Курсовая: Оптимизация условия очистки вакцины против вируса клещевого энфевалита - текст курсовой. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Курсовая

Оптимизация условия очистки вакцины против вируса клещевого энфевалита

Банк рефератов / Медицина и здоровье

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Курсовая работа
Язык курсовой: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Microsoft Word, 1660 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникальной курсовой работы

Узнайте стоимость написания уникальной работы

10 СОДЕРЖ АНИЕ : стр. Введение……………………………………………………………………..…… ..2 Основные виды хроматографии…………………………………………...…… 3 Теоретические основы и термины хроматографии…………………….…… .5 Сорбенты хроматографического анализа………………………………….… .7 Сорбенты гель-фильтрации………………………………………… …….…… 8 Растворители…………………………………………………………………… ...9 Препаративная жидкостная хроматография……………………………...… 11 Изменение формы пика с увеличением нагрузки………………………… ...13 Масштабирование разделения……………………………………………… ....14 Препаративная гель-фильтрация…………………………… ……………… ..15 Оптимизация препаративной гель-фильтрации………………………… .....16 Клещевой энцефалит…………………………………………………………… .17 Практическая часть…………………………………………………………… ..19 ВВЕДЕНИЕ. Метод хроматографическо го разделения возник в начале прошлого века , после опубликования работ русского учёного Цвета , который обнаружил разную сорбируемость пигментов хлорофилла на оксиде алюминия , и как следствие разную скорость продвижения по колонке , заполненной им . Изначаль н о метод позволял анализировать только окрашенные вещества , что и дало название методу. В настоящее время этот метод используют не только для анализа веществ , имеющих окраску . Благодаря оснащению колонок специальными регистрирующими устройствами можно подве ргать анализу и разделению самые разные вещества и классы соединений . Кроме того возможность разделять вещества очень близкого строения , природные соединения , белки , нуклеиновые кислоты , и даже некоторые биологические объекты -,делают этот метод очень при м енимым и зачастую единственным в настоящее время . Особенно это касается белков и нуклеиновых кислот – их разделение хроматографическим методом очень точно позволяет выделять и анализировать белки очень сложного строения . Выше перечисленные факты делают хр о матографию очень популярной в научно— исследовательских биологических лабораториях , при получении и выделении новых белковых препаратов :- сывороток и вакцин . Современная модификация метода— высокоэффективная жидкостная хроматография , позволяет провести ана л из , идентификацию и разделение очень малых количеств веществ ( ~0.000001 г .) за очень короткое время – 15 — 20 минут. Следует также сказать ,что современные хроматографы оснащены компьютерами , что позволяет ускорить анализ веществ (за счет создания библиотек и веществ в памяти ),сделать анализ более достоверным и точным , а также простым в выполнении Перечисленные факты делают метод хроматографического анализа одним из самых применимых в современных экспертных лабораториях , так как метод позволяет быстро и кач е ственно разделить и проанализировать смеси близких по свойствам веществ , в частности лекарственных препаратов , веществ природного происхождения . Наша работа посвящена препаративному хроматографическому разделению веществ , но чтобы разработать наиболее выг о дные условия для хроматографического разделения веществ нужно сперва подобрать оптимальные условия для мелкомасштабных , аналитических разделений , затем провести масштабирование и перейти к препаративному разделению . Вообще , препаративная хроматография во з никла сравнительно недавно (1940-годы ), появление её было обусловлено необходимость разделения веществ , которые нельзя было разделить обычными способами , так чтобы они сохранили свои первоначальные свойства ( выделение белков , нуклеиновых кислот , различных лекарственных веществ природного происхождения ). Также нужно добавить , что наряду с эффективностью и практически универсальностью разделения у препаративной хроматографии есть ещё и ряд недостатков :- прежде всего это сравнительно высокая стоимость раздел е ния , а также ещё и то что трудно предсказать возможность разделения веществ на данной хроматографической колонке в данных условиях , то есть необходимо проводить ряд опытов в более мелких масштабах для установления условий разделения , это и есть оптимиз а ция. ВИДЫ ХРОМАТОГОРАФИИ . Целью нашей работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита .Рассмотрим основные виды хроматографии , которые могут применяться для этих ц елей Важнейшим вариантом жидкостной хроматографии является ионнообменная хроматография Этот метод позволяет проводить разделение не только в аналитических целях , но и разделять вещества в более крупных масштабах , например при промышленном разделении вещест в . Особенностью метода является то , что сорбент (ионнообменник ) способен ионизироваться , отдавая подвижные ионы (H, Na) в подвижную фазу,при этом сам ионнообменник приобретает заряд. В случае отрицательного заряда матрицы говорят об катионо-обменнике , в слу чае положительного об анионообменнике . Катионо - и анионо-обменники бывают сильными и слабыми . Сильные ионизированы во всем интервале pH , а слабые лишь в определенном интервале , зависящим от свойств конкретного ионобменника,точнее от природы ионогенных гр у пп ионнообенника . Ионизацией слабых ионообменников можно управлять , меняя pH среды , что имеет большое значение в процессе разделения . Ионообменники представляют собой полимеры , модифицированные введением ионогенных групп . В случае катионообменников это – S O 3 - ,-COO -- ,-CH 2 -SO 3 -- ,с соответствующими противоинами . К анионообмееным группам относят тетраалкиламмониевые группы с положительным зарядом . Особенностью ионообменной хроматографии является то ,что она позволяет отделять и разделять заряженные частицы . Раз деление основано на электростатическом взаимодействии ионов подвижной фазы с неподвижными ионогенными группами ионообменника.К органическим веществам , способных образовывать ионы в растворе относят соединения четырех валентного азота , трех валентного кисл о рода , аминокислоты , белки , карбоновые кислоты . Из обилия перечисленных веществ видно как важен метод . Как уже было отмечено в основе разделения веществ лежит электростатическое взаимодействие ионов подвижной фазы и ионов матрицы . Однако это взаимодейств и е обратимо , на самом деле устанавливается равновесие между ионогенной группой , соединенной с органическим ионом и ионогенной группой , соединенной с неорганическим противоионом (H + ,Cl - , OH - , Na + ).Очевидно ,что чем больше неорганических ионов ,тем слабее бу дут связаны разделяемые вещества . Поэтому растворы неорганических солей можно использовать в качестве элюентов . Важной характеристикой ионнообменника явяется его кривая титрования , она позволяет сделать вывод о силе ионообменника . Для разеления ,например аминокислот также необходимо знать их кривые титрования , т.е . в какой области pH аминокислота находиться в форме аниона , а в какой в форме аниона . Сопоставляя кривые титрования аминокислот и ионообменника можно сделать вывод о возможности разделения данных аминокислот на данном ионообменнике при определенном значении pH. Однако не только электростатическое взаимодействие влияет на разделение веществ , немаловажны и стерические факторы--такие как величина пор ионообменника , расстояние между соседними ионогенн ыми группами . Особое значение это имеет при разделенни макромолекул , например белков , в данном случае электростатическое взаимодействие может лимитироваться стерическими факторами и диффузией макромолекул к ионогенным группам . Немаловажно в связи с этим о т метить влияние структуры белка (первичная вторичная и т.д .) очевидно , что скорость диффузии будет для них неодинакова , -молекула в виде глобулы будет легче передвигаться , чем разветвленная молекула . Особенностью макромолекул является и то , что они могут н ести несколько одноименных зарядов , в этом случае возможно взаимодействие одной молекудлы с несколькими ионогенными группами (как правило двумя ),интересно отметить , что прочность связи при этом увеличивается более , чем вдвое . Это объясняется тем , что одна с вязь как бы страхует другую . -при разрыве одной связи молекула колеблется около положения равновесия , ясно , что в этом случае ей легче возобновить вторую связь . Однако возможность такой двое связанности скорее негативно влияет на процесс разделения , так к ак крепко закрепившиеся молекулы очень трудно отделить от ионообменника приходиться применять концентрированные растворы солей , что может нарушить структуру белка , что ведет к его денатурации , также резко снижается разделительная способность колонки . Такж е следует отметить , что при подобной сорбции белковая молекула может деформироваться под структуру матрицы , что также может вести к денатурации . Таким образом применительно к очистке белковых веществ можно сказать , что метод позволит отделить некоторые н езаряженные молекулы от белковых молекул , которые как правило заряжены , а также можно провести разделение и от посторонних белков , только нужно знать кривые титрования белков и кривую титрования ионообменника. Важным видом хроматографии является гель-фильт рация . Она позволяет разделять молекулы в зависимости от их молекулярных масс . Разделение в этом методе основано на различной скорости диффузии молекул с разной молекулярной массой (различными размерами ). Сорбентом в данном методе служит гель , точнее ме л кие частицы , внутри пронизанные нитями (фибриллами ).Диффузия внутрь этих частиц лимитируется размерами ,а точнее подвижностью молекул которая зависит от их молекулярной массы . Чем меньше молекулы , тем легче они способны проникать вовнутрь гранул геля , соо т ветственно более тяжелые частицы практически не проникают в гранулы , так как менее подвижны . Частицы попавшие внутрь гранул под действием диффузии движутся внутри и с равной вероятностью могут выйти наружу , но пространство внутри гранул геля пронизано нит я ми и молекулы претерпевают многочисленные столкновения с сетью фибрилл и способны надолго задерживаться внутри гранул . Таким образом мы видим ,что более легкие молекулы способны надолго задерживаться внутри гранул , и их скорость продвижения будет меньше с к орости движения более тяжелых молекул. Описанный метод очень эффективен для разделения белков и других высоко-молекулярных соединений . Варьируя характеристики частиц геля ,- такие как размер пор на поверхности гранул , характеристики внутреннего строения гр анул ,- можно добиться разделения определенных веществ , т.е . того , что вещества с определенной молекулярной массой будут проходить ,остальные продвигаться с меньшей скоростью , особенно это важно при разделении белков на фракции по их молекулярным массам , а также при фракционировании полимеров по их молекулярным массам , для анализа качества образца , нахождения его молекулярно-массового распределения . Применительно к нашей теме следует сказать , что гель-фильтрация как нельзя лучше подходит для отделения бел к овой части вакцины от низкомолекулярных веществ , обессаливания препарата , и в некоторых случаев к концентрированию. Одним из интереснейших методов жидкостной хроматографии является аффинная хроматография . Она позволяет разделять отдельные ферменты ,белки и даже вирусы и простейшие биологические объекты .Особенностью данного вида хроматографии является то , что разделение основано на разного вида специфических взаимодействиях частиц подвижной фазы с сорбентом . Сорбентом в данном виде хроматографии служит г е ль типа агарозы к которому ковалентно привязаны подходящие лиганды ,им может быть субстрат какого-либо фермента ,Когда через такой сорбент пропускают подвижную фазу , то из нее будет сорбироваться только соответствующий фермент , он будет прочно связан с с о рбентом , но его оттуда можно смыть избытком растворителя , или можно использовать закрепленный фермент , для непрерывного превращения молекул субстрата из подвижной фазы При модификации сорбента соответствующими антителами можно удерживать заданные вирусы , п ри модификации антигеном удерживать ген . Очевидно , что метод аффинной хроматографии очень высокоэффективен из-за селективности специфических взаимодействий и очень перспективен ,так как позволяет концентрировать биологические объекты , которые важны при п роизводстве вакцин и сывороток. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ ХРОМАТОГРАФИИ. Основная кинетическая характеристика процесса – высота , экви валентная теоретической тарелке (В.Э.Т.Т )- H .Она соответствует слою сорбента (высоте слоя ) при прохождении через который акт сорбции-десорбции успевает совершиться в среднем один раз . H отражает качество сорбента , качество заполнения колонки и правильность выбора режима хроматографирования. Зачастую удобнее использовать не Н ,а число теоретических тарелок в колонке – N = L / H , где L -длина колонки. N служит мерой эффективности колонки ,ее рассчитывают как функцию времени удерживания и ширины пика на хромотограмме : N = 5.54*(t R /W 0.5 ) 2 = 16*(t R /W S ) 2 = 4*(t R /W 2S ) 2 , где W S -- ширина пика у основания. W 0.5 – ширина пика на половине его высоты W 2 S – ширина пика на 0.607 его высоты. До сих пор мы лишь обсуждали методы хроматографии , обратимся теперь к некоторым т еоретическим основам метода . Прежде всего нужно сказать ,что аналитическим сигналом в хроматографическом анализе хроматограмма . Она представляет собой кривую зависимости концентрации , выходящих с потоком подвижной фазы из колонки ,от времени с начала разде ления . Однако ,следует заметить , что в детекторах , используемых в хроматографии редко измеряется непосредственно концентрация ,а часто это пропорциональная ей величина (коэффициент преломления , поглощения , и т.п .) .Хроматограмма состоит из базовой линии и пиков . Базовая линия соответствует тем моментам времени , когда из колонки вытекает чистый растворитель ; пик соответствует появлению одного из разделяемых веществ в вытекающем растворителе . В идеале форма пика стремится к кривой Гауссовского распределения. Время появления максимума пика называется временем удерживания – t R .. При постоянных условиях работы и составе фаз t R является индивидуальным для каждого вещества . Иногда в начальной части хроматограммы появляется маленький пик ,он соответствует времени уд ерживания несорбированного вещества t 0 и свободный объем системы . Своим появлением этот пик обязан кратковременному нарушению равновесия в колонке при вводе пробы . Свободный объем системы ( V 0 C ) – объем подвижной фазы от устройства для ввода до детекто ра . Часть его находится внутри колонки ( V m )-свободный объем колонки . В идеале свободный объем системы не должен превышать свободный объем ,в этом случае t 0 в первом приближении соответствует свободному объему колонки . Также важен объем объём неподвижной фа зы – V S .Отношение V S к V m – фазовое отношение колонки . Фазовое отношение позволяет связать хроматографический процесс с термодинамическими характеристиками системы . Если F - скорость подачи подвижной фазы в колонку (в первом приближении не влияет на распре деление ) ;удерживаемый объем выражают как : V R = t R * F . V R - постоянная величина для данного вещества на колонке данных размеров ,но на колонке с другими геометрическими характеристиками V R будет другим , однако пропорционально ему меняется и t 0 ,и чтобы изба виться от зависимости от параметров системы вводят величину k ` - коэффициент емкости k `=( t R - t 0 )/ t 0 . k ` является величиной связанной с термодинамическими характеристиками сорбции -- G сорбции . Так как в выражение для к ` входи т фазовое отношение , которое в свою очередь зависит от объема сорбента , а следовательно и от плотности упаковки , то была предпринята попытка заменить к ` на индекс удерживания , однако в В.Э.Ж.Х индексы удерживания широкого применения не нашли . Однако в р еальных случаях разделения приходиться иметь дело с несколькими разделяемыми компонентами , поэтому вводят такую величину как селективность -- ij =( t Ri - t 0 )/( t Rj - t 0 ). Селективность является сравнительной термодинамической характер истикой двух разделяемых соединений. Все рассмотренные величины характеризуют термодинамические процессы в системе , однако процессы в хроматографической колонке определяются еще и кинетическими факторами , как и любой другой химический процесс .Так если ij =1, (термодинамическая характеристика ),то вещества не разделить при любом устройстве колонки . Однако неравенство селективности единицы не гарантирует разделения веществ . Для хорошего разделения колонка должна обладать еще и до статочно высокими характеристиками кинетического характера , а именно акты сорбции-десорбции должны совершаться с большой скоростью , чтобы реализовать термодинамическую возможность разделения. Для оценки разделения веществ всегда нужно учитывать 2 фактора – термодинамический и кинетический . В качестве численной меры , учитывающей кинетику и термодинамику используют критерий разделения : R S =2*(t Ri – t Rj )/(W Si --W Sj ) . R S связан с основными характеристиками системы следующим образом : R S =0.25*(( -1)/ )*((k`/(1+k`))*N 1/2 , k ` -- здесь средний коэффициент удерживания . Как уже отмечалось выше для хроматографического анализа и особенно разделения важна форма зон (пиков ) на хроматограмме в идеале требуется , чтобы они были как можно более узкими и высокими и более удалены друг от друга , в этом случае легче будет провести анализ и он будет более точным . Ширина пиков (их форма ) зависит от высоты теоретической тарелке , чем выше Н , тем хуже это отражается на в и де хроматограммы . Н ,в частности , зависит от разного рода диффузионных процессов ,протекающих внутри колонки. Эти процессы , обусловлены : n вихревой диффузией , которая возникает из-за неоднородности твердой фазы - она пропорциональна размеру частиц сорбент а ; n продольной молекулярной диффузии в подвижной фазе появление этой диффузии связано с затрудненностью перемещения между гранулами сорбента , эта диффузия обратно пропорциональна скорости подвижной фазы ; n продольной диффузии в неподвижной фазе – также обратно пропорциональна скорости потока , обычно вклад этого вида диффузии равен вкладу продольной диффузии в подвижной фазе ; n вклад в диффузию кинетики массопередачи в подвижной фазе , пропорционален скорости потока ; n вклад неравновестности процесса вн утри застойных зон в частицах насадки ,также линейно зависит от скорости потока ; n вклад кинетики массопередачи в неподвижной фазе. Как мы можем видеть многие составляющие диффузии (увеличивающие значение Н ) линейно зависят от скорости потока , некоторые обратно пропорционально и в общем случае зависимость Н от скорости представляет собой гиперболу с некоторым минимальным значением Н и соответсвующему ему значению скорости U опт . -- Оптимальная скорость потока . При более детальном анализе каждой составляющ ей диффузии можно видеть , что чем меньше частицы сорбента , тем меньше диффузия . Но уменьшение размеров частиц сорбента встречает ряд трудностей , и одна из них - необходимость создание высокого давления в системе , так как при уменьшении частиц сорбента с ильно возрастает сопротивление потоку , и для сохранения прежней скорости потока необходимо повышать давление : P =( r * u )/( d 2 * L ); d -диаметр зерен ; видно ,что при уменьшении диаметра зерен в 2 раза ,нужно повысить давление в 4 раза для сохранения скорости разделения постоянной. На практике для увеличения скорости разделения часто используют скорости потока , превышающие U опт ., при такой ситуации положительное влияние оказывает увеличение диффузии в подвижной фазе , и исходя из этого предпочитают брать подви жные фазы с возможно малым коэффициентом вязкости. СОРБЕНТЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА. Сорбент является важнейшей частью хроматографической системы , именно от его характеристик и типа зависит возможность раз деления веществ . Большое значение для кинетических характеристик имеют размеры частиц . В классической колоночной хроматографии используются сорбенты с размерами частиц 30-200 мкм ,при высоте колонке 1 м . Однако главный недостаток крупно зернистых сорбенто в – большая длина диффузии внутри зерен , в этом случае приходится применять небольшие скорости движения потока . Основной путь улучшения кинетических характеристик сорбента – уменьшение толщины активного слоя .Достичь этого можно двумя путями .Первый из н и х заключается в том ,что на неактивное ядро (стеклянный шарик ) диаметром порядка 30 мкм наносят тонкий слой сорбента 1-2 мкм – такие сорбенты получили название поверхностно-пористых сорбентов . Колонки ,заполненные такими сорбентами не оказывали большого с о противления потоку , но однако обладали и таким недостатком как малая сорбционная емкость , так как в значительной степени состояли из неактивного материала. Второй путь улучшения качества сорбента – уменьшение диаметра частиц вплоть до 3 — 10 мкм . такие сорбен ты называют объемно-пористыми . Такие материалы уже создают значительное сопротивление , что приводит к необходимости применять давления порядка 400 атм . Однако при увеличении однородности частиц удается снизить рабочее давление до 50 — 150 атм . Несомненным д остоинством объемно-пористых сорбентов является их большая емкость , что позволяет их использовать не только в аналитических целях , но и для препаративного разделения веществ. В качестве материалов сорбентов используют самые разные вещества природного про исхождения и синтетические – органические и неорганические полимеры . Прежде всего это сорбенты на основе целлюлозы , агарозы , окиси алюминия , силикагели . При химической модификации сорбента ,введением каких— либо функциональных групп можно получить сорбент с требуемыми свойствами , сродством к определенным классам соединений . В частности так получают ионообменники , если функциональная группа ионогенна . К важнейшим характеристикам сорбента также можно отнести развитость поверхности , размер пор на его поверхно с ти . Одним из самых распространенных сорбентов является силикагель , или его многочисленные модификации . Это определяется тем ,что силикагель можно легко модифицировать , можно легко получать частицы с заданным размером частиц , размером пор , разной удельной п оверхностью и т.д ., к тому же сорбенты на основе силикагеля механически прочны и химически стойки . Силикагель чаще других сорбентов используют в нормально— фазовой хроматографии , благодаря взаимодействию сорбатов с полярными силанольными Si — OH и силоксановы ми группами Si — O — Si .Модифицируют силикагели с помощью органилгалогенсиланов – R 3 — Si — Cl , R 2 — SiCl 2 , R — SiCl 3 . Модификация происходит за счет взаимодействия ОН— групп силикагеля с галогенсиланом , в результанте чего к силикагелю присоединяется остаток силана с органическими радикалами , который и придает сорбенту необходимые специфические свойства , например анионообменник SAX : R =( CH 2 ) 3 — NR 3 .- сильный анионообменник , используемый для разделения кислот . В настоящее время существует широкий спектр сорбентов с самым и разными модификациями , как правило выбор модифицирующего лиганда зависит от свойств и строения разделяемых веществ . Так если R обладает хиральностью , то на сорбенте возможно будет разделять оптические изомеры . Однако следует иметь в виду , что сорбционны е свойства материала могут меняться в зависимости от подвижной фазы (растворителя ). Сорбенты гель-фильтрации. Поскольку практическая часть нашей работы связана с гель-фильтрацией , остановимся к ратко на материалах , с помощью которых происходит процесс разделения. В гель-фильтрации используются в качестве сорбентов как материалы природного происхождения , модифицированные и обработанные соответствующим образом (основа как правило целлюлоза или агар оза ), так и разнообразные синтетические материалы (гели на основе поливинилацетата , полиакриламида ). Также используют вещества неорганического происхождения - пористые стёкла и пористый силикагель . По отношению к растворителю гели разделяют на гидрофильные и гидрофобные . Гидрофильные гели активно взаимодействуют с водой , впитывая её , при этом они набухают . Гидрофильность им придают гидрофильные группы , находящиеся на поверхности гранул геля (например – OH ,- NH 2 и некоторые другие ). Гидрофобные гели не взаи модействуют с водой (не набухают ) , зато могут хорошо набухать в органических растворителях . Гидрофильные гели могут быть превращены в гидрофобные , для этого их нужно обработать реагентом , который реагирует с поверхностными группами , меняя их природу . Так ж е ещё гели делят на универсальные и специального назначения . Универсальные гели отличаются широким распределением пор по размеру , разделение на них может дать первичную , но очень ценную информацию . Также гели подразделяют на мягкие , полужёсткие и жёстки е ( все либо гидрофильные либо нет ). Мягкие гели как правило органические вещества ,характеризуются высокой эффективностью , их фактор ёмкости ( V вн / V сп ) равен 3. Полужёсткие гели получают полимеризацией , они обладают высокой проницаемостью , средней ёмкост ью , мало увеличивают свой объём при набухании . Жёсткие - это как правило неорганические вещества , не способные набухать их фактор ёмкости в среднем 0.8-0.9. Теперь кратко рассмотрим наиболее распространённые гели. Полидекстрановые гели. Полидекстрановые гел и типа сефадекс . Представляют собой довольно крупные молекулы пространственно разветвлённого декстрана . Хранится и перевозится в сухом виде . Окисление кислородом приводит к появлению новых карбоксильных групп , что в свою очередь становится причиной сорбции молекул вещества в неподвижной фазе . По ионообменному механизму ,это недопустимо при гель – фильтрации , поэтому водные элюенты следует деаэрировать . Сильные окислители разрушают необратимо сефадексы . Данный сорбент не растворяется в органических раств о рителях . Остатки борной кислоты могут образовывать комплексы с декстраном , что предполагает не использовать борную кислоту и её соли при хроматографическом процессе . Во влажном состоянии при нейтральном pH сефадексы можно стерилизовать при Т = 110 0 С . В сухом виде выдерживает Т = 120 0 С. Сефадексы фирмы “ Pharmacia ” имеют маркировку G , номер означает пористость матрицы , то есть номер по сути своей описывает количество воды в мл . , которое связывает 10 грамм сухого геля, По размерам сферических гранул р азличают следующие категории : · “ Coarse” (100 – 300 mkm ); · “ Medium” (50 – 150 mkm ); · “ Fine” (20 – 80 mkm ); · “ Super fine” (10 – 40 mkm ). В аналитическом варианте колоночной хроматографии использзуют – “ Fine ” и “ Super fine ” ; “ Medium ” – для препар ативных опытов ; “ Coarse ” – для фракционирования свободным объемом . Аналогичные матрицы из сефадексы выпускает фирма “ Reanal ” (Г– 10 - Г -200) и др . фирмы. Сефакрилы представляют собой декстран , сшитый N , N – метиленбисакриламидом . Они поставляются уже наб ухшими , в виде густой водной суспензии . Главным её достоинством по сравнению с сефадексой – это более высокая жесткость частиц , что позволяет вести хроматографический процесс при более больших скоростях . Сефакрилы более химически стойки по сравнению с сеф а дексами . что даёт вести регенерацию колонок с этим сорбентом путём длительной промывки 0.2 Н NaOH . В других свойствах данный сорбент похож на сефадексу. Основным производителем сефакрила является фирма “ Pharmacia ” . Выпускают 5 её типов с маркой S ( от S -20 0 до S -1000 ) все категории “ Super fine ”. Гели агарозы Сефароза представляет собой гель агарозы . Поставляется в виде суспензии , которую нельзя подсушивать . Гели её довольно жесткие , но менее чем у сефакрил . Гранулы сефарозы очень хрупкие и её нельзя использовать при Т выше 40 0 С . Рабочий диапазон pH = 4 – 9. Её разрушают детергенты и 6М раствор гуанидинхлорида . Стерилизацию колонок с сефарозой ведут диэтилпирокарбонатом . В присутствии солей даже умеренное подкисление приводит к сужению пор и увеличен ию поверхности сорбции. Сефакрилы фирмы “ Pharmasia ” имеют тип В с номером , показывающим процентное содержание агарозы , Гель агарозы,сшитый дибромпропанолом , имеет тип GL , Аналогичные матрицы из сефарозы выпускает фирма “ Bio - Rad Labs ” ( биогели серии А ), ф ирма “ LKB ” ( ультрогели серии А ) и др . . Полиакриловые гели : Представляют собой акриламид , прошитый N , N – метиленбисакриламидом . Хранится и перевозится в сухом виде . Пористость геля определяется концентрацией полиакриламида . Рабочий диапазон p Н = 3 – 8. Это нейтральный , гидрофильный гель для работы с водными растворителями . При кипячении в водных растворах буферов при рН около 7 уже происходит гидролиз амидов . Химически менее стоек , чем сефадекс . Колонки на его основе “медленнее” , чем соответственные из сефадексы . Выдерживает меньшее давление , чем сефадекс. Основной производитель – фирма “ Bio - Rad Labs ” (биогели серии Р и категории “ Fine ” ). Аналогичные сорбенты выпускают фирмы “ LKB ” (ультрогели серии АсА ) и др . фирмы. РАСТВОРИТЕЛИ . Как уже было сказано подвижная фаза имеет большое значение в хроматографическом процессе . Она влияет как на кинетику процесса (В.Э.Т.Т .), так и на термодинамику процесса , например , изменяя состав подвижной фазы мож но менять коэффициент удерживания в 1000-10000 раз . Однако на практике используют значения к ` от 1 до 20. Влияние на кинетику и термодинамику связано с тем , что подвижная фаза играет двоякую функцию . С одной стороны подвижная фаза выполняет транспортную функцию , и здесь ее химические свойства роли не играют , имеют значения лишь физические (вязкость , летучесть и д.р .) — в этом плане растворитель влияет главным образом на кинетические характеристики разделения . С другой стороны молекулы растворителя участву ю т в системе термодинамических равновесий – установлении сорбционного равновесия , они взаимодействуют с сорбатами , сорбентами , и здесь уже имеют значение химические свойства растворителя ( кислотность ,основность ), а также его физико-химические характерист и ки (дип . момент ) . Получается так , что взаимодействие сорбатов с растворителем не менее важно , чем взаимодействие с сорбентом . Таким образом природа растворителя может влиять на термодинамику процесса .(к `). Необходимо помнить о том , что в ряде случаев мо лекулы растворителя способны к прочной сорбции , что коренным образом отражается на свойствах сорбента . Также необходимо помнить о том ,что растворитель не должен содержать взвешенных примесей , оседая в колонке они могут резко нарушить пропускную способно с ть колонки , создавая дополнительное сопротивление потоку , меняя свойства колонки , что ведёт к невоспроизводимым результатам , поэтому необходимо фильтровать растворители через фильтры с размером пор около 0.5 мкм . Также особо важно для метода В.Э.Ж.Х ., что б ы растворитель был тщательно дегазирован , особенно это касается легко летучих растворителей , так как при перепадах давления могут возникнуть пузыри пара , что также не в лучшую сторону изменит ход процесса , и будет приводить к невоспроизводимым результатам. Образование пара заставляет применять более высококипящие жидкости ( t больше 60), но они как правило более вязкие , что приводит к применению более высоких давлений . В качестве ориентира следует указать величину вязкости порядка 1,5 сП , тогда скорость дви жения подвижной фазы ~0.4 м /с , Р ~200 атм . Если все— таки нужен растворитель с большей вязкостью , то можно термостатировать колонку при t ~60. Необходимо также помнить о согласовании свойств растворителя и метода детектирования . Так если применяют УФ— детектор , то растворитель должен быть прозрачным для его света , это же относиться и к ИК— детекторам . Также нужно особо тщательно следить за химической чистотой растворителя . Применительно к рефрактометрическим детекторам следует нужно сказать , что лучше использо в ать растворитель с минимальным коэффициентом преломления , тогда разность показателей преломления будет наибольшей , что приведет к большей точности анализа Однако ,вернемся к рассмотрению свойств растворителя . Как уже было сказано растворитель участвует в установлении равновесия в колонке , константы взаимодействий с участием растворителя определяют определяют элюирующую способность данной подвижной фазы . Под элюирующей способностью понимают способность вымывания разделяемых веществ , сорбированных в колон к е . Растворители с низкой элюирующей способностью не вымывают вещества из колонки ,или вымывают их через длительный интервал времени , растворители с высокой элюирующей способностью вымывают компоненты почти мгновенно и не разделяя . Подбор конкретного раств о рителя как правило производиться методом проб и ошибок , из-за отсутсвия четкой теории растворов . Понятно также ,что элюирующая способность может относиться только к какому-то конкретному веществу , - растворитель хорошо вымывающий одно вещество плохо вымыв а ет другое , или элюирует его слишком быстро . Несмотря на отсутствие четкой теории растворов ,необходимый растворитель можно предсказать на основе его физико— химических констант , для этого существуют специальные таблицы , содержащие информацию о важнейших ра с творителях. Как уже было сказано есть растворители , которые не вымывают веществ из колонки , такие растворители называют транспортными , если таким растворителем разбавить сильно активный растворитель , то его элюирующая способность снизиться . Последнее вре мя все чаще используют не индивидуальные вещества ,а именно смеси , особенно при хроматографировании многокомпонентных систем . Однако есть правило ,согласно которому при разделении смеси из n компонентов используют смесь из n растворителей , при этом 1 из ни х является транспортным , а остальные n -1 активные элюенты . Использование смесей из большего числа компонентов не приводит к лучшим результатам . Зачастую к растворителям делают добавки в количестве 0.1-2% --модификаторы , они позволяют значительно улучшить х роматографический процесс . Можно найти много путей действия модификаторов в каждом конкретном случае , например , это может быть связывание наиболее активных центров на сорбенте , и как следствие стабилизации термодинамики процесса . Модификаторы могут также и спользоваться для создания определенного pH среды ,наиболее благоприятного для протекания разделения . В качестве модификаторов обычно используют неорганические соли , буферные добавки и т.п . , в случае гель-фильтрации вкачестве модификатора могут выступать соли ( NaCl ), которые подавляют ионообменную активность сорбента , которая в данном виде хроматографии является лишней , также при хроматографии белков солевые и буферные добавки создают условия для растворения белков.Особое внимание следует уделить градиентн ому элюированию , при котором состав подвижной фазы меняется со временем в процессе элюирования . Обычно это позволяет улучшить процесс , повысить разрешающую способность колонки , уменьшить ширину пиков , увеличить их высоту. Как уже было сказано выбор раствор ителя - , задача не решаемая теоретически . Однако к настоящему времени получены некоторые практические наработки по выбору растворителя и вида хроматографии. ПРЕПАРАТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. Целью нашей ку рсовой работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита от низкомолекулярных сопутствующих веществ . Очистка производится методом гель-фильтрации . Производство вакцины подразумевает большие объёмы веществ , много больши е , чем те , с которыми приходится работать в лаборатории . Это накладывает на процесс определённые особенности , и обуславливает отделение препаративной хроматографии от аналитической . Одной из важных особенностей препаративной жидкостной хроматографии являет с я работа со значительно большими количествами вещества - до 0.1г . на 1г . насадки , и количество очищенного материала в единицу времени может достигать 100г и выше . Надо также сказать , что выделение (очистка ) веществ методом жидкостной хроматографии на сего д нейший день является сравнительно дорогой операцией . Поэтому при разработке методики важно учитывать такие факторы , как эффективность разделения , время проведения разделения (включая время подготовки процесса ). Часто , стараясь сэкономить на одном (уменьши т ь время разделения , увеличивая количество образца ), можно сильно проиграть на другом - качестве разделения , тогда конечный выделенный продукт может содержать слишком большой процент примесей , что сведёт на нет все труды и затраты по разделению . Исходя и з этих соображений ясно , насколько важно найти ту "золотую середину " в условиях , чтобы сохранять эффективность очистки и проводить разделение наиболее дёшево. При препаративном разделении часто приходится сталкиваться с такими понятиями , как перегрузка коло нки . Перегрузка -это такая нагрузка , которая больше не позволяет выделять продукт с требуемой чистотой или степенью извлечения. Эксперимент всё ещё является лучшим путём определения оптимальной нагрузки . Вообще величина нагрузки в большинстве случаев от па раметров , которые влияют на число теоретических тарелок . Также методом проб и ошибок было установлено , что для фиксированного размера образца более сложные разделения требуют значительно большего отношения массы насадки к массе образца . Структура и свойст в а молекул , характер их взаимодействия с подвижной и неподвижной фазами в присутсвии других компонентов образца , геометрия колонки , структура и свойства сорбента ,наряду с другими аспектами ,- являются критическими для определения оптимального размера образ ц а , при котором достигается максимальная эффективность и практичность разделения в препаративной хроматографии. В [3] приводятся данные , рекомендуемой нагрузки (масса сорбента на 1 грамм образца ) в зависимости от : Селективнос ть ( ij ) Сложность Разделения Ж.Х.-метод Масса адсорбента на 1 г . образца >2.0 Лёгкое Открытые колонки ~15 ~20 >1.5 Среднее Возможно на открытых колонках 50-500 До ~500 >1.3 Сложное На грани возможности Т.С.Х. До 500 500-5000 <1.3 Очень сложное Только В.Э.Ж..Х. ----- ------- (для силикагелевых сорбентов ) В препаративной жидкостной хроматографии размер теоретической тарелки зависит от количества и концентрации образца , введённого в слой. Понятно , что чем ближе сродство 2-х разделяемых веществ к каждой из фаз, тем труднее их разделить , нужно больше актов сорбции-десорбции . Достигнуть требуемого разделения в таком случае можно уменьшив размер образца , либо увеличить число теоретических тарелок (собственную эффективность колон ки ). Есть несколько способов увеличения эффективности колонки : a.)уменьшить размер частиц в колонке тех же размеров b.)увеличить эффективную длину колонки одним из следующих путей : 1. заполнить более длинную колонку, 2. соединить несколько колонок пос ледовательно, 3. использовать циркуляцию ; При увеличении длины колонки увеличивается время разделения и затраты растворителей , но с другой стороны можно брать большие объёмы образцов . Максимальная нагрузка сильно зависит от , при малом нельзя взять большую нагрузку , так как пики сильно сольются , при большом можно значительно увеличить нагрузку , так в [3] приводятся данные о том , что при увеличении от 1.05 до 1.2 нагрузка может быть увеличена в 15 раз , либо при той же нагрузке можно уменьшить длину колонки , сократив затраты на насадку , растворитель и сэкономив время , что выгоднее нужно решать в каждом конкретном случае Нагрузка и эф фективность. При увеличении нагрузки падает эффективность (число теоретических тарелок ), - вначале медленно , а затем с линейной скоростью . Однако в ряде случаев скорость потери эффективности всё-же может быть меньше скорости скорости увеличения нагрузки , таким образом если коэфициент разделения достаточно высок , можно смело увеличивать нагрузку (до определённого уровня ). Также следует отметить , что измеряемая эффективность для той же массы образца выше в случае более концентрированных растворов [3]. Ин т ересно отметить , что колонки , заполненные частицами большего диаметра изначально менее эффективны , но при увеличении нагрузки она остаётся почти постояноой [3].Таким образом при ведении трудных разделений простых смесей лучше использовать более длинные к олонки с крупными частицами сорбента. Нагрузка и время удерживания. В оптимальном случае время разделения дожно быть минимальным , однако с ростом нагрузки эффектвность разделения можно поддерживать на должном уровне только снизив скорость проведения анализ а ( увеличив время ) , либо провести разделение в несколько приёмов , что также приведёт к увеличению времени.Однако в большинсве случаев условия можно оптимизировать таким образом , что селективность станет значительно высокой (>1.3), тогда можно уменьшить время разделения , проводить процесс с большей скоростью , а если a>2 то с предельно возможной . Вообще возможности современной препаративной хроматографии позволяют проводить разделение в том же масштабе времени , что и аналитическое разделение. ИЗМЕНЕНИЕ ФОРМЫ ПИКА С УВЕЛИЧЕНИЕМ НАГРУЗКИ. Массовый коэфициент распределения между двумя фазами в процессе разделения выражается как k'=(C S *V S )/(C M *V M ) = K D *(V S /V M ) График зависимости C S oт C M в условиях достижения равновесия должен давать прямую линию , и это действительно так до определённой концентрации вещества в подвижной фазе , после этой концентрации линия (изотерма Лэнгмюра ) перестаёт быть линейной и изгибается либо кверху (размытый фронт ), либо кни зу (размытый тыл ) (рис .1). Первый случай имеет место , когда падает растворимость в подвижной фазе , второй когда неподвижная фаза слишком насыщена сорбируемым веществом (наиболее распространённый вариант ). В случае выпуклой изотермы при увеличении концентрации будет следующая картина : (схематический вид хроматограммы ): При малых концентрациях пик будет почти равносторонним треугольником , при росте концентрации фро нт будет всё более крутым , тыл пологим , в пределе ситуация стремится к прямоугольному треугольнику . Термодинамические причины рассмотренного явления таковы : с ростом концентрации величина K D падает т.е . молекулы будут находится больше в подвижной фазе , и сдвигаться в симметричной полосе к её левому краю (фронту ), делая фронт более крутым , а тыл пологим . В случае вогнутых изотерм принципы изменений те же , но происходят они в обратном порядке .Важно сказать , что в случае нелинейной изотермы , площадь пика ( а не его высота ) остаётся пропорциональной концентрации образца , при условии линейности отклика детектора в этой области концентрациий (должна быть проверена линейность отклика в этой области ). Понятно , что появление размытых "хвостов " у пиков ведёт к тр у дностям при выделении веществ , так как вероятно перекрывание с соседним пиком , возрастает разбавление , либо частью вещества придётся жертвовать (отбрасывать хвост пика ).Вообще говоря , даже в случае плохой селективности ( <1.3) вещества можно разделить с достаточно высокой степенью чистоты (~99%), но при этом неминуемо придётся жертвовать большими количествами веществ , либо применять рециркуляцию . Также нужно отметить , что в более выгодном для выделения положении находится перв о е элюируемое вещество . Таким образом некоторые рекомендации в связи с изменением формы пика : 1. Нужно использовать высокую концентрацию растворённого вещества , присутствующую в резком фронте пика с размытым тылом , отбирать максимальное количество чистого вещества из этой области ; 2. Выбрать такую разделительную систему , при которой нужный компонент элюируется первым ; 3. Использовать циркуляцию для более полного извлечения веществ с требуемой чистотой ; 4. Степень разделения должна быть максимально оптимиз ирована. Помимо названной причины отклонения пика от идеальной формы – нарушения линейности изотермы Лэнгмюра , есть ещё ряд причин , ведущих к каким-либо изменениям в форме пика. Кратко остановимся на них без детального рассмотрения. · пик имеет якобы си мметричную форму , характерную для линейной адсорбции – это может быть следствием наличия малых количеств вещества , о котором ранее не подозревалось имеющего сильный отклик детектора. · пик с выраженным хвостом вблизи нулевой линии . Причина его появления – конкуренция механизмов сорбции на неподвижной фазе , либо изменения в твёрдой фазе (гидролиз ) · зеркальное отражение второго случая – образование осадка в начале колонки , вследствии плохой растворимости веществ в элюенте ,- ведёт к очень плохому разделе нию. · угловая вершина пика – неисправна колонка (пустоты , неравномерность заполнения ). · пик содержит места изменения наклона . Это может быть следствием неполного разделения двух веществ. · растянутый чрезмерно тыл – следствие неполного равновесия (нет ра зделения как такового ) , либо бывает при рефрактометрическом детекторе (погрешность детектора ). Перечисленные выше причины негауссовской формы пика указывают на недостатки хроматогорафической системы , и необходимость внесения в неё изменений , потому как да нные причины не являются следствием типичных (классических ) процессов в колонке , и для получения устойчивых , качественных и воспроизводимых результатов необходимо избавится от этих факторов , портящих форму пика. МАСШТАБИРОВАНИЕ РАЗДЕЛЕНИЯ. После того как разработаны наиболее благоприятные условия для разделения ,- подобран растворитель , сорбент , геометрия колонки , количества и концентрации вводимых веществ , можно перейти к большим объёмам , характерным для препаративной хроматографии . Переход к большим объёмам разделений без потери прежних характеристик системы – называется масштабированием . Не все характеристики и условия процесса можно менять при масштабировании , некоторые можно менять только по специальн ы м пропорциям . Далее рассмотрим кратко масштабирование на основе аналитической жидкостной хроматографии. Химические свойства материала насадки при масштабировании не должны изменятся , может меняться лишь размер частиц . Любые модификации поверхности должны быть идентичны для препаративной и аналитической систем , даже простое уменьшение размера частиц путём размола ведёт к изменению свойств поверхности и резко отразится на процессе разделения . Поэтому при разработке препаративного разделения для малых масшта б ов лучше взять насадку той же марки , которая будет использоваться для препаративного разделения . Большое значение имеет также предыстория насадки , то есть какие растворители в ней использовались . Так , например , разработав разделение на аналитической к о лонке с определённым сорбентом , можно при переходе к препаративному разделению обнаружить неожиданные результаты , это может быть следствием того , что например сорбент , использованный в аналитической колонке когда-то давно был обработан растворителем , содержащим определённые модификаторы , которые могли осесть на сорбенте , необратимо изменив его свойства. Относительно геометрии колонки надо сказать , что нагрузка прямо пропорциональна площади поперечного сечения , однако надо заметить , что для полной пропорциональности необходимо , чтобы устройства систем распределения у входа и выхода были одинаковы у аналитической и препаративной колонок. По поводу концентрации следует сказать , что в отличие от аналитической хроматографиии , где концентрации составл яют ~1% от , в препаративной хроматографии концентрации 1-10 % , при исследовании больших концентраций возникает проблема массовой перегрузки , т.е . высота теоретической тарелки возрастает , пики уширяются , разрешение становится неприемлемо низким . Если к о нцентрация вводимого образца в пределе 1-10 % , но объём превышает 10-20 % мёртвого объёма , то пики слабоудерживаемых компонентов сильно размываются ,- возникает объёмная перегрузка. ПРЕПАРАТИВНАЯ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИ Я. В целом , конечно , закономерности для препаративной гель-фильтрации аналогичны остальным видам препаративной жидкостной хроматографии , но поскольку наши исследования связаны именно с гель-фильтрацией , считаем нужным остановиться подробнее именно на препаративной гель-фильтрации . Размер колонки является главным фактором , влияющем на масштаб препаративного разделения . С увеличением внутреннего диаметра колонки размер образца , объём вводимой пробы и скорость потока элюента могут быть увеличены . Для п репаративных разделений обычно предпочитают работать в условиях максимальных скоростей потоков и нагрузок , это позволяет проводить разделение без заметной потери разделительной способности.До тех пор , пока поддерживается разумная скорость потока , и колон к а не перегружена , эффективность (разд . способность ) определяемая числом теоретических тарелок , часто увеличивается с ростом площади поперечного сечения для колонок равной длины . В общем случае как размер образца , так и объёмная скорость потока могут быть увеличены пропорционально площади поперечного сечения колонки , независимо от типа или размера частиц насадки . Из-за высокой стоимости частиц сорбента малого размера (>10мкм ), чаще используют для стандартных и крупномасштабных разделений частицы большего д иаметра (30-60 мкм ) с широким распределением по размерам [3]. Также следует упомянуть о циклической гель-хроматографии , в этом случае фракции , получаемые на выходе из колонки могут быть подвергнуты повторному разделению на той же колонке для повышения их ч истоты . Также возможен вариант при котором повторное разделени осуществляется на другой колонке . Процесс увеличения длины колонки может быть повторён до тех пор , пока образец подлежащий разделению занимает весь объём колонки. Преимущества циклического разд еления : · требутся меньше растворителя, · снижается противодавление колонки , что позволяет увеличить время жизни , · использовать большие скорости потока. Но есть и недостатки . Так при циклизации происходит размывание зон - главный источник которого - мёр твый объём трубопроводов и насосов . Кроме того для образцов с широким М.М.Р . при проведении первого цикла весь объём пор будет занят , и при циркуляции реализовываться лишь небольшое увеличение разрешения . Также при циркуляции концентрации фракций уменьшаю т ся , поэтому необходимо концентрировать выделенные фракции , что ведёт к дополнительным затратам и усложняет весь процесс в целом . Также надо сказать , что сбор фракций становится более сложным для автоматизации , особенно если необходимо селективно удалять ф р акции на определённых стадиях процесса . В [3] имеется ссылка на то , что выделение веществ циклической хроматографией более качественное но более дорогое , хотя в ряде работ при разделении веществ с низкими молек . Массами была получена экономия растворителя и продлена жизнь колонки. ОПТИМИЗАЦИЯ ПРРЕПАРАТИВНОЙ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ. Надо сказать , что теория и практика аналитического разделения подходит и к препаративному разделению , что конечно упрощает процесс оптимизации , учитавая то , ч то только эксперимент позволяет подобрать наиболее выгодные условия для разделения . Так если в лаборотории найдена оптимальная линейная скорость потока , то её же можно поддерживать и в колонках большего диаметра (препаративных ). Тогда соответственно для о б ъёмной скорости : F P =( D P / D а ) 2 * F а , где а - аналитическая система , P - препаративная система В [3] рассматривается влияние некоторых параметров на эффективность препаративного разделения . Так было установлено , что при увеличении скорости потока падает Rs . В [3] также есть ссылки на то , что хотя число теоретических тарелок резко уменьшается с увеличением скорости потока , при низких нагрузках , но однако скорость мало влияет на число Т.Т . при высоких нагрузках . Оптимальный вводимый объём в препаративной хро м атографии (в отличие от аналитической ) зависит главным образом от диаметра колонки , её длины и требуемого разрешения . Число Т.Т . по видимому менее чувствительно к увеличению объёма образца в тех случаях , когда увеличивается диаметр колонки . Увеличение дл и ны колонки позволяет увеличить разрешение , но имеет также обратный эффект , связанный с увеличением времени разделения и уменьшением при этом производительности . В [3] также даётся ссылка на то , что лучше использовать большие объёмы проб , при этом эффе к тивность фракционирования заметно улучшается . В [3] даётся ссылка на работу , в которой обнаружено , что оптимизировать разделение можно путём расположения насадки в виде слоёв , так чтобы средний размер пор убывал в направлении потока в колонке . Было в зн а чительной мере уменьшено влияние концентрации , и увеличен выход образца. Оптимальный объём фракции прямо зависит от объёма и концентрации вводимого образца , разделительной способности и размера колонки . Показано также , что уменьшение объёма фракции меньше влияет на уменьшение полидисперсности , когда Mr фракции уменьшается или увеличивается объём элюирования (т.е . низкомолекулярные вещества выходят более чистыми ). В [3] также указывается на то , что образцы в гель-фильтрации можно вводить один за другим с интервалом , соответствующему примерно объёму V 0 , увеличивая выход образца , экономя растворитель и уменьшая время разделения Клещевой (весенне-летний ) энцефалит. Клещевой энцефалит (синонимы : таежный энцефал ит , дальневосточный менингоэнцефалит , клещевой энцефаломиелит , русский весенне-летний энцефалит , tick-borne encepalitis) - вирусное , природно-очаговое (характерное только для определенных территорий ) заболевание с преимущественным поражением центральной н е рвной системы (ЦНС ). Разносчиками инфекции являются иксодовые клещи , вирус передается при укусе больного клеща . Инфекция также поражает и животных - грызунов , домашний скот , обезьян , некоторых птиц. Возбудитель инфекции - это вирусы семейства Flaviviridae. Выделяют два принципиально важных географических , клинических и еских варианта вируса и заболевания . Дальневосточный , самый тяжелый вариант клещевого энцефалита , а также европейский вариант клещевого энцефалита . Сам вирус клещевого энцефалита был впервые выделен в 1949 г . В настоящее время инфекция регистрируется в Австрии , Германии , Польше , Чехословакии , Финляндии , прибалтийских государствах , европейской и дальневосточной части России , Италии , Швейцарии . Максимальные показатели заболеваемости отмечаются в России и Австрии . За неполный 1999 г . в России было зарегистрировано более 7000 случаев заболевания , что на 30% выше показателей 1998 г. Наибольшему риску подвержены лица , деятельность которых связана с пребыванием в лесу - работники леспромхозов , геолого разведочных партий , строители автомобильных и железных дорог , нефте - и газопроводов , линий электропередач , топографы , охотники , туристы . В последние годы отмечается преобладание среди заболевших горожан . В числе больных до 75% составляют горожане , заразив ш иеся в пригородных лесах , на садовых и огородных участках . Экстренная профилактика (то есть профилактика после укуса клеща ) может быть проведена с помощью иммуноглобулинов . В России доступны два отечественных препарата (из лошадиной и человеческой сыворот к и ) и один импортный - FSME-Bulin (пр-ва Immuno AG, Австрия ). Вакцины. Принципиально все вакцины для профилактики клещевого энцефалита представляют собой выращенные на ку риных эмбрионах , инактивированные формалином вирусы , сорбированные на адъюванте (вещество для усиления иммунного ответа ) - гидроокиси алюминия . В качестве дополнительных , стабилизирующих компонентов применяют желатин или альбумин . На настоящий момент в России доступны четыре вакцины : я культуральная вакцина (пр-во НПО Вирион , Томск ). Показана для вакцинации детей с 4-х лет и взрослых до 65 лет . Курс вакцинации состоит из трех доз по схеме : 0-1-4. Альтернативная схема для быстрой защи ты состоит из двух доз с интервалом 1-2 месяца , причем последняя доза вводится не позднее , чем за 2 недели до входа в природный очаг инфекции . Объем вводимой дозы для детей до 6 лет составляет 0,5 мл , для всех остальных - 1 мл . Выпускается в ампулах по 2 м л . Вакцина обладает самым обширным списком противопоказаний , включающим острый туберкулез и ревматизм , заболевания ЦНС , сердечно-сосудистой системы , почек , печени ; аллергические расстройства , эндокринные заболевания (сахарный диабет и др .), онкологические заболевания , болезни крови , беременность. я концентрированная культуральная вакцина (пр-во Института полиомиелита и вирусных энцефалитов , Москва , Россия ; штамм Софьин ). От первой отличается тем , что может применяться с возраста 18 лет . Курс вакцинации сос тоит из двух доз с интервалом 5-7 месяцев . Первую ревакцинацию делают одной дозой вакцины через 1-2 года , вторую и последующие – через три года . Противопоказания - активный туберкулез , перенесенная в предыдущие 6 месяцев менингококковая инфекция и вирусны й гепатит ; наследственные и активные заболевания нервной системы , эпилепсия , пищевая аллергия , бронхиальная астма , заболевания соединительной ткани (напр . ревматизм ), болезни крови , перенесенный инфаркт и инсульт , болезни эндокринной системы , злокачественн ы е новообразования , беременность. я "FSME-Immun-Inject" (пр-ва Immuno AG, Австрия в составе компании Baxter, США ). Выпускается в виде шприц-доз , объем дозы - 0,5 мл для всех возрастов . Очень короткий список противопоказаний - острые (или обострения хроничес ких ) заболевания , аллергия на компоненты вакцины . Беременность и лактация не являются противопоказанием . Защищает от обоих вариантов инфекции - европейского и дальневосточного . Курс вакцинации состоит из 2 доз , которые вводятся c интервалом от 2 недель до 1 месяца (после такой вакцинации защищенными являются 95% привитых ); первая ревакцинация проводится через 9-13 месяцев после введения второй дозы ; повторная ревакцинация проводятся через 3 года от момента введения третьей дозы . Может вводиться одновременн о с иммуноглобулином . Не имеет возрастных ограничений . Из двух импортных вакцин , доступных в России , обладает большей распространенностью и более широким опытом применения. я "Энцепур " (пр-ва Chiron Behring, Германия , вирусный штамм К 23). От предыдущей отли чается наличием дополнительной схемы вакцинации - три дозы по схеме 0-1-3 недель . Второе отличие - несколько большее число побочных реакций в связи с присутствием в составе вакцины желатина . Все перечисленные вакцины обладают высокой иммуногенной активн о стью . Через две недели после введения последней дозы первичного курса вакцинации иммунитетом обладают от 90 до 97% привитых . Среди побочных реакций преобладают реакции в месте инъекции (покраснение , уплотнение , болезненность ) их отмечают около 8% привитых первой дозой вакцины , с последующими дозами вакцины число побочных реакций снижается . Температурные реакции встречаются у 5% вакцинированных. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. При производстве вакцины против в ируса клещевого энцефалита важное значение имеет очистка готового продукта на последних стадиях производства . Суть очистки в том , чтобы отделить белки вакцины от низкомолекулярных веществ , которые вводятся на разных стадиях производства вакцины с целью о т делить вирус от клеточных оболочек , дезактивировать вирус . В качестве этих низкомолекулярных веществ могут выступать антибиотики (канамицин , неомицин ) , а также тритон TX -100. В масштабах лабораторной практики эта задача не является сложной . Можно взять не большой объём пробы и провести успешное отделение высокомолекулярной компоненты от низкомолекулярной . Однако , нас интересует препаративное разделение в промышленных масштабах . В этом случае необходимо учитывать и такие факторы как быстрота проведения разд е ления , количества , выделяемые при разделении , сложность и стоимость проведения разделения , естественно качество выделяемого образца (чистота ), должно быть неизменно высоким . Очевидно , разделение будет более дешёвым , если разделять возможно большие порции вещества (проводить очистку больших доз вакцины ), при наибольших скоростях , с максимальными концентрациями . Но при этом возможно размывание зон (пиков ) и придётся либо отбрасывать часть вещества , либо мириться с примесями , также не следует забывать о ра з бавлении препарата при гель-фильтрации . Вообще как указывается в [3] , основным недостатком гель-фильтрации в препаративном разделении является низкое отношение объёма пор к общему объёму колонки , для нынешнего поколения сорбентов . В связи с этим , часто в о зникает необходимость применения последовательного подключения большого числа колонок с соответсвующим ростом затрат . Целью нашей работы стала оптимизация процесса очистки вакцины от низкомолекулярных веществ . Исследования проводились на модельных смесях, содержащих в качестве белковой части альбумин (1мг /мл ), в качестве низкомолекулярного вещества анальгин (1мг /мл ). Применение альбумина обусловлено тем , что это сравнительно лёгкий белок (~50000), и обладает способностью сорбировать на себе низкомолекуляр н ые вещества . Таким образом добившись разделения этой смеси , можно рассчитывать на то , что разделится и реальная смесь. Для исследования нами были приготовлены два раствора первый содержал только анальгин , второй анальгин и альбумин . Раствор готовился на ос нове 0.02М фосфатного буфера ( pH =7.2), также оба раствора содержали 0.15М NaCl для предотвращения ионообменных процессов в колонке и для улучшения растворимости белка. Для приготовления растворов анальгин был взят из продажной таблетки , альбумин из продаж ного препарата (10% раствор ). Для приготовления растворов сперва был приготовлен фосфатный буфер с добавкой соли . Буфер готовился смешением рассчётных количеств Na 2 HPO 4 и NaH 2 PO 4 , также при растворении была добавлена соль . После чего раствор разделили на 2 части в одну добавили аликвоту содержащую анальгин , в другую аликвота , содержащая анальгин и альбумин. Для приготовления растворов использовалась бидистиллированная вода , растворы перед введением в колонку фильтровали. Сначала нами было проверено влияет ли объём вводимой пробы на местоположение пика . Для этого был взят раствор , не содержащий альбумина . В колонку гель-фильтрации вводили в первом опыте 5 мл . раствора , во втором 30 мл . раствора . Время выхода (начало появления анальгина по детектору ) в обои х случаях было одинаково и составляло 14 мин . Затем нами была проведена гель-фильтрация модельных смесей , также при разных объёмах проб (5, 20, 30 мл .) результаты в виде таблицы : Таблица 1 V пробы Мл. T вых анальгина t вых альбумина Ширина пика альбумин а Примечание. 5 14 8.5 7 Не перекрыв. 20 14 * 8.5 11 Перекрыв. 30 15 * 8.5 13 Перекрыв. *- время минимума на хроматограмме. Таким образом видно , что объём больше 30 мл увеличивать нельзя так как уже при этом объёме пики частично перекрываются . Для боле е детального изучения разделения при объёме пробы 30 мл , было принято решение собрать и проанализировать фракции , начиная с 8.75 минуты . Сначала была собрана фракция в интервале 8.75-14.0 минут (31.5 мл ), затем с 14.0 минуты собирали фракции по 3 мл (мен я ли пробирки через 30 сек .). Анализ всех фракций проводили на ионообменной колонке MONO “ Q ” объём пробы 100 мкл . Анализировали последовательно основную фракцию и фракции из 5-ти пробирок . При этом производили оценку относительной концентрации альбумина по в ысоте пика , за единицу была принята концентрация в основной фракции (8.75-14.00 мин ). Формула для расчёта : C i = h i / h осн , где h i - высота пика альбумина в i -пробирке h осн - высота пика в основной фракции Анализ проводился с целью определить оптимальное время для остановки отбора фракции альбумина . Поэтому также нами рассчитывалась концентрация альбумина на текущий момент времени (т.е . если бы фракции собирались в одну пробирку ), при этом также концентрация в основной пробирке была принята за 1, и общий объём фракции . Также нами было посчитано относительное количество вещества в фракции , как i =C отн . *V . C отн . = (31.5*1+3* n i C i )/(31.5+3*n) V = 31.5+3* n ; где n - номер пробирки. Тогда процент выведенного альбумина будет = отн / отн 5 , в расчёте на то что с 5 пробиркой выходит весь альбумин ( вообщ е это так и есть – см . табл .) Результаты в виде таблицы : Таблица 2. № пробирки Интервал t мин C i % C отн V мл Кол-во вещества %выд. Альбумина 0 (основн .) 8.75-14.00 100 1.000 31.5 31.500 84.70 1 14-14.5 85 0.987 34.5 34.050 91.53 2 14.5-15 70 0.964 37.5 36.150 97.17 3 15-15.5 26 0.912 40.5 36.939 99.29 4 15.5-16 8 0.854 43.5 37.149 99.86 5 16-16.5 2.4 0.800 46.5 37.200 100 Таким образом мы можем сделать вывод о том , что сбор высокомолекулярной фракции можно прек ратить на 3 пробирке ( на 15.5 минуте ) , объём фракции при этом составит 40.5 мл ( при неизменной скорости потока 6 мл /мин ). Тогда потери альбумина составят 0.71%, при этом концентрация белка в этой фракции будет 0.735 мг /мл ((1*0.9929*30)/40.5), вместо и с ходной 1 мг /мл. Также было проверено можно ли отделить тритон TX -100 от альбумина в данной системе . В результате оказалось , что тритон слабо удерживается на данной колонке , притом время появления тритона также не зависит от объёма вводимого образца . Разн ица между пиками на хроматограмме слишком мала , чтобы можно было проводить препаративное разделение . Эти результаты можно объяснить тем , что молекула тритона слишком велика , образует ассоциаты с молекулами воды , другими молекулами , что ведёт к плохому пр о никновению в поры сорбента , и как следствие плохому удерживанию . Возможно стоит сменить сорбент , использовать другую марку с другими характеристиками. Подводя итог нашей работы следует сказать , что нами была разработана методика очистки вакцины от некоторы х низкомолекулярных веществ , чтобы воплотить эту методику на практике нужно лишь провести масштабирование до нужных масштабов . Суть масштабирования может быть в том что будет увеличен внутренний диаметр колонки , может быть увеличена скорость , либо концен т рация исходного образца , выводы по масштабированию могут быть в каждом случае свои в зависимости от возможностей. ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА. 1. В.Э.Ж.Х . в биохимии / под ред . Бауэр Г . ,Хешиена А . и др.М . Мир 1988 2. Сахартова О.В ., Шатц высокоэффективная жидкостная хроматография 3. Бидлингмейер Б . , Фрайд Б . Препаративная жидкостная хроматография М . Мир 1990 4. Остерман Л.А . Хроматография белков и нуклеиновых кислот 5. Хефтман Хроматография ч 1,ч 2.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Русские заселяются в гостиницу.... Администратор проводит инструктаж: в номере - стол один, стула - два, кровати - три, стенЫ - четыре....
Так и должно остаться после отпуска....
И еще: в отеле проживают 230 немцев, которые не причастны ко Второй мировой войне.....
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, курсовая по медицине и здоровью "Оптимизация условия очистки вакцины против вируса клещевого энфевалита", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru