет определить а) число компонентов в анализируемом образце б) подвижность каждого компонента относительно фронта растворителя . При качественной тонкослойной хроматографии необходимо учитывать следующие полож е ния: - При повышении температуры разделение, как правило, ухудшается. Влияние температ у ры не настолько велико, как в бумажной хроматографии, но, если проявляющая смесь содержит ле г колетучие растворители, состав ее может измениться. - Оптимальная толщина слоя сорбента равна примерно 0,25 мм. - Небольшое содержание воды в сорбенте играет большую роль только при разделении прои з водных углеводов в неполярных растворителях. Тонкослойная хроматография (ТСХ) в том виде, в каком она известна сейчас впервые б ы ла описана Шталем 1958 г., а в 1961 г. появилось первое сообщение о применении ТСХ для разделения углеводов. Начиная с этого времени ТСХ широко используется для идентифик а ции углеводов, в том числе незамещенных моно- и олигосахаридов и различных производных сах а ров и сложных эфиров, циклических ацеталей и других производных. Тонкослойная хромат о графия имеет ряд преимуществ перед бумажной хроматографией: 1. Анализ занимает настолько мало времени, что результат становится известным уже ч е рез несколько минут, это делает ТСХ удобным методом при слежении за ходом реакции. 2. ТСХ можно использовать для разделения как свободных са харов, так и их производных. 3. Метод характеризуется высокой разрешающей способностью, например позволяет разд е лить производный аномеров с молекулярным весом вплоть до 1500. 4. Для обнаружения пятен можно использовать различные реагенты, так как применяемые н е органические сорбенты намного прочнее бумаги. 5. Для анализа можно брать большие количества веществ, что облегчает обнаружение мино р ных компонентов смеси. МЕТОДИКА (общие принципы) Чаще всего для разделения углеводов используют силикагель G , силикагель Н, окись алюминия, кизельгур G и целлюлозу. Слабокислый силикагель обычно применяется при изуч е нии производных сахаров. Если на силикагеле не удается достичь хорошего разрешения основных или нейтральных сахаров и их производных, используют окись алюм и ния — более активный, чем силикагель, сорбент, обладающий основными свойствами. Кизельгур и целлюлозу, я в ляющихся нейтральными носителями, целесообразно применять, для анализа свободных сах а ров. Размер используемых пластинок зависит от цели анализа. Если ТСХ используется для контр о ля за ходом химической реакции, удобны предметные стекла микроскопа. Однако для качес т венного анализа лучше всего пользоваться пластинками размер ром 20X20X0,3 см. Перед н а несением слоя пластинки тщательно моют со стиральным порошком, споласкивают дистилл и рованной водой; и протирают насухо тканью, не оставляющей ворсинок. Если пластинки п о крыты жиром, необходимо предварительно обработать их хромпиком или каким-нибудь гор я чим моющим средством. Известно несколько способов нанесения слоя: намазывание, пол ивка, погружение и опрыск и вание . Н аиболее употребимых метод ы: Опрыскивание. На три подставки (25x30 см) помещают 120 предметных стекол. Суспе н зию 20 г силикагеля G в 50 мл дистиллированной воды тщательно встряхивают в течение 1 мин, выливают в круглодонную колбу емкостью 250 мл и при помощи пульверизатора при ме д ленном токе воздуха наносят слой на пластинки. Пластинки с нанесенным слоем сушат 10 мин на во з духе, затем досушивают и активируют, выдерживая 30 мин при 130 °С. Готовые к употребл е нию пластинки хранят на подставке в эксикаторе. Намазывание. Суспензию 30 г силикагеля Н в 80 мл дистиллированной воды наносят на пять (20x20X0,3 см) чистых стеклянных пластинок слоем толщиной 0,25 мм; если размер пласт и нок меньше, их берут соответственно больше. В некоторых типах аппаратов для нанесения слоя (аппликаторы) пластинки прижимаются к нижней поверхности напра в ляющих рельсов надутой камерой. Поэтому можно пользоваться пластинками из обычного оконного стекла двойной толщины, так как даже на стеклах разной толщины слой будет одинаковым. Пластинки с нанесенным слоем выдерживают при комнатной температуре 2 ч, после чего акт и вируют 2 ч при 130 °С. Активность сорбента определяется температурой и временем актив а ции— при снижении температуры или уменьшении длительности активации активность понижается. Края пластинки выравнивают шпателем. В связи с тем что влажный воздух ко м наты снижает активность сорбента, пластинки либо хранят в эксикаторе, либо перед употреблением прогр е вают 30 мин при 130°С и сразу же охлаждают. Специальные добавки к сорбентам (импрегнирование) улучшают разделение смесей углев о дов. В ряде случаев целесообразно вместо дистиллированной воды применять растворы ацет а та натрия, борной кислоты или двузамещенного фосфата натрия. Для нанесения образца на пластинку, как правило, используют микропипетки, микр о шприцы или капилляры. На пластинки большего размера накладывают шаблон из прозрачной плас т массы с прорезанными отверстиями и 1— 3 пятна 1%-ного раствора наносят с интервалом в 1,5 см на расстоянии 1,5 см от нижнего края и 3,0 см от боковых краев пластинки. Для х о рошего разделения необходимо, чтобы диаметр пятна был как можно меньше (<3 мм), поэтому и с пользуемые растворители должны быть легколетучими. Смеси, состоящие из двух или трех растворителей различной полярности, часто дают лу ч шую картину разделения, чем чистые растворители. Выбор проявителя зависит от полярности и с следуе мых с ахаров. Так, для незамещенных углеводов хорошим проявителем является смесь н -бутанол — уксусная кислота — эфир — вода (9:6:3:1 по объему), а для производных углеводов — смеси петролейного эфира (30— 60 °С) и аце тона (в различных соо т ношениях) . Чтобы воспроизводимость результатов была достаточно хорошей , рекомендуется брать перегнанные растворители и свежеприготовленны е системы проявит е лей. Проявление. В хроматографическую камеру наливают соответствующий проявитель слоем толщиной 0,5— 1,0 см. Через него пропускают полос у фильтровальной бумаги ватман № 1, которую прикрепляют к боковым стенкам камеры. Камеру герметически закрывают кры ш кой с зажимами и оставляют на 30 мин для насыщения. Полное насыщение камер ы парами проявителя необходимо для получения воспроизводимых результатов. Если в системе с о держится легколетучий растворитель, камеру можно поместить в баню со льдом. Когда фронт раствор и теля на пластинке достигнет высоты 10— 15 см, крышку снимают и отмечаю т положение фро н та и лишь после этого вынимают пластинку. В некоторых случаях, чтобы улучшить разделение компонентов, продолжительность проявления увеличивают или пр о водят двукратное или трехкратное проявление с высушиванием пластинки между ними или двукратное проя в ление в перпендикулярных направлениях (двумерная хроматография). Длительность проявл е ния определяется характером растворителя: для проявления пластинки размером 20x20 см н е полярными растворителями достаточно 20— 30 мин, тогда как при проявлении полярными растворителями, содержащими воду, нео б ходимо 1— 2 ч. После высушивания пластинки можно приступать к обнаружению пятен. Методы обнаружения, не вызывающие деструкции анализируемых веществ. Если компоненты- смеси окрашены (что, как правило, нехарактерно для углеводов), их легко обнаружить визуально. Некоторые производные с ахаров обнаруживают по флу о ресценции в ультрафиолетовом свете. Если сами вещества не флуоресцируют, к сорбенту можно доб а вить флуоресцентный индикатор, например смесь силиката и сульфида цинка, или воспол ь зоваться коммерческим сорбентом, уже содержащим индикатор — смесь марганца и актив и рован ного силиката цинка. В этом случае сахара проявляются в УФ-свете в виде темных пятен на свет я щемся фоне. Иод, родамин В, бромтимоловый синий, 2',7'-дихлорфлуоресцеин, вода — ре а генты, позволяющие обнаружить сахара, не разрушая их. Методы обнаружения, вызывающие деструкцию анализируемых веществ. Все реагенты, используемые для обнаружения компонентов сахаров на бумажных хромат о граммах (кроме реагентов, требующих промывки хроматограмм), пригодны и для тонкосло й ной хроматографии. Кроме того, в ТСХ можно использовать и такие реагенты, как концентрированная серная кислота. При прокаливании пластинки, опрысканной кислотой, сахара обугливаются. Как прав и ло, пластинку слабо опрыскивают 5— 50%-ным раствором серной кислоты в воде или спирте и нагревают 10 мин при 130°С. При подобной обработке цвет сорбента не изменяе т ся. Для обнаружения углеводов используются также реагенты, дающие цветные реакции с сах а рами и их производными: 1) анисовый альдегид + серная кислота; 2) нафторезорцин +серная кислота 3) нафторезорцин +фосфорная кислота (кетозы дают красное окрашивание, альдозы - с и нее); 4) азотнокислое серебро + основание; 5) кислый анилинфталат; 6) о-аминодифенил + ортофосфорная кислота; 7) дифениламин + анилин + фосфорная кислота; 8) п-анизидинфталат или хлоргидрат н-анизидина (гексозы дают зеленое окрашивание; пе н тозы — фиолетово-красное; 6-дезоксигексозы — желто-зеленое; уроновые кислоты — кори ч невое); 9) мочевина + фосфорная или соляная кислота; 10) хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий; 11) бихромат калия + серная кислота; 12) азотнокислое железо( III ) +солянокислый гидроксиламин; 13) перманганат калия + едкий натр; 14) карбазол + серная кислота; 1 5) димедон + ортофосфорная кислота (кетозы дают серо-зеленое окрашивание); 1 6) фенол+серная кислота; 1 7) тимол + серная кислота; и многие другие. 3.2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Тонкослойная хроматография находит все большее применение для количественного опред е ления углеводов. Этот метод чрезвычайно полезен при изучении кинетики реакций, исслед о вании их механизма и определении выхода продуктов, однако он применим лишь для ан а лиза смесей, компоненты которых можно полностью разделить. Способы количественного опред е ления делят на две большие группы: а) прямое определение (установление количества вещества непосредственно на пласти н ке); б) косвенное определение (элюирование пятен вещества с последующим анализом элюата ф и зическими методами). Для прямого определения используются денситометрия и радиометрия элюатов. Обе группы методов требуют построения калибровочных кривых, связывающих концентрацию компоне н та с интенсивностью окраски, степенью поглощения или уровнем радиоактивности соедин е ния. Если на каждом этапе анализа соблюдаются все меры предосторожности, точность описанных ниже методов составляет 3— 5%. Измерение интенсивности окраски сахара или продуктов его распада непосредственно на хроматограмме производится методом денситоме т рии. Ввиду того, что сами сахара не окрашены, их обрабатывают реактивом, вызывающим появление о к рашенного пятна на фоне слоя сорбента. Цвет последнего, как правило, не изменяется (белый). Если сорбент все-таки окрашивается, необходимо, чтобы окрашивание было. Пятна должны иметь четко очерченные границы и не должны выцв е тать. Даллас, а также Шеллард и Алам подробно рассмотрели факторы, влияющие на точность и воспроизводимость результатов ан а лиза Чтобы оценить содержание сахаров в образце, можно также сфотографировать хромат о грамму (или сделать фотокопию) и, разрезав поученный снимок на полосы, просканировать их на де н ситометре. Сахара, несущие радиоактивную метку, количественно определяют непосредственно на хроматограмме с помощью счетчика радиоактивности или радиоавтографическим м е тодом путем денситометрического сканирования рентгеновского снимка хроматограммы. После вымывания сахара проводят либо прямую оценку его количества, либо предвар и тельно обрабатывают его подходящим реактивом, а затем измеряют поглощение в УФ- или видимом свете. Трудности возникают в тех случаях, когда с сорбента элюируются посторо н ние вещества, мешающие измерению поглощения. Чтобы исключить возможные ошибки, н е обходимо тем же способом иследовать элюат образца сорбента, взятого на уровне пятна. Сахара, несущие радиоактивную метку, количественно определяют в элюате при пом о щи жидкостного сцинтилляционного счетчика. Высокая точность оценки достигается даже в тех случая, когда сорбент (~0,1 г) попадает в ампулу счетчика (15 мл). МЕТОДИКА ПРЯМОЕ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ (на примере использования кукурузной патоки). Анализ проводится на стеклянных пластинках со слоем с и ликагел я толщиной 0,5 мм. Пластинки используются сразу после получения. Образцы кукурузной патоки с известным содержанием твердого остатка разбавляют водой до конце н трации 1 % (по этому остатку) . С помощью шприца на 25 мкл, снабженного дозатором , полученный ра с твор наносят на пластинку полосами шириной 6 мм, с одержащими от 5 до 90 мкг твердого вещес т ва. Чтобы полосы были узкими, их подсушивают током теплого воздуха. ( е сли образец ра с творяют в каком-либо органическом растворителе, раствор при подсушивании может «пол з ти» по внешней стороне иглы шприца, что приводи т к потере вещества при нанесении) . На каждой пластинке помещается 12 полос: 6 — контрольного сиропа и 6 — анализируем о го. Пластинку проявляют в подходящей системе растворителей при ~25°С; фронт раствор и теля должен подняться на 12 см от стартовой линии. Мальтоолигосахариды вплоть до декасахар и да можно разделить в системе этилацетат— метанол— вода (37:40:23 по объему), однако этот проявитель эффективен лишь для пластинок с силикагелем F -254. Несколько изменив состав проявителя, его можно применять и с другими сорбентами. Пластинку высушивают в токе теплого воздуха, опрыскивают 50%-ной серной кисл о той и прокаливают при 120 °С для обнаружения пятен. Чтобы полученные результаты были воспр о изводимыми, пластинка должна быть равномерно о прыскана мелкими капельками рас пыля е мой жидкости. Количественную оценку состава смеси проводят методом трансмиссионной денситоме т рии на денситометре, снабженном самописцем и интегратором для определения площади ка ж дого пика. Пластинку сканируют в горизонтальном направлении так, что сначала регистрируются все моносахариды, затем дисахариды и т. д. Для определения площадей пиков можно так же использовать планиметр. Коли чество каждого компонента определ яют по отношению к соотве т ствую щему сахару в стандартном образце путем сравнения площадей пиков. В данном случае необходимость в ис пользовании фильтра к лампе ден ситометра отсутств у ет. При использовании в качестве проявителя смеси (3:4:2 по объему) этилацетат — мет а нол — вода, которая позволяет получить четкое разделение высших с ахаров, рассма триваемый м е тод обеспечивает вы сокую точность результатов (табл. 4 ). Таблица 4. Состав кукурузной патоки определенный методом бумажной и тонкослойной хроматографии Сахариды, % моно ди три тетра пента гекса гепта окта нона + высшие Обычная патока (43 экв. глюкозы) БХ 20,5 15,4 11,3 9,8 7,7 6,0 4,7 3,9 21,5 ТСХ 20,1 14,6 11, 8,6 7,2 5,4 4,9 3,4 23,9 Станд. отклонение для ТСХ 0,7 0,51 0,40 0,30 0,37 0,35 0,11 0,20 0,41 Патока с низким содержанием глюкозы и высоким содержанием мальтозы (43 экв. глюкозы) БХ 6,8 34,4 17,2 9,4 2,3 2,6 2,4 4,0 20,0 ТСХ 7,3 35,1 17,5 8,5 2,5 2,4 2,0 2,8 21,6 Станд. отклонение для ТСХ 1,25 4,36 3,10 0,66 0,70 1,10 0,77 0,65 1,33 Патока с высоким содержанием глюкозы и мальтозы (70 экв. глюкозы) БХ 41,1 41,4 3,2 4,8 3,8 1,8 2,4 - 1,6 ТСХ 40,8 42,1 3,5 3,1 2,7 1,5 2,4 - 3,1 Станд. отклонение для ТСХ 1,25 1,62 1,28 0,65 0,26 0,37 0,78 - 0,32 СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ (косвенный метод) Однородную суспе н зию 100 г восстановленной боргидридом микрокристаллической целлюлозы в 430 мл воды н а носят при помощи аппликатора слоем толщиной 0,5 мм на стеклянные пластинки разм е ром 20х20 x 0,4 см. Пластинки сушат при 25 °С примерно 12 ч, после чего на них шприцем наносят по 1,25 мкл растворов с ахаров. Если требуется нанести больший объем, операцию проводят в несколько приемов, подсушивая пластинку в промежутках, до тех пор, пока в пятне не ок а жется от 10 до 150 мкг сахара. После высушивания пластинку проявляют в течение 75 мин смесью этилацетат - пиридин - вода (2:1:2). Проявленную хроматограмму снова высушивают и равномерно опрыскивают раствором кислого ан и линфталата (1,66 г о-фталевой кислоты и 0,91 мл чистого анилина растворяют в смеси 48 мл м-бутанола, 48 мл эфира и 4 мл воды). Пласти н ку выдерживают 5— 7 мин при 105— 110°С. (Внимание! Эфир.) Прямоугольные участки слоя вокруг пятен вырезают острой лопаточкой и сорбент количес т венно переносят с пластинки в пробирку. Размер вырезанных участков должен быть одинаковым для всех пятен одного и т о го же сахара. На уровне пятна сахара с пластинки берут пробу сорбента для холостого опыта. В пробирки добавляют по 0,5 мл раствора кислого анилинфталата и выдерживают 1 ч при 105— 110°С. (Внимание! Эфир.) После охлаждения твердый остаток растирают тонкой сте к лянной палочкой, добавив к нему 4 мл элюирующей смеси (4 мл концентрированной соляной к и слоты в 100 мл ацетона). Пробирки закрывают тефлоновыми пробками и оставляют на 1 ч, периодически встряхивая. Осадок отделяют центрифугированием (3 мин), супернатанты пер е носят шприцем в кварцевые кюветы с l =1 см и на спектрофотометре изм е ряют оптическую плотность растворов относительно раствора х о лостого опыта при 390 нм для гексоз и 360 нм для пентоз. Зависимость оптической плотн о сти от концентрации D -глюкоз ы, D - г алактозы, D -маннозы, 6-дезокси- L -маннозы ( L -рамнозы), D -арабин о зы и D -ксилозы имеет линейный х а рактер. Для D -ксилозы и D -глюкоз ы линейность сохраняется в интервале от 0 до 150 мкг. Количество сахар а в образце определ я ют по калибров очной кривой, построенной для из вестных с ахаров, которые были нанесены на ту же пластинку, что и анал и зируемая смесь. Для смесей, содержащих 20— 100 мкг каждог о сахара, точность о п ределения составляет 3%. 4. ПРЕПАРАТИВНАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Препаративное разделение 0,05— 1 г веществ методом ТСХ становится возможным при пр и менении толстого слоя сорбента (0,5— 5 мм). Этот метод используется для выделения индив и дуальных сахаров в количествах, достаточных для исследования их свойств. По сра в нению с колоночной хроматографией препаративная ТСХ обладает рядом преим у ществ: а) большой скоростью разделения; б) малым количеством проявителя; в) легкостью подбора подходящего проявителя путем пробных делений на маленьких пл а стинках; г) четкостью зон и простотой их обнаружения; д) легкостью элюирования соединений. В препаративной ТСХ применяются те же сорбенты, что и в качественной ТСХ. Для выдел е ния углеводов чаще всего используют силикагель, целлюлозу, кизельгур и окись алюминия. Как правило, оптимальная толщина слоя составляет 1— 2 мм. Было показано, что прибавл е ние к сорбенту различных сложных эфиров целлюлозы низкой степени замещения, а также доба в ление метанола к суспензии сорбента перед нанесением его на пластинку позволяют избежать появления трещин. Однако если сорбент содержит флу о ресцентный индикатор, добавление метанола приводит к неравномерному окрашиванию фона. В тех случаях, когда в сорбенте присутствуют примеси, мешающие вымыванию веществ, перед изготовлением суспензии н е обхо димо промыть сорбент хлороформом . Образец можно нанести на пластинку несколькими способами. Ча ще всего разделяемую смесь наносят в виде концентрированного раствора при помощи микропипеток и капилляров с то н ким концом или шприцев. Количест во смеси зависит от размера пла стинки, толщины слоя, типа сорбента (например, для микрокристаллической целлюлозы 0,05 г/мм ) . Ширина полосы нанесенного образца не должна превышать 0,5 см. Если же она слишком велика, в ряде случ а ев целесообразно сконцентрировать вещество на расстоянии 1 см от линии старта путем кратковременного проявления пластинки в растворителе, в к о тором растворимы все компоненты смеси. С истему растворителей для проявления выбирают на основании предварительных данных по разделению методом качественной ТСХ . Количество повторных проявлений зависит от по д вижности компонентов смеси. Если хроматографирование проводится на силикагеле или ок и си алюминия, обычно достаточно однократного проявления, в то время как в случае микрокристаллической целлюлозы часто требуется многократное проявл е ние. ОБНАРУЖЕНИЕ . Для установления положения зон на хроматограмме предложен ряд мет о дов: а) опрыскивание пластинки реагентами, не разрушающими са харов, например иодом, родам и ном В, бромтимоловым синим, 2/,7/-дихлорфлуоресцеином или водой; б) добавление к сорбенту флуоресцентных индикаторов и обнаружение зон в ультрафиолет о вом свете; в) опрыскивание части слоя, перенесенного с хроматограммы на липкую ленту или пласти н ку, ре агентами, вызывающими деструкцию с ахаров; г) опрыскивание части пластинки деструктивными реагентами, например серной кислотой (предварительно большую часть хроматограммы защищают). Последний метод применяется редко, так как, во-первых, при этом теряется существенное к о личество вещества , а во-вторых, как правило, при ходится прокаливать пластинку. После того как положение зон установлено, их соскабливают с пластинки шпателем или соб и рают «вакуум-очистителем». Можно также элюировать соединение с хроматограммы на фильтровальную бумагу. Далее к сорбенту добавляют растворитель и осадок отделяют филь т рованием или центрифугированием. Для экстракции вещества можно пользоваться а п паратом Сокслета. По возможности следует избегать употребления полярных растворителей, поскольку некоторые сорбенты в них ра с творяются. Разделение сахаров методом препаративной ТСХ рассматривается на примере разделения см е си аномерных метил-2,3,6-три-О-бензил-4-О-этил- , - D -глюкопиранозидов. МЕТОДИКА ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЛАСТИНКИ . Суспензию 25 г силикагеля Н в 66 мл дистиллирова н ной воды пе ремешивают в стакане стеклянной палочкой в течение 5 мин (до получения одноро д ной массы) и выливают на чистую пластинку размером 20х20 см. Держа пластинку в р у ках, наклоняют ее в разные стороны так, чтобы суспензия равномерно распределилась по всей п о верхности. Пластинку сначала помещают на горизонтальную подставку и выдерж и вают 2 ч при 25 °С, а затем переносят на подставку для хранения, где она сушится приме рно 12 ч на воздухе. Пла стинку активируют 2 ч при 130°С и медленно охлаждают до ~25°С. П о сле того как края слоя выровнен ы шпателем, можно наносить обра зец. Толщина слоя со р бента 2 мм. НАНЕСЕНИЕ ОБРАЗЦА . В кончик пипетки помещают тонкий ватный тампон таким обр а зом, чтобы часть его (3— 5 мм) оставалась снаружи. Раствор 0,3— 0,5 г смеси аномерных м е тил-2,3,6-три- O -бензил-4- O -этил- D -глюкопиранозидов в 1— 2 мл хлороформа засасываю т в п и петку и наносят в виде по лосы на пластинку на расстоянии 2 см от ее нижнего края и 3 см от боковых краев. Чтобы полоса получилась узкой (0,5 см), необходимо между нанесениями дать хлороформу испариться. При разделении смесей рассматриваемого типа в центре пластинки, пока она еще не выс о хла, отчетливо видны две полосы, расположенные на расстоянии 1 см. Эти полосы, соответству ю щие - и - D -гликозидам, видны также на сухой пластинке в длинноволновом УФ-свете. Обнаруженные зоны собирают с пластинки, используя «вакуум-очиститель». Последний пре д ставляет собой стеклянную трубку диаметром 25 мм; на одном конце трубки имеется отве р стие диаметром 6 мм, через которое засасывается сорбент. Другой конец трубки присоед и нен к вакуум-насосу. Для улавливания сорбента в трубку помещают кусок стеклянной ваты. К п о павшему в трубку сорбенту добавляют хлороформ (20 мл), осадок отфильтровывают и пром ы вают 20 мл хлороформа. Фильтрат упаривают при пониженном давлении и остаток повто р но растворяют в хлороформе, чтобы удалить все следы сорбента. Из нижней зоны выделяют в виде бесцветного сиропа метил-2,3,6-три-О-бензил-4-О-этил- - D -глюкопиранозид. Из верхней зоны выделяют метил-2,3,6-три- O -бензил-4- O -этил- - D -глюкопиранозид. 5. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ИОНООБМЕННЫХ СМОЛАХ Впервые разделение углеводов методом распределительной хроматографии на ионообме н ных смолах в смесях растворителей различной полярности было описано в 1952 г. В последние г о ды метод был значительно усовершенствован. В качестве элюента при разделении с а харов и их производных наиболее пригоден водный спирт, и далее речь будет идти только об этом элюенте. Одним из основных факторов, обусловливающих сорбцию сахаров точно так же, как и др у гих полярных неэлектролитов в данном виде хроматографии, является неодинаковое распредел е ние компонентов элюирующей смеси между смолой и внешним раствором. В случае вод ного спирта относительное количество воды в неподвижной фазе выше, чем в подви ж ной, и этим объясняется тот факт, что смолой преимущественно удерживаются поля рные вещества. На с о став подвиж ной и неподвижной фаз существенное влияние оказ ы вает также взаимо действие смола - растворитель и смола - растворенное вещество. При смене противоиона порядок элюирования некоторых сахаров может из мениться. Коэффициенты распределения веществ возрастают с увеличением концентрации спирта и уменьшаются с повышением температуры. За редким исключением, коэффициенты распред е ления растут с увеличением числа гидроксильных групп в молекуле. Введение в молекулу н е полярных групп, например мет и льных, приводит к уменьшению коэффици ента распредел е ния. Величина по следнего зависит также от положения заместителей . В табл. 5 при ведены коэффициенты распределения ряда свободных с ахаров. Распределительная хроматография на ионообменных смолах была с успехом применена для разделения моно- и олигосахаридов, альдитов и производных сахаров, не содержащих ион о генных группировок, например гликозидов и частично метилированных сахаров. Этот метод можно использовать как в аналитических, так и в препаративных целях. Таблица 5. Коэффициенты объемного распределения ( Dv ) некоторых моносахаридов и ангидросахаров при различных температурах и концентрациях спирта Сахара Пори с тая смола (SO42-) 75 °С Смола м а лой Емкости (SO42-) 75 °С Дауэкс (SO42-) 90°С Дауэкс ( Li+ ) 75 °С Амберлит IR-120 (Li+) 75 °С 100 °С Концентрация этанола, % 88 86 90 86 92,4 92,4 Эритроза 3,08 1,9 Треоза 3,84 1,4 Рибоза 6,55 4,06 5,80 4,98 4,0 3, 1 Арабиноза 10,1 6,26 9,79 7,56 3,8 3, 0 Ксилоза 12,5 7,38 12,1 9,19 2,7 3,0 2, 4 Фруктоза 13,5 8,04 13,8 10,3 5,6 4, 3 Сорбоза 8,93 15,6 11,0 4,6 3, 7 Манноза 16,4 9,37 16,9 11,8 5,3 4, 4 Галактоза 23,4 13,0 24,4 16,1 5 7 6,8 5, 3 Глюкоза 28,1 14,9 29,5 19,5 4 8 5,4 4, 4 Альтроза 16,6 4 2 Рамноза 4,75 2,80 4,11 3,54 1.4 1 ,2 Фукоза 3,25 4,96 4,19 2,4 1 ,8 На рис .4 приведена принципи альная схема прибора, используе мого для разделения с ах а ров. Элюент (спирт — вода) помещают в колбу Мариотта и обезгаживают кипячением, чтобы пр е дотвратить появле н ие пузырьков воздуха в колонке. За колбой расположена открытая граду и рованная трубка, обычно заполненная элюентом. Скорость движения элюента в системе рег у лируют, перекрывая выходное отверстие колбы. Элюент подается в колонку поршневы м нас о сом из нержавеющей стали который помещают ниже остальных аппаратов системы элюиров а ния.. Рис . 4 Аппаратура для пров е дения хроматографического разделения и ав томатиче ского ан а лиза с ахаров орциновым методом. Давление измеряют манометром Бурдона, снабжённым прерывателем. Последний откл ю чает насос и нагреватель, если давле ние в системе превышает норму (80 атм) и также если оно п а дает из-за утечки жидкости. Анализ можно проводить на колон ках, имеющих п о ристое дно и тефлоновое уплотнение на верхнем конце колонки. Если работа ведется при высоком давл е нии, не рекоменду ется пользоваться колонками со стеклянными фланцами. Вместо них можно использовать стеклянные трубки с приклеенными эпоксидно й смолой муфтами из поливини л хлорида. Чтобы в колонке подде рживалась требуемая температура (70-90 °С), по рубашке колонки циркулирует вода из термостата. Повышение температуры колонки приводит к суж е нию зон вымы ваемых веществ и снижению рабочего давления. Смолы, применяемые в распределительной хроматографии, пред ставляют собой сильн о основные аниониты или сильнокислые катион и ты, основу которых составляет сополимер ст и рола и дивинилбензол. В аналитических колонках, диаметр которы х равен 2— 6 мм, а скорости элюирования высокие (8— 20 мл-см-2мин -1 ), рекомендуется использов ать мелкозернистые см о лы с разме ром частиц 8— 13 или 10— 15 мкм. Для препаративнго разделения сахаров на шир о ких колонках (диаметр 12— 25 мм) и при меньшей скорости элюирования можно применять более грубые смолы. Колонку промывают элюентом до те х пор, пока не образуется однородный слой ионита. После этого растворитель, находящийся над слоем смолы, отсасывают, в колонку п е реносят новую порцию суспензии и операцию повторяют. Перед хроматографическим разделением заполненную колонку приводят в состояни е равновесия с элюентом данного состава, пром ы вая ее элюентом не менее 16 ч. АНАЛИЗИРУЮЩАЯ СИСТЕМА. Определение с ахаров и их различных производных в элюате удобно проводить автоматически орциновым методом. Раствор реагентов х ранят в б у тыли из темного стекла, откуда он и подается в систему п ри помощи поршневого насоса. М е жду насосом и тройником, в котором пр оисходит смешение элюата с раствором красителя, расположено ус тройство для гашения (демпфирования) пульсаций давления ( рис. 4 ). Смесь элюата с раствором красителя пропускают через змеев ик длиной 20 м и диаметром 1,2 мм, п о гру женный в термостатируем ую полигликолевую баню (100°С) . Время нахождения смеси в змеев ике около 10 мин. Интенсивность окраски рас т вора определяется спектрофотометрич е ски при 420 нм проточны х кюветах с l 2— 15 мм. Удобно пользоваться системой из двух п о сле довательно со единенных кювет разной длины: ес ли на более длинной кювете самопи сец «з а шкаливает», измерения проводят на более короткой кювете. На колонке диаметром 4 мм у дается разделить и проанализировать от 2 до 20 мкг веществ. На кол онках меньшего или большего диам етра можно проанализировать соответственно меньшее или большее к оличес т во смеси. Достоинством вышеописанной схе мы анализа является высокая точно сть количественного определения и отсутствие необходимости в час том построении калибровочных крив ых (при постоянстве условий анал иза). Если удается достичь полног о разделения компонентов, откл о н ение от среднего значения в двух аналогичных анализах составляет 1енее 1%. Однако весь элюат расход уется за одно определение, и по тому не удается провести дополнительное иссл е дование фракций. Если проводится препаративное разделение или если проводимые ис следования требуют п о вторного разделения и дополнительных анал изов компонентов смеси, то для разделения пот о ка элюата и введени я растворов реагентов следует использовать перистальтический насос. Т а кая схема анализа (рис. 5 ) отличается большей гибкостью, однако н едостатком ее является б о лее низкая точность количественных определ ений в связи с тем, что соединитель ные трубки насоса быстро изнашиваются и их приходится менять через 14 дней. Рис. 5 . Двухканальный анализатор для одновременного определения восстанавливающих с ах а ров и альдитов. М- сместители; Р1 и Р2 – гасители пульсации; L – флуоресцентная лампа трубки; А – о р ционный канал: 16-ти % водный раствор орциона, 60% серная к и слота; В – периодат-формальгидный канал: 0,015Мметапериодат натрия, содержащий 5 мл конц. соляной кисл о ты на литр На рис.5 приведена схема анализа с применением перистальтического насоса. Элюат д е лится на три потока и одновременно анализируется орциновым (А) и периодат-формальдегидным (В) методами. Третий поток подается на коллектор фракций или отбрас ы вается. В элюате дополнительно определяют содержание восстанавливающих сахаров пери о датным или феррицианидным методом. Выделенные ациклические альдиты анализируются автоматически периодат-формальдегидным методом. В кислой среде они окисляются пери о датом с образованием формальдегида, который определяют до реакции с пентандионом-2,4 в растворе ацетата аммония. Избыток периодата предварительно восстанавливают арсенитом. В условиях анализа при окислении большинства альдитов образуется с высоким выходом формальдегид, в то время как при окислении большей части альдоз формальдегид образуется лишь в незначительных, с трудом детектируемых количествах. Исключение составляет D -фруктоза, ее можно достаточно точно определить этим методом. Периодат-формальдегидегидный метод в совокупности с орциновым используется для анализа сложных смесей сахаров и альдитов. Точность его сравнима с точностью орцинового метода. 6 . ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ В последнее время хроматографию на бумаге все чаще начинают использовать в качестве с а мостоятельного количественного метода. При этом весьма широкое распространение получает количественная хроматография углеводов: моно-, ди- и олигосахаридов, а также продуктов гидролиза крахмала, целлюлозы и других полимеров. Количественное определение индивид у альных веществ, разделяемых на хроматограммах, производится различными способами. С у ществует ряд методов, при помощи которых можно определить концентрацию разделенных веществ непосредственно на бумаге. Это методы: визуальное сравнение (полуколичестве н ный), измерение площади пятен, измерение интенсивности окраски пятен, определение ма к симальной плотности окраски пятен. В случае работы с радиоактивными веществами можно легко установить активность этих соединений при помощи счетчика Гейгера — Мюллера. Однако более широко применяемым и, по-видимому, наиболее точным методом является элюирование отдельных соединений с последующим колориметрированием или определением поглощения в ультрафиолетовой области. При работе с радиоактивными веществами можно производить измерение общей или удельной активности элюируемого вещества. Точность методов количественного хроматографического анализа равна 10%. 7 . ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ТРИМЕТИЛСИЛИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ САХАРОВ Газожидкостная хроматография (ГЖХ) триметилсилиловых эфиров (ТМС) производных у г леводов предст авляет собой хорошо от работанный метод, который в течение ряда лет испол ь зуется для анали за сложных смесей с ахаров, таких, как кукурузная патока или в об щем случае гидролизаты полисахаридов. С совершенствованием методов силилирования со здавалась н о вая хроматографическая аппаратура и изыскивались но вые жидкие фазы. Все это позволило не только улучшить разделение сложных смесей с ахаров, но и расширить область примен е ния ГЖХ вплоть до разделения гептасахаридов. Бробст и Лотт разработали метод, позволя ю щий проводить ана лиз образцов, содержащих неболь шие количества воды, и, используя его, смогли определить олигосаха ридный состав кукурузной патоки вплоть до тетрасахаридов. Позднее в качестве силилирующего агента стал использоваться N -(три метилси лил) имидазол и смесь его с пиридин ом, ставшая коммерческим реакти вом. Показано, что данный реактив обладает хорошими растворяющими свойствами и может использоваться для силилирования влажных образцов с ахаров. Этот м етод не только допускает наличие в образце до 40 мг воды, но и существенно увелич и вает устойчивость триме тилсилиловых эфиров, так как в смеси присутствует большой изб ы ток реагента. Поэтому стандартная кал ибровочная смесь устойчива в те чение нескольких м е сяцев, что весьма важно для хран ения контроль ных образцов редких олигосахаридов. 8 . ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ МЕТИЛИРОВАННЫХ САХАРОВ Газожидкостная хроматография представляет собой надежный и широко распространенный метод качественного и количественного анализа с ахаров. Разделение методом ГЖХ метил о вых эфиров са харов и их производных приобрело особенно большое значение при исследов а нии структуры олиго- и полисахаридов. Восстанавливающие метилированные сахара нельзя изучать методом ГЖХ в первую очередь потому, что они прочно сорбируются на непо дви ж ной фазе или носителе, и их, как правило, переводят в метилгликозиды. Последние либо н е посредственно анализируют на газовом хроматографе, либо, если время удерживания метил г ликозидов слишком велико, предварительно ацетилируют или силилируют. Иногда разрешающая способность колонки недостаточна для раз деления аномеров пирано з ных и фуранозных форм некоторых метили рованных гликозидов или их производных. В т а ком случае метилиро ванные сахара анализируют в виде ацетатов или триметилсилиловых эфиров альдитов. Как было установлено, детекторы дают различный отклик на различные метилированные с а хара, содержащиеся в одинаковых концентрациях. Однако пока не известно, является ли это следствием особенностей, присущ их де текторам, или следствием потерь некоторых комп о нентов при подготов ке образца к анализу и преимущественной сорбции их на колонке. Тве р дые правила выбора колон ки еще не выработаны. Тем не ме нее изучение литературных да н ных показывает, что большинс тво ис следователей предпочитают полярные фазы, которые, по-видимому, да ют лучшее разрешение всех типов производных метилированных са харов. Обычно время удерживания соединения выражают по отношению ко времени удерживания стандарта. Это позволяет избе жать расхож дений, наблюдаемых для абсолютных значений времени удерживания и обусловленных нестандартностью условий анализа. Результаты о п ределения относительного времени у держивания на одной и той же ко лонке воспроизводятся с точностью до ±2%, а на разных колонках с одинаковыми неподвижными фазами - с точн о стью до ±5% . Время удерживания многих прои зводных углеводов достаточно ве лико, что приводит к пл о хому разделению смесей, обусловливает низк ую концентрацию элюируемых компонентов в газе-носителе, и в итоге приводит к увеличению ошибки при определении содержания ко м понен тов в смесях. Поэтому при проведении разделения метилированных са харов желательно подбирать такие п роизводные и такие условия рабо ты, при которых все компоненты смеси элюировались бы с колонки в течение 70— 90 мин с момента их введения. Если детектиров а ние не сопровождается разрушением с ахаров, их можно собирать на выходе с хроматографа. Заключение Хроматографические методы при разделении и очистке полисахаридов, так же как и в др у гих областях химии природных соединений, играют исключительно важную роль. Однако всле д ствие своеобразия полисахаридов далеко не все разновидности хроматографии испол ь зуются в равной мере. Наличие даже в очищенных полисахаридах набора полимерогомол о гов с близкой хроматографической подвижностью и близкими сорбционными свойствами, и х коллоидный характер, а также склонности к ассоциациям – все это об у словливает малую эффективность таких видов хроматографии, как бумажная, распределительная и адсорбционная хроматогр а фия. Вместе с тем ионообменная хроматография имеет исключительно важное значение при разд е лении и очистке полисахаридов. Широко применяемые ДЭАЭ-целлюлоза и эктеолацеллюлоза позволяют легко отделить не й тральные и кислые полисахариды: нейтральные обычно не задерживаются или мало задерж и ваются на названных анионитах, кислые, в зависимости от своей природы, более или м е нее прочно удерживаются и элюируются растворами солей, буферными растворами или щелоч а ми. На анионитах разделяются различные кислые полисахариды в зависимости от ст е пени их кислотности. Применение ДЭАЭ-целлюлозы в боратной форме позволяет разделять и не й тральные полисахариды. Недавно были разделены нейтральные полисахариды (глик о ген) при помощи ДЭАЭ-целлюлозы на фракции, отличающиеся величиной частиц./3/ Для разделения сахаров применяются следующие методы: 1. Хроматография на колонках с углем применяется для разделения углеводов на классы в зависимости от степени их полимеризации ( моносахариды, дисахариды, трисахар и ды т. д. ). 2. Хроматография на колонке с целлюлозой имеет широкую область применения, что нет необходимости рассматривать ч а стные примеры его использования. 3. К ачественная тонкослойная хроматография применяется для разделения углеводов, в том числе незамещенных моно- и олигосахаридов и различных производных сахаров и сложных эфиров, цикл и ческих ацеталей и др. 4. К оличественная тонкослойная хроматография сахаров может применяться в случае смесей, компоненты которых можно полностью ра з делить 5. Препаративная тонкослойная хроматография сахаров используется для р азделени я смеси аномерных с а харов( метил-2,3,6-три-О-бензил-4-О-этил- , - D -глюкопиранозидов ) . 6. Газожидкостная хроматография используется для разделения триметилсилильных производных сахаров , м е тилированных сахаров. Из своей теоретической работы я могу сделать следующие выводы: - для идентификации олигосахаридов наилучшим методом считается бумажная хромат о графия - для разделения сахаров наилучшим методом считается то н кослойная хроматография. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: 1. Чмутов К.В. Хроматография, ее теория и применение . - М.: Издательство Ака демии наук СССР – 1960г. 2. Хомченко Г.П. Химия для поступающих в вузы: Учеб . пособие. 2-е изд., -М.: В. ш., 1995г. 3. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды): Учеб. пособие для вузов. – М.: Высш. шк о ла, 1978г. 4. Жуховицкий А.А. Руководство по газовой хроматографии . – М .: Мир , 1969г. 5. Кочетков Н.К. Методы химии углеводов . - М.: Мир , 1967 г . 6. Хорлин А.Я. Методы исследования углеводов .- М .: Мир , 1975г
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Когда она пьяна её трудно найти, легко потерять и невозможно запихнуть в такси.
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, курсовая по химии "Хроматографическое разделение углеводов", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru