Курсовая: Регистрация сигнальных молекул - текст курсовой. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Курсовая

Регистрация сигнальных молекул

Банк рефератов / Биология

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Курсовая работа
Язык курсовой: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Microsoft Word, 398 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникальной курсовой работы

Узнайте стоимость написания уникальной работы

содержание стр. С писок сокращений введение 1. обзор литера туры 1.1. Использование Ti -плазмид агробактерий в генетической инженерии 1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens 1.1.2. C оздание векторов на основе Ti -плазмид 1.1.3. Процессинг тДНК в бактериа льной клетке и ее перенос в клетки раст ени й 1.1.4. Разработка система трансформац ий растений с помощью Agrobacterium tumefaciens 1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов , перенесенных в растение 1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях 1.2. Использов ание метода ге нетической инженерии для трансформации однодольных р астений 1.2.1. Краткие характеристики ряски 1.3. Сигнальные молекулы , их способность индуцировать процессинг тДНК 2. Материалы и методы 2.1. Материалы 2.1.1. Оборудование 2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды 2.1.3. Растения 2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений 2.1.5. Другие растворы 2.1.6. Ферменты , используемые в генной инженерии 2.1.7. Антибиотики 2.2. Методы 2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений 2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens 2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по С аузерну 2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli 3. результаты 4. обсуждение 5. выводы лите ратуры приложение СПИСОК СОкРАЩЕНИЙ НУК – нафтиуксусная кислота БАП – бензиламинопурин MS – LB – тДНК – Ар – ампицилин Cs – ц ефотоксин ВВЕДЕНИЕ Актуальност ь работы : Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений корончато-га лловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-156 мДа ) конъюгированных Ti -плазмид (от англ . tumor - inducing – вызывающий опухоль ). В процессе и дентифицирования растений часть генетического ма териала Ti - плазмид – тДНК (от англ . transferred DNA – передаваемая ) перемещается в растительные клетки и интегрируется в хромосомы , оставаясь частью наследственного мат ериала . Гены тДНК экспрессируются в трансформ арованных растительных клетках , нарушают их ф итогормональный баланс и определяют синтез сп е цифических ------- соединений. Таким образом , агробактерии являются прир одными "генными инженерами ", осуществляющий поразит ельный по филогенетической дальности перенос генетической информации . На основе агробактерий сконструированы эффективные векторные си ст емы для генетической инженерии растений. Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса взаимодействия между бактериальными и растительными клетками . В этом процессе одной из решающих стад ий является рецепция агробактериями осо бы х сигнальных молекул , присутствующих в экссуд атах поврежденных тканей растений . Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir (агробакт ериальных Ti-плазмид ), контролирующих вырезание тДНК и ее перенос в клетки растений . Агроб актерильная тра нсформация наблюдается у ш ирокого круга голосеменных и двудольных расте ний , однако , она отмечена лишь у весьма незначительного числа однодольных растений . Одн ой из причин ограничений агробактериальной тр ансформации однодольных считается присутствие в их к л етках сигнальных молекул , индуцирующих процессинг и перенос тДНК. Цель работы : В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких сигнальных молекул у однод ольных растений . В связи с этим , целью данной работы был анализ ряски на при сутствие у них сигнальных молекул , инд уцирующих процессинг тДНК. 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Использование Ti- плазмид агробактерий в генетической инженерии растений 1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens За после днее десятилетие в области генетической инженерии растений достигнуты значительные усп ехи . Были разработаны разнообразные методы ге нетической трансформации и , в настоящее время осуществлена экспрессия чужеродных генов в растениях многих видов . Наиболее важным д ля развития генетичес к ой инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых образований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7]. Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем . Rirobiaceae ) характеризуютс я присутствием в клетках большой плазмиды , так называемой T i-плазмиды , весом более 150 т.п.н . (см . Приложение ) [9]. Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных , а так же у некоторых однодольных рас тений [2,3]. Для инфицирования in vivo необходимо повреждение тканей растения [12]. После прикрепления к клеточной стен ке растительной клетки агробактерии переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК ) в ядро , где происходит ее стабильная интеграция в хромосому растения. Доказано , что функция распознавания клето к и прикрепления к ним , а так же вырезание , перенос и , возможно , интеграция тДНК в растительный геном кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir -области , н аходящихся на Ti -плазмиде [14]. После переноса в ядро растительной кл етки , тДНК может интегрировать в геном в виде одной или нескольких копий [15]. Вст роенная тДНК имеет свойства , характерные для ДНК эукариот , что показано в эксперимента х по гиперчувствительности к ДНК-азе I ( Schafer , 1984). В зависимо сти от типа Ti-плазмиды , в тДНК находится от семи до тринадцати генов , ответств енных за опухолевый фенотип . Гены 1 и 2 кодир уют ферменты , участвующие в синтезе ауксина , индолилуксусной кислоты , в то время , как ген 4 кодирует изопентенилтрансферазу , синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5'-монофосфат [16]. Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 прив одит к повышению уровня фитогормонов внутри трансформированных клеток . Результатом этого является повышение митотической активности и образование опухоли . Другие гены тДНК кодирую т синтез так называемых оп инов , из которых наиболее изучены нопапин и октопин . Опины представляет собой производное аминок ислот и сахаров , которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом , образов ание корончатого галла представляет собой хор ошо охарактеризованный п р имер генетич еской инженерии растений в природе. Мутации в вирулентных генах агробактерий . Наличие Ti-плазмид в клетках агробактерий является абсолютно не обходимым условием патогенности микроорганизма . И злеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий ави рулентн ы . На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные мутации , картируемые как на опухолевых плазмидах , так и на хромосом ах . Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями , так же как хемотаксис , прикр епление к поверхности расти т ельной клетки и специфическое связывание в центра х инфекции контролируются генами , имеющими хр омосомную локализацию . В хромосоме расположены некоторые гены , регулирующие экспрессию vir -генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам расте ния яв ляется одним из первых этапов , определяющих эффективное взаимодействие . Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два связанных межд у собой хромосомных локуса Chva и Chvb , размерами 1,5 kb и 5 kb , соответственно [Дуглас и др , 1985]. Гены этих локус ов экспрессируются конститутивно . В результате тра нспозонного мутагенеза этих областей получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии . Мутации в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактер ии , но не для всех хозяев . Л о кус Chvb оп ределяет синтез нейтрального циклического - D -гликана , который трансформируется в периплазматическое пространс тво клетки с помощью продукта гена Chva . Роль нейт рального - D -глик ана в инф екционном процессе еще точно не установлена . Помимо циклического - D -гликана в пр икреплении патогенных агробактерий к растительны м клеткам принимают участие и другие поли сахариды , в частности внеклеточные экзополисахари ды. Орг анизация vir -генов Ti-плазмид . Вирулентные гены агробактерий на Ti- и Ri -плазмидах кластеризованы в области vir разметом о коло 30-35 kb , проявляющей в этих плазмидах значительную го мологию ДНК . Выявлена также гомология vir -генов Ti-плазмид Agrobacterium t umefaciens с tra -генами конъюгитивных плазмид . В ----- Ti-п лазмидах в области vir локализовано шесть различных гр упп комплементации A , B , C , D , E и G , организованных в единый регулон [ Stachel Nester , 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополн ительны й локус vir F , расположенный справа от локуса vir E [ Kooykaas et al ., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A , vir G , vir B и vir D придают агроб актериям авирулентный фенотип , в отличие от большинства хромосомных мутаций , имеющих круг трансформируемых ра стений-хозяев. Продукты генов vir -области контролируют процессинг т ДНК в бактериальной клетке , ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерн ый геном растения , причем эти процессы ген ы vir могу т определять не только в цис , но и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных репликонах ). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются в практике удобные бинарные в екторы для генетической инженерии растений [ Дрейпер с соавт , 1991 ]. Для процессов "вырезания " тДНК из плазмиды (точнее , высвобождения в процессе репликативного синтеза ) и ее переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми границами : несовершенны ми прямыми повторяющимися последовательностями Д НК размером 24 ---- , проявляющими зн а читель ную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазми д . Границы тДНК гомологичны о бласти oriT конъюгативных плазмид . В этой области сайт-с пецифические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв , служащий началом репликации по ти пу разматывающегося рулона , происходящей в процессе транспорта плазмиды . Репликация обе спечивает сохранение плазмиды в материнской к летке и появление ее копии в дочерней. Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку особенно важна ее правая граница , которая одна может определять полярность переноса тДНК . Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью авирулентными . Замена ее на искусственно синтезированную , так же к ак и на левую , восстанавливает вирулентность микроорганизма. На процессинг тДНК в клетках ба ктерий влияют мутации в генах vir D, vir C и vir E – оперонов , на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутаци и в генах vir B и vir D – оперонов. 1.1.2. Создание векторов на основ е Ti-плазмид В начал е восьмидесятых годов были с деланы пе рвые попытки перенести чужеродные последовательн ости ДНК в растительные клетки либо с помощью транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980] , либо п утем сайт-специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с Ti-п лаз мидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981] . Однако , эти р анние эксперименты , основанные на двойной рек омбинации , занимали много времени , были доволь но сложны и трансформации проходили с оче нь низкой частотой . Необходимо было разработа ть более эффективные векторы , чтобы обле гчить генетические манипуляции с бактериями и позволить селекцию и регенерацию трансформат ов. Сейчас используют две принципиально разны е системы для введения чужеродных генов в растения с помощью Ti-плазмид : 1. ---- век торы 2. бинарные векторы. В основ е создания -------- векторов лежит тот факт , что гены тДНК не ------- для растительных клеток , и любая последовтельность ДНК , встроенная м ежду границами тДНК , может интегрировать в хромосому растительной клетки и нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983] . В -------- векторых сист емах тДНК можно заменить , например , на пос ледовательность pBR322 , а чужеродную ДНК , которую предпол агается перенести в растения , нужно проклонир овать в этом же векторе. Затем путем гом ологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактер ии (рис . 2). Одним из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski et al., 1983] . В нем все гены , ответственные за си нтез фитогормонов , были заменены на последовательнос ть pBR322. ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ------- област и тДНК pGV3850 с любыми производыми pBR , несущими клонированный ген. Гены , кодирующие различные маркерные белк и для быстрого отбора трансгенн ых рас тений , были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984] . Была разработана система трехродительного скрещивания для перенос а любых производных pBR322 из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983] . В настоящее вре мя сконструированы и успешно ис пользуются и другие --- ---------- векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988]. Рис . 2. Схемы -------- (А ) и бинарной (Б ) векторных систем . vir – область в ирулентности . HOM – области гомологии , в пределах которы х может происходить рекомбинация , при водя щая к образованию коинтегратов . LB и RB – левая и правая границы тДНК . MCS - ----- сайт для клонирования . РТМ – маркет трансформации для растений . RES – маркер устойчивости к антибио тику для бактерий . OriT – начало переноса и bom- сайт для мо билизации в екторов при конъюгации . Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало репликации из плазмиды широкого круга хозяев RK2. Система бинарных векторов основана на том , что область тДНК и гены vir могут распологаться на разных пла змидах [Hockemu e t al., 1983] . В таких системах обычно присутст вуют два элемента : 1) Ti-плазмида-п омощник , в которой тДНК польностью делетирова на . Эта плазмида несет в своем составе гены vir , действующие in trans . 2) Плазмида широкого круга хозяев , имеющая сайты для к л онирования и маркерные гены для селе кции растений , ограниченные правой и левой фланкирующими последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис Обе опи санные выше системы векторов предполагают --------- этапах сборку нужных конструкций в промежуточ ных вектора х , например в pAP2034 [Veltena, Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а зате м перенос из в готовом виде в рецепие нтные штаммы агробактерий. 1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений Формы пр оцессированной тДН К . При культивировании Agrobacterium tumefaciens с механически поврежденными частями растен ий , регенерирующими протопластами или в прису тствии --------- из клеток бактерий можно выделить различные молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные л инейные , дву цепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые , которые могут претендовать на роль посредн ика в переносе генетического материала в растительную клетку [-------, 1980] . Причем кольцевая форма , образующаяся за счет гомол огичной рекомбинации между правой и лев ой границей тДНК с образованием одной гиб ридной границы , встречается в очень малых количествах . При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК , в то время как в случае образования двух других ф орм , возможно прохождение репликации т ДНК в бактериах в процессе ее тра нспотра в растения (к появлению одноцепочечны х форм может приводить прерывание , ингибирова ние прерывистого синтеза запаздывающей цепи ). Репликация призвана обеспечить сохранение тДНК в исходной Ti-плазмиде , если только не д опустить возможность существования ф изического вырезания материала тДНК из Ti-плазм ид за счет образования двухцепочечных разрыво в в границах . Исчезновение тДНК из Ti-плазми д является главным недостатком отошедшей на второй план подобной "эксцезионной моде л и ". Тем не менее , образование двуцепочечных разрывов внутри границ и появле ние детектируемых количеств линейной двуцепочечн ой формы тДНК при культивировании бактериальн ых клеток в присутствии ---------- исследователи набл юдали уже через 30 минут после доб а вления этого индуктора в среду . Так же в условиях индукции vir- генов --------- в клетках аг робактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма процессированной тДНК [Stachel et al., 1986] . Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после добавления индуктора , и его количество накапливается н а протяжении последующих 40 часов более , чем в два раза , а затем идет на убыль , показывая , что процесс лимитирован. Какая из форм транслоцируется через б актериальную мембрану в бактериальную клет ку до сих пор остается не выяснен ным из-за трудности определения относительного количества каждой из форм и выявления динамики их превращения . Возможно , процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени и идут сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид , происходящему в ме сте контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979] . Тогда все обнаруживаемые интермедиаты могут быть аберрантными формами прерванного на каком-то этапе неделимого процесса (или неправильно завершенного ). В случае индуцированной экс прессии vir - генов ------- отсутствует главный элемент взаимодейств ия – контакт бактериальной клетки и раст ительной клетки , и , поэтому , все обнаруживаемые в этом случае формы могут претендовать на роль посредника лишь с определенными допущ ениями . Достоверно известно , что в растительную клетку попадает только одна цепь тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже в растительной клетке . Обсуждается , ч то в случае прохождения в клетке Agrobacterium tumefaciens -------- полуконсервативной репликац и и т ДНК вторая цепь может в процессе переноса гидролизоваться , высвобождая энергию для тра нспорта переносимой цепи. 1.1.4. Разработк а система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens Бол ьшинство первоначальных экспериметнов по генетич е ской трансформации растений было предпри нято с помощью заражения пораненных раститель ных клеток с помощью агробактерий с немод ифицированными Ti-плазмидами . Для сохранения стерил ьности часто инфицировали эксплантаты in vitro вместо целых растений . Бактерии затем удаляли , добавляли в среду цефот оксин или карбенициллин . Трансформанты отбирали на безгормональной среде. В дальнейшем по мере создания обезору женных векторов и новых селективных маркеров , был разработан более эффективный метод , дающий большое число трансформантов : кокульт ивирование агробактерий с растительными протопла стами либо с эксплантантами листьев . Было показано , что кокультивирование протопластов с агробактериями , либо с бактериальными --------, привод ит к образованию опухоли [Marton et al., 1 979, Wullems et al., 1981]. Затем подо бный подход был успешно применен для тран сформации растительных клеток агробактериями , нес ущими в составе тДНК химерные селективные маркеры [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983] . Этот метод был в дальней шем у лучшен использованием так называемых фидерных культур [Fraley et al., 1983] . Однако , все перечисленные методы пригод ны только для трансформации растений , которые можно легко регенерировать из протопластов ( например , табак и петуния ). Эту проблему мрож но легко преодолеть кокультивируя агробак терии с листовыми дисками вместо протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986] . Стерильные листовые диски --------- с агробак териями , несущими в составе обезоруженного ве ктора какой-либо селективный маркер устойчив ости к антибиотику . Затем кусочки листьев культивируют два дня на фидерных чашках с о средой для образования побегов . После эт ого их переносят на среду с цефотоксином для уничтожения бактерий и с каким-либо антибиотиком (наприме р , с ---------) для отбора трансформантов . Регенерировавшие побеги дают корни , после чего растения переносят в почву для проведения дальнейших эксперимент ов. Поскольку метод трансформации листовых ди сков представляет собой идеальное сочетание высокой ча стот ы трансформации с легкой и быстро й ------- и регенерацией трансформантов , этот подхо д стали использовать во многих лабораториях мира . Кроме того были предложены некоторы е модификации метода . Для повышения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было предложе но обрабатывать агробактерии --------- [Sheikholeskam a. Week S, 1987] , который является индуктором генов vir [Stachel et al., 1985]. Однако метод трансформации л истовых дисков применим для трансформации тол ько тех видов растений , которые могу т регенерировать побеги из недифференцированных клеток в месте поранения. Наряду с методом трансформации листовых дисков широко используются конъюгированные а гробактерии со стеблевыми сегментами [An et al., 1986] , клетками суспензированной культуры [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами [Pollock et al, 1985] и прорас тающими семенами [Feldmam a. Markis, 1987] . Метод трансформации семян агро бактериями был впервые применен для арабидопс иса и заслуживает особого внимания , так ка к не требует работы с культурой тка ни. 1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов , перенесенных в растение Чужеродные ДНК , перенесенные в растительные клетки с помощью различных методов , обычно встраивают ся в ядерный геном и наследуются в со ответствии с законами Менделя [De Block et a l., 1984; Horsch et al., 1984] . Области ингерации , по видимому , распределены случайным образом по геному . Встраивание ге нов по определенным сайтам было ранее опи сано в системах животных клеток [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] и не давно подобный под ход был успешно при менен для трансформации растений [Paszkowski et al., 1988] . В большинстве случаев последовательности чужеродной ДНК встраиваются в один локус либо в одной копии , либо в виде класте ра тандемных вставок , что было показано с помощью гибрид изации in situ [Mouras et al., 1986] . Однако , часто на блюдаются множественные вставки в два или более участков на разных хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a. Marus, 1987] . В связи с этим во многих случа х была получена контрансформация физически несцепленных генов , сегрегация некоторых про ходила в поколении F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986] . Чужеродыне гены обычно передаются потомст ву с высокой степенью стабильности при ме йозе [Muller et al., 1987] . Одн ако , иногда наблюдали случайную потерю трансформированного фенотипа после ме йоза [Potrykus et al., 1989] . Возмножно , это происходило из-за активации чужеродного гена (например , при метилировании ДНК ). Интеграция чужеродной ДНК во внеяде рные геномы , наприме р , в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980] , так же происходит по неменделевскому типу наследования – по материнской линии. Используя метод гибридизации по Саузерну [Southern, 1975] дл я анализа трансформантов и их потомства , м ногие исследователи показал и , что часто наблюдается встраивание укороченных , тандемных или перестроенных копий чужеродных генов , осо бенно после прямого переноса ДНК в протоп ласты [Krens et al., 1985] . Появление тандемов , часто от 5 до 20 ко пий , можно объяснить рядом рекомбинаций пер ед интеграцией в геном [Szernilofsky et al., 1986; Wirtz et al., 1987] . Образ ование инвертированных повторов является основны м типом перестроек чужеродной ДНК при при менении векторов , содержащих тДНК ----- Ti-плазмиды [Jorgensen et al., 1987] . Итак , при пр оведении опытов по трансформации растений , необходимо принимать во внимание тот факт , что чужеродная ДНК может подвергаться различным модификациям пере д встраиванием в геном хозяина . Однако , и после интеграции могут происходить различные ее перестройки , о б ычно во вре мя мейоза [Czernilofsky et al., 1986] . В таких случаях только перекрест ное опыление тщательно отобранных трансформантов с наиболее желаемым генотипом и фенотипо м дает потомство с предсказуемыми призанаками . 1.1.6. Анализ экспрес сии чужеродных г енов в трансформированных растениях Для качественного и количественного анали за экспрессии чужеродных генов в растениях используют множество методов , включая Нозери-ан ализ РНК [Nagy et al., 1988] и Вестери-анализ продуктов трансдукции [Burnette, 1981] . К р оме того , изучают фенотипические признак и такие как , устойчивость к антибиотикам и гербицидам . Для анализа экспрессии таких репортерных генов , как cat, npt II, гены октопин - и -------- разработа ны чувствительные методы [Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982] . Такого рода анализ может иметь большо е значение , поскольку можно комбинировать код ирующие последовательности репортерных генов с подходящими регуляторными последовательностями рас тительных генов , либо создавать двойные гены , экспрессирующие ся с одного и того же промотора . Активность гена и промотора можно таким образом определить либо с помощью ферментативного анализа , либо гибридизаци ей растительной РНК с зондами , комплементарны ми репортерному гену. Перечисленные выше разнообразные методики можно успешно применять для анализа экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях , в частности , генов устойчивости к гербицидам , насекомым , облучению , антибиотикам и др. 1.2. Использов ание метода генетической инженерии для трансформации однодольны х растений 1.2.1. Краткие характеристики ряски Семейство рясковые , Lemnaceae включает 6 ро дов и 30 видов , встречающихся на всех контин ентах . Наиболее широко они распространены в Северной и Южной Америке , Африке , Австралии . Представители семейства рясковые являются самыми маленькими в мире цветковыми раст ениями , венчики которых редко превышают 1 см . В результате гидрофильной эволюции они дос тигли крайней степени редукции всех своих органов , поэтому и по простоте строения занимают первое место среди цветковы х . Рясковые – водные , свободноплавающие , бол ьшей частью многолетние травянистые растения . По своей природе рясковые являются неотениче скими формами произошедшими от предков соврем енного водоплавающего рода Пистия из семейства Ароидных . Рясковые служат корм ом для диких и домашних уток , а так же других водоплавающих и болотных птиц , для рыб , особенно карпа , и ондатры . В сель ском хозяйстве их используют в свежем и сушеном виде как ценный белковый корм для свиней и домашней птицы . Применяются р ясковые и для оч и стки воды , та к как извлекают из нее и запасают в своих листьях азот , фосфор , калий , а так же поглощиют углекислый газ и обогащают воду кислородом . Употребляются и человеком . За последние 50 лет рясковые рассматриваютс я , как чрезвычайно ценный эксперимента льн ый объект для морфогенетических , физиологических и биохимических исследований благодаря непри хотливости к среде , малым размерам , быстрому росту , что позволяет использовать всего оди н генетический клон на протяжении всего э ксперимента. 1.3. Сигнальные м олекулы , их способность индуцировать проц ессинг тДНК Экспрессию генов vir-области индуцируют специфические сигн альные молекулы посредством позитивной регуляции системы в состав которой входят гены virA и virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 19 86] . Активаторами транскрипции vir-генов являются низкомолекулярные моноциклические фенольные соедин ения , синтезируемые в механически поврежденных тканях растений [Stuchel, 1985] . Примерами таких соединений явл яются ----------- и довольно широкий круг прои зводных ------- биосинтетического пути метаболитов защ итной природы или предшественников лигнина. Сигнальные молекулы были впервые обнаруже ны в экссудатах корней и листьев двудольн ого растения Nicotiano tabacum , они были идентифицированы как ----- и ------ -. Эти соединения синтезировали метаболи чески активные поврежденные ткани растений . В настоящее время установлена сигнальная индуц ирующая активность у большой группы ------- соедине ний растительной природы . Механическое повреждени е тканей растений приводи т к ус илению синтеза таких сигнальных соединений . И звестно , что ------------ и коричная кислоты , проявляющи е сигнальную активность , обладают так же а нтимикробными свойствами и являются промежуточны ми метаболитами на пути синтеза -------. ---------- распозн а ются специфическими рецепторами агро бактерий , являющимися трансмембранными хеморецептргым и белками с различной ------- к таким молекулам [Leroux, 1987] . Дл я оптимальной индукции экспрессии генов vir требуется пр исутствие в эксцудатах растений различных угл еводов : глюкозы , глюкуроновой кислоты , гала ктозы , галактуроновой кислоты , арабинозы , маннозы , фукозы , целлобиозы и ксилозы , представляющих компоненты клеточной стенки растений . Такие углеводы связываются с периплазматическим до меном рецептора в виде предв а рите льно обработанного комплекса с белком-продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причем конечный результат и ндукции процессинга тДНК зависит от синергиче ской активности сигнальных соединений и сахар ов эксцудатов растений. Структурная формула : Поз итивная регуляторная система vir A – vir G , контролирующая экспрессию г енов vir ----- , работает следующим образом . Экспрессируемый конст итутивно ген vir A выполняет функцию рецепции сигнальны х молекул растений и трансмиссии этого си гнала в бактериальную кл етку . Этот мем бранный хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена vir G , который в свою очередь выступает в качетве позитивно го регулятора собственной транскрипции и тран скрипции остальных генов vir ----- . Механизмы активации с леду ющие. Белок vir A , дважды пронизывающий мембрану бактерии , при появлении сигнальных молекул автофосфорили руется --------- на своем С-конце , переходя в акти вную форму . (В отсутствии индукции С-терминальн ый домен белки vir A взаимодействуют с W -терминальным доме ном , ингибируя киназную активность ). Активированный белок vir A в свою очередь --------- в нутренний клеточный белок – трансдуктор сигн ала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al., 1990] . Фосфорилированный бело к vir G связыв ается с промоторами остал ьных генов р егулона и со своим собственным , выступая в качестве транскрипционного активатора . Индукция vir генов обратимая , и каскад реакций может быть прерван , что очень важно для патогена : в случае , если хозяин больной и нежизнеспособ ный организм , перено с тДНК в его к летки не осуществляется [Hess et al., 1991] . Кроме позитивной регуляторной системы vir A – vir G , ло кализованной на Ti-плазмиде , в регуляции экспрес сии vir- гено в принимают участие также хромосомные гены . Об этом свидетельствует обнаружение сп онтанного хромосомного мутанта ros , у которого гены vir C и vir D – оперонов экспрессируются в отсутствие сигнальных моле кул растений. 3. Материалы и методы 2.1. Материалы 2.1.1. Оборудование Копалка , термомиксер 5436, центрифуга "Эппиндорф ", прибор для горизонтального электрофореза , источник питан ия 2197, термостат ТС– 80 Мг . 2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды Штамм : Escherichia coli HB 101 Agrobacterium tumefaciens C58C1 Плазмиды : р GV3850 тДНК : р BR322 маркер Ар , Тс 2.1.3. Р астения В качестве объектов исследования ис пользовали двух– , трехмесячное однодольное расте ние ряски крошечной ( Lemna perpusilla ). Растения выращивали в теплице в вегет ационных сосудах при температуре 18 – 25 0 С и 12 часовом светово м периоде . Относительную влажность воздуха в теплице поддерживали в пределах 65 – 70%. Для анализа брали стерильные ткани листье в . Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5 – 10 минут , а затем материал 3 раза промывали стерильной водой и использова ли в экспериментах по индукции vir – генов Ti – плазмид . Для сравнения были взяты двудольные растен ия табака красного и льна долгунца. 2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений В работе использовали среды : 1. Для микр оорганизмов – LB (Лурия– Бертани ) NaCl Дрожжевой экстракт Бантотри птон 10 мг /л 5 г /л 5 г /л рН 7,5 Температура 24 0 С Длина светового дня 16 часов На чашку Петри : LB штамм 10 мл 1 мл 2. Для культивирова ния растений – среда MS ( Мурасиге– Скуча ) приведена в таблице. 2.1.5. Другие растворы Фосфатный буфер ТЕ буфер (10 м МТрис– HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА ) Саркозилат Na Проназы – 1,5 мг /мл Фенол Хлороформ Агарозные гели Фитогормоны : БАП (6 – бензиламинопурин ) растворяли в растворе 0,1 – NaOH H УК (2 – нафтилуксусная кисло та ) растворяли в этаноле и разводили водой до 10 мг /мл . Стери лизовали фильтрование м через фильтры В 485. Ацетосирингон растворяли в 70% спирте (этано ле ) в концентрации 10 мг /мл . Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ. 2.1.6. Ферменты , используемые в генной инженерии Гидролиз ДНК проводили рестрикцион ными эндонуклеаза ми : Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI. 2.1.7. Антибиотики Ампицилин 50, Н 2 О 50. Для селекции бактерий с определенными плазмидами . 2.2. Методы 2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений Ночную культуру A. tu mefaciens С 58С 1 ( pGV3850), выращенную на ротационном шейкере (20 циклов /мин ) при 29 0 С в жидкой среде LB, собирали центрифугированием и суспензиров али в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН 5,5) до кислотности А 600 – 0,05. После 5 часов роста в бактериаль ну ю культуру добавляли мелконарезанные стерильные ткани растений (листья , стебли ) в количест ве 2 г на 10 мл среды и продолжали инкуба цию в течение 48 часов . В качетве положительного контроля использ овали агробактериальную культуру с добавлением в качестве индуктора 100 мкМ ацетосирингона . В качестве отрицательного контроля использо вали агробактериальные клетки , выращенные на среде без ацетосирингона и эксцудатов растени й. Эффективность индукции процессинга тДНК ц ерез 48 часов инкубации агробактерий с тканя ми растений . Титр жизнеспособных бактерий после инкубации с эксцудатами растений п роверяли путем их высева в различных разв едениях на чашки Петри с агаризованной ср едой LB . Каждый вариант опытов проводили в трех повторностях. 2.2.2. Выделение тотальной ДН К Agrobacterium tumefaciens ДНК выделяли по модифицированн ому методу Draper с соавт.Через 48 ча сов совместного культивирования агробактерий с тканями растений из пробирок удаляли расти тельную ткань , бактерии собирали , центруфугировали при 9000 g . Осадок , полученый из 10 мл инкубаци онной среды лизировали в течение 45 мин при 37 0 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трис HCl ( pH 8,0), 1 мМ ЭДТА ), содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг /мл проназы . Лизат дважды экстрагировали фенолом и дважды хлороформом . ДНК осаждал и спиртом и растворяли в ТЕ– буфере. 2.2.3. Бло д-гибридизация тДНК по Саузерну В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия в пробах pBR 322 татальную ДНК агробактерий в коли честве 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного геля и п роводили электрофорез при 25 – 100 В в течение 2 часов в буфере , содержащ ем : 40 мМ трис– ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА и 5 м кг /мл бромистого этидия . В качестве маркер ов молекулярного веса использовали ДНК фага , гидр олизованную рес триктазной эндонуклеазой Hind III . Блод– гибридизац ию проводили на – – – – – фильтрах . В кач естве зонда использвали ДНК плазмиды pBR 322 , меченную 32 – – с помощью ДНК– пол имеразной системы. 2.2.4. Тра нсформация клеток Esherichia coli Штаммы E . с oli HB 101 выращи вали в жидкой среде LB при 37 0 С до концентрации 5*10 7 клеток /мл (А 600 = 0,45). Для количественного изучения процессинга тДНК использовали комплем ентарные клетки бесплазмидного штамма E . с oli HB 101 , которые трансформировали тотальной ДНК агробактерий , кото рая была выделена (М -2), претерпевших различную переработку . Трансформан ты каждого варианта высевали на три чашки Петри с агаризированной средой LB , содержащей ампицилин (50 мкг /мл ). Количест во колоний подсчитывали . В контрольных экспер иментах клетки транс формировали плазмидой pBR 322, и другой контроль не был подвергнут трансф ормации и колоний обнаружено не было. 3. результаты Для об наружения процессинга агробактериальной тДНК , инд уцированного экссудатами анализированных растений , в работе применяли метод "спасения пл азмиды ", предложенный Koukolikova - Nikola с соавт . Этот метод основан на использовании модифицированно й Ti - плазмиды pGV 385 [11] , содержащей м ежду правой и левой границами значительно делетированной исходной тДНК бактериальной пла змиды вектор pB R 322. Таким образом , индуцирование процессинга тДНК в модифицирован ной Ti - плазмиде pGV 3850 можно прослеж ивать по вырезанию из нее низкомолекулярного фрагмента ДНК , в состав которого входит плазмида pBR 322. Этот процесс мо жно тестировать различными методами . Один из них – это трансформация клеток E . с oli тотальной агробактериальной ДНК и отбор трансформантов по селективным маркерным признакам плазмиды pBR 322 – устойчивой к антибиотикам . Другим методом может быть блод-гибридизация – анализ тДНК с помощью плаз миды pBR 322 в качестве гибридизационного зонда . Оба этих метода были использованы в настоящей работе . Сравнили эффективность индукции процессинга экссудатами различных расте ний проведено по отношению к активности 100 мкМ ацетосирингона . Известно , что это т оксифенольное соединение , выделяемое некоторы ми двудольными растениями , принадлежит к сигн альным молекулам , индуцирующим вырезание и пе ренос агробактериальной тДНК. Результаты трансформации клеток E . с oli НВ 101 тДНК подвергнутых воздействию экссудатов лист ьев различных растений представлены в таблице. Таблица 3.1. Факторы индукции Количество трансформированных E. Coli L. perpusilla ( ряска ) L. perpusilla ( ряска ) Ацетосирингон (контроль ) Лен долгунец Nicotiana tabacum ( табак ) Без ацетосирингона и трансформац ии 25 колоний 30 колоний 35 колоний 40 колоний 30 колоний – Экссудаты листьев ряски индуцировали вырезание тДНК , что является доказательством присутствия в их составе сигнальных соединений , специфических для индукции транскрипции генов vir агробактериа ль ной Ti -плазмиды. Прямой блод-гибридизационный анализ тДНК агробактерий свидетельствует о присутствии у ряски сигнальных молекул , индуцирующих образовани е тДНК [12]. 4. обсужде ние Использова нный подход позволяет регистрировать присутствие сигнальных молек ул в экссудатах разл ичных тканей растений по одному из важней ших результатов индукции генов области vir , а именно по вырезанию тДНК из агробактериальной Ti - плазмиды . В настоящей работе мы примен или два метода детекции процессинга тДНК модифицированной агро бактериальной Ti -плазмиды . PGV 3850 [11] . Полученные результаты позволяют расширить список однодольных растений (на одно растен ие ), синтезирующих сигнальные молекулы , индуцирующи е процессинг агробактериальной тДНК . Примененный метод "спасения плазмиды " позв оляет в ыявлять появление циклических форм модифицирован ной тДНК pBR 322 и ее линейных форм [20] . Рассмотренный в работе метод позволяет учитывать присутствие в экссудатах растений веществ с бактериостатической активностью . Веще ства такой природы могут сущес твенно влиять на эффективность трансформации растений агробактериями. Мы не анализировали химическую природу сигнальных молекул ряски . Не исключено , что сигнальные молекулы могут отличаться от сигнальных фенольных соединений двудольных расте ний . Специфичес кий процесс взаимодействия между агробактериями и покрытосеменными растения ми существовал , по-видимому , еще до их диве ргенции на двудольные и однодольные [15] . Штаммы агробактерий обладают многими особ енностями и именно рецепторы (продукты гена vir A ) , раз личающиеся по способности узнавать сигнальные молекулы различной природы. Следует отметить , что растительные вещест ва с сигнальной функцией для агробактерий не является уникальным примером существования соединений , выполняющих эту важную роль в о взаимодейс твии микроорганизмов с растен ями [22]. Молекулярные сигналы растений играют важн ую роль в установлении паразитических и с имбиотических взаимоотношений между бактериями и растениями , определяя при этом круг расте ний для определенного микроорганизма . Всестор онние структурно-функциональные исследования специфических молекулярных сигналов во взаимодей ствии между микроорганизмами и растениями дол жны ответить на многочисленные вопросы о молекулярно-генетических механизмах этих взаимоотноше ний и способствовать ра з витию эфф ективных методов генетической инженерии важнейши х сельскохозяйственных и экологически-индикаторных культурах растений (как ряска ). Список литературы 1. 2. 3. 4. 5 6. 7. 8. 9. 10. Анализ генома . Методы . Под ред . Н . Дейвиса . – М .: Мир , 1990. – 247 с. Великов В.А ., Бурьянов Я.И . Образование делеционных производных Ti - плазмиды pGV 3850 при конъюгационно м переносе из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli . // Ген етика .1998. № 8. т . 34. с . 1056-1062. Великов В.А ., Бурьянов Я.И . Изучени е конъюгационного транспорта Ti - плазмиды pGV 3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli . // Тезисы докладов III Пущинской кон ференции молодых ученых . Пущино , 27-30 апреля 1998 г , с . 49. Генная инженерия растений . Ла бораторное руководство . – М .: Ми р , 1991. – 408 с. Клонирование ДНК . Методы . Под ред . Д . Гловера . – М .: М ир , 1988. – 538 с. Малиатис Т ., Фрич Э ., Сэмбрук Дж . Молекулярное клонирование . Методы генетической инженерии. – М .:Мир , 1984. – 463 с . Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Под ред . А.И . ----. – Новосибирск : Наука , 1990. – 248 с. Мобильность генома растений. Под ред . Б . Хол и Е.С . Делинс . – М .: Агропромиздат , 1990. – 272 с. Плазмиды . Методы. Под ред . Д . Хорда . – М .: Агропром издат , 1990. – 272 с. Пехов А.П . Основы плазми доло гии .- М .: 1996. – 231 с. Сельскохозяйственная биотехнология . Векторные системы молекулярного клонирования. Под ред . Р.Л . Подреперс и Д.Т . Денхардт . – М .: Агропромиздат , 1991. – 535 с . Солова Г.К ., Кривопалов Ю.В ., Великов В.А ., Чумаков М.И . Прикрепление A grobacterium к корням пшеницы. // Микробиология . 1995. т . 64. № 4, с . 526-530. Захарченко Н.С ., Комиви М.А ., Бурьянов Я.И . Индуцирование процессинга тДНК. // Физиология растений . 1999. т . 46. № 2, - с . 282-291. Baker R.F., Idler I.B. and al. Nucleotide sequ ence of the tDNA region from Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi / 5955. Plant Mol. Biol., 1983, V.2, pp. 335-350. Douglas C.J and al. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence rigion. J. Bacteriol., 198 5, v. 161, pp. 850-860. Holster S.M., Villaroel and al. An analisys of the boundaries of the octopine TL – DNA intumors induced by Agrobacterium tumefacies. Mol. Gen. Genet., 1983, v. 190, pp. 35-38. Howord E.A., Zupan J.R. and al. The vir Dr protein of A. Tumefaciens contaen sal-terminal bipartite nuclear localization sygnal: implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v. 68, pp. 109-119. Janssens A., Engler., Zambryski P. The nopaline c58 tDNA region is teansribed in Agrobacterium tu mefaciens., Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, pp. 341-350. Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., virulence in Agrobacterium tumefaciens. Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol., 1987. № 4. pp. 167-170. Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organizat ion of the vir regulon of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., v. 5, pp. 1145-1454. Zambryski P., Joos N., Genetello G., Leemans. Ti plasmid veefof for the introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regener ation Capacity. EMBO J., 1983. v. 2, pp. 2143-2150.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Тракторист Вася сел в новенький "Бентли" и умер от комфорта.
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, курсовая по биологии "Регистрация сигнальных молекул", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru