Реферат: Можно ли считать вирусы живыми? - текст реферата. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Реферат

Можно ли считать вирусы живыми?

Банк рефератов / Медицина и здоровье

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Реферат
Язык реферата: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Microsoft Word, 646 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникального реферата

Узнайте стоимость написания уникальной работы

Можно ли считать вирусы живыми? Согласно Львову, «организм — некая незав исимая единица интегрированных и взаимосвязанных структур и функций» . У простейших, то есть у одноклеточных именно клетка является независимо й единицей, иными словами, организмом. И клеточные организмы — митохонд рии, хромосомы и хлоропласты — это не организмы, ибо они не являются неза висимыми. Получается, что если следовать определению, данным Львовым, ви русы не являются организмами, так как не обладают независимостью: для вы ращивания и репликации генетического материала нужна живая клетка. В то же время, у многоклеточных видов независимо от того, животные или рас тения, отдельные линии клеток не могут эволюционировать независимо дру г от друга; следовательно, их клетки не являются организмами. Для того что бы изменение было эволюционно значимым, оно должно быть передано новому поколению индивидуумов. В соответствии с этим рассуждением организм пр едставляет собой элементарную единицу некоторого непрерывного ряда со своей индивидуальной эволюционной историей. Вирус обретает относительно независимую эволюционную историю благода ря его способности к адаптации в направлении, ведущим к приобретению им способности передаваться от хозяина к хозяину. Он может пережить клетку или организм, в которых паразитирует; фактически вирус часто «эксплуати рует» клетку. Один вирус может встречаться в разных видах, родах и типах и также один и тот же вирус может передаваться от растений насекомым и раз множаться в клетках тех и других. Вирус, обладающий соответствующей прис пособляемостью, может использовать разнообразные эволюционные ниши. Т аким образом, вирус, конечно, обладает большей независимостью, чем любая клеточная органелла. То есть, в эволюционном плане вирус в большей степе ни организм, чем хромосома или даже клетка многоклеточного животного, хо тя функционально он значительно менее независим, чем любая такая клетка . И в то же время, можно рассматривать данную проблему с точки зрения друго го определения: материал является живым если, будучи изолированным, он с охраняет свою специфическую конфигурацию так, что эта конфигурация мож ет быть реинтегрирована, то есть вновь включена в цикл, в котором участву ет генетическое вещество: это отождествляет жизнь с наличием независим ого специфического самореплицирующегося способа организации. Специфи ческая последовательность оснований нуклеиновой кислоты того или иног о гена может копироваться; ген — это некая часть запасов информации, кот орой располагает живой организм. В качестве теста на живое данное выше о пределение предлагает воспроизведение в различных клеточных линиях и в ряде поколей организмов. Вирус, согласно этому тесту, живой точно так же , как и любой другой фрагмент генетического материала, что его можно извл ечь из клетки, вновь ввести в живую клетку и что при этом он будет копирова ться в ней и станет хотя бы на некоторое время часть ее наследственного а ппарата. При этом передача вирусного генома составляет основной смысл с уществования этих форм — результат их специализации в процессе отбора. Поэтому специализированность вирусов как переносчиков нуклеиновых ки слот дает возможность считать вирусы «более живыми» , чем какие либо фра гменты генетического материала, и «более организмами» , чем любые клеточ ные органеллы, включая хромосомы и гены. Строгие постулаты Коха Каковы же те основные положения, сформулирован ные Робертом Кохом (1843-1910) , которых должен придерживаться микробиолог при к аждом обнаружении неизвестного возбудителя? Что может служить доказат ельством, что именно он является причиной данного инфекционного заболе вания? Вот эти три критерия: Неоднократное получение чистой культуры воз будителя, взятого из организма больного. Возникновение точно такого же или сходного заболевания (как по характер у течения, так и по вызываемым им патологическим изменениям) при инфицир овании здорового организма культурой предполагаемого возбудителя. Появление в организме человека или животного после их заражения данным возбудителем всегда одних и тех же специфических защитных веществ. При к онтакте иммунной сыворотки крови с возбудителем из культуры последний должен терять свои патогенные свойства. Для современной вирусологии характерно бурное развитие и широкое прим енение самых различных методик — как биологических (включая генетичес кие) , так и физико-химических. Они используются при установлении новых, до сих пор еще неизвестных вирусов, и при изучении биологических свойств и строения уже обнаруженных видов. Фундаментальные теоретические исследования дают обычно важные сведен ия, которые используются в медицине, в области диагностики или при глубо ком анализе процессов вирусной инфекции. Введение новых действенных ме тодов вирусологии связано, как правило, с выдающимися открытиями. Так например, метод выращивания вирусов в развивающемся курином эмбрио не, впервые примененный А. М. Вудрофом и Е. Дж. Гудпэсчуром в 1931 году, был с иск лючительным успехом использован при изучении вируса гриппа. Прогресс физико-химических методов, в частности метода центрифугирова ния, привел в 1935 году к возможности кристалмуации вируса табачной мозаики (ВТМ) из сока больных растений, а в последствии и к установлению входящих в его состав белков. Этим был дан первый толчок к изучению строения и биох имии вирусов. В 1939 году А. В. Арден и Г. Руска впервые применили для изучения вирусов элект ронный микроскоп. Введение этого аппарата в практику означало историче ский перелом в вирусологических исследованиях, поскольку появилась во зможность увидеть — хотя в те годы еще и недостаточно четко — отдельны е частицы вируса, вирионы. В 1941 году Г. Херст установил, что вирус гриппа при известных условиях вызыв ает агглютинацию (склеивание и выпадение в осадок) красных кровяных теле ц (эритроцитов) . Этим была положена основа для изучения взаимоотношений между поверхностными структурами вируса и эритроцитов, а также для разр аботки одного из наиболее эффективных методов диагностики. Коренной перелом и вирусологических исследованиях произошел в 1949 г., когд а Дж. Эндерсу, Т. Уэллеру и Ф. Роббинсу удалось размножить вирус полиомиели та в клетках кожи и мышц человеческого зародыша. Они добились разрастани я кусочков ткани на искусственной питательной среде. Клеточные (тканевы е) культуры были инфицированы вирусом полиомиелита, который до этого изу чали исключительно на обезьянах и лишь очень редко на особом виде крыс. Вирус в человеческих клетках, выращенных вне материнского организма, хо рошо размножался и вызывал характерные патологические изменения. Мето д культуры клеток (длительное сохранение и выращивание в искусственных питательных средах клеток, выделенных из организма человека и животных) был впоследствии усовершенствован и упрощен многими исследователями и стал, наконец, одним из наиболее важных и результативных для культивиро вания вирусов. Благодаря этому более доступному и дешевому методу появи лась возможность получать вирусы в относительно чистом виде, чего нельз я было достичь в суспензиях из органов погибших животных. Введение новог о метода означало несомненный прогресс не только в диагностике вирусны х заболеваний, но и в получении прививочных вакцин. Он дал также неплохие результаты и в биологических и биохимических исследованиях вирусов. В 1956 году удалось показать, что носителем инфекционности вируса является содержащаяся в нем нуклеиновая кислота. А в 1957 году А. Айзекс и Дж. Линдеман открыли интерферон, который позволил объяснить многие биологические я вления, наблюдаемые в отношениях между вирусом и клеткой — хозяином или организмом — хозяином. С. Бреннер и Д. Хорн ввели в технику электронной микроскопии метод негати вного контрастного окрашивания, сделавший возможным изучение тонкого строения вирусов, в частности их структурных элементов (субъединиц) . В 1964 году уже упоминавшийся нами ранее американский вирусолог Гайдузек с сотрудниками доказал инфекционный характер ряда хронических заболева ний центральной нервной системы человека и животных. Он изучал недавно о бнаруженные своеобразные вирусы, лишь в некоторых чертах схожие с ранее известными. В то же время американский генетик Барух Бламберг обнаруживает (в процес се генетических исследований белков крови) антиген сывороточного гепа тита (австралийский антиген) , вещество, идентифицируемое при помощи сер ологических тестов. Этому антигену суждено было сыграть большую роль в в ирусологических исследованиях гепатита. В последние годы одним из крупнейших успехов вирусологии можно считать раскрытие некоторых молекулярно-биологических механизмов превращени я нормальных клеток в опухолевые. Не меньшие успехи были достигнуты и в о бласти изучения строения вирусов и их генетики. Инфекционная единица Наименьшее количество вируса, способное в данном опыте вызвать инфекцию, называется инфекционной единицей. Для ее определения применяются обычно два метода. Первый основан на опре делении 50 %-ной летальной дозы, которая обозначается LD 50 (от лат. Letatis — смертел ьная, dosis — доза) . Второй метод устанавливает число инфекционных единиц по числу бляшек, образовавшихся в культуре клеток. Что, в сущности, представляет собой величина LD 50 и как она определяется? Исс ледуемый вирусный материал разводится в соответствии со снижающимися степенями концентрации, скажем кратными десяти: 1: 10; 1: 100; 1: 1000 и т.д. Каждым из ра створов с указанными концентрациями вируса инфицируют группу животных (десять индивидуумов) или культуру клеток в пробирках. Потом наблюдают г ибель животных или изменения, происшедшие в культуре под влиянием вирус а. Статистическим методом определяется степень концентрации, способна я умертвить 50 % животных из числа зараженных исходным материалом. При испо льзовании культуры клеток следует найти такую дозу вируса, которая прои зводит губительное действие на 50 % инфицированных ею культур. В этом случа е употребляется сокращение ЦПД 50 (цитопатическая доза) . Иначе говоря, реч ь идет о такой дозе вируса, которая вызывает повреждение или гибель поло вины инфицированных ею культур. Методом бляшек нельзя получить статистические данные, но можно установ ить фактическое число единиц вируса в материале, дающем бляшки в культур е клеток. В идеальном случае такая единица отвечает одной функционально полноценной частице. Титрование Индуцируемая вирусом реакция может происходить по типу «вс е или ничего» (то есть наличие или отсутствие инфекции) , а может быть выра жена количественно, например продолжительностью времени, необходимого проявления инфекции, или числом поражений в слое чувствительных клеток . Количественное определение вирусной активности называется титровани ем. Титр исходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных ед иниц, приходящихся на единицу объема. Инфекционные нуклеиновые кислоты, независимо от того выделены ли они из фагов или из вирусов животных или р астений, как правило, обладают значительно меньшим инфекционным титром, чем исходный вирус (то есть отношение числа содержащихся в препарате мол екул нуклеиновой кислоты к числу инфекционных единиц значительно боль ше, чем соответствующие величины для вирионов, из которых эти нуклеиновы е кислоты были выделены) . Однако и при титровании свободной нуклеиновой кислоты и при титровании вирионов вероятность нахождения в пробе средн его числа частиц выражается одной формулой. Отсюда следует, что вирусную инфекцию может вызвать также и одна молекула вирусной нуклеиновой кисл оты. Как правило, инфекционными являются только интактные вирусные ДНК и РНК. Исключение наблюдается при множественном заражении клеток молеку лами нуклеиновой кислоты, содержащими неполным геном вируса. Резюмируя сказанное, можно прийти к выводу, что титр вирусной суспензии, выраженный числом инфекционных единиц, содержащихся в единице объема, к ак правило, соответствует числу вирионов (или числу молекул вирусной нук леиновой кислоты) , способных при условиях данного опыта вызвать инфекци ю. Утрата инфекционности Как правило, чувствительность вирионов данного вируса к действию тех или иных инактивирующих веществ определяется спе цифическими свойствами его белков, вследствие чего методы инактивации инфекционности, разработанные для данного конкретного вируса, эффекти вны лишь в отношении близкородственных ему вирусов. Исключение составл яет чувствительность вирусов к рентгеновским лучам, которая зависит от типа нуклеиновой кислоты вирионов и ее количества. В основе этой законом ерности лежит тот факт, что действие рентгеновских лучей приводит к разр ыву молекул нуклеиновой кислоты, и даже одного такого разрыва часто быва ет достаточно для утраты инфекционного вируса. Результаты эксперимент ов показывают, что мелкие вирусы инактивируются рентгеновскими лучами значительно эффективнее, так как для них характерна большая величина от ношения содержания в вирионе нуклеиновой кислоты к содержанию в нем бел ка, чем для крупных вирионов, более богатых белком. Серологические методы В целях определения вида данного вируса при изу чении защитных процессов в организме больного человека или зараженног о животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum — сы воротка, жидкая составная часть крови) — это раздел иммунологии, изучаю щий реакции антигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие ви руса. Они связываются с определенными антигенными веществами, находящи мися на поверхности вирусных частиц. В результате связывания молекул ан тител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патоген ные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке и ли определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации в ируса. Ее можно проводить как на животных, так и на культуре клеток. Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить цитопатическо е действие, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концент рация может быть выявлена и с помощью метода бляшек. Для обнаружения антител используется метод торможения гемагглютинаци и (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания ко мплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследов ательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусоло гический материал подготавливается для физических и химических анализ ов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти а нализы требуют большого количества совершенно чистого вируса. Очистка вируса — процесс, при котором из суспензии с вирусом устраняются все по сторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и «обломки» к леток — хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение сус пензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материа л для многих исследований. Из отдельных методов очистки упомянем лишь наиболее эффективный — мет од ультрацентрифугирования, который дает препараты вируса очень высок ой концентрации. Опишем вкратце процедуру получения и очистки вирусной суспензии. Проце сс этот начинается с искусственного введения вируса в мозг подопытного животного. По прошествии нескольких дней вирус размножится в ткани мозг а. При этом обнаружатся характерные нарушения функций нервной системы « хозяина» , и у животного выявятся признаки заболевания. Когда симптомы д остигнут наибольшего развития, зверька умерщвляют, а его мозг, в тканях к оторого содержатся большие количества вируса, извлекают в стерильных у словиях из черепа животного. Затем из мозга готовится, скажем, 10 %-ная суспе нзия. Кроме вирионов она содержит еще и большое количество кусочков нерв ной ткани, остатки кровеносных сосудов, кровяные тельца и другие биологи ческие компоненты. Кусочки ткани и другие крупные частицы устраняются п ервым центрифугированием со скоростью 5000-10000 оборотов в минуту. Оно продол жается около получаса. Жидкость над осадком (суперкатакт) осторожно слив ают в специальные пробирки для центрифугирования, сделанные из пластма ссы или нержавеющей стали, поскольку стекло не выдерживает давление, кот орое развивается при высокоскоростном центрифугировании. А осадок обе звреживают дезинфицирующими средствами. Слитый «супернатант» обрабат ывается затем уже в ультрацентрифуге. Для седиментации мельчайших вирусов необходимо многочасовое ультраце нтрифугирование, причем полученный осадок часто бывает не больше булав очной головки. Но и после такой обработки мы имеем не совсем чистый вирус ный материал, в нем еще содержатся чужеродные примеси. Для тонких анализ ов этот осадок надо несколько раз обработать различными реактивами и по вторить ультрацентрифугирование. Только тогда можно получить концентр ированную суспензию вируса высокой чистоты, которая требуется для точн ых и достоверных биохимических, кристаллографических анализов или для наблюдений в электронно-оптических приборах. В распоряжении вирусологов вообще много различных технических приспос облений, как, например, центрифугирование по градиентам концентрации, ко гда вирионы разделяются по степеням концентрации или по форме. Другой пр ибор, представляющий в наше время стандартное оборудование почти каждо й научно-исследовательской вирусологической лаборатории — электронн ый микроскоп. Это дорогостоящий, большой и сложный аппарат. Для получения изображения вирусов существует много различных методов, и все они прошли свои этапы развития. Чтобы обнаружить вирионы в клетках, в настоящее время пользуются методом ультратонких срезов Фиксированны й материал, залитый эпоксидной смолой, разрезается тончайшим стеклянны м или алмазным ножом. При помощи точных ультрамикротомов одну клетку мож но разрезать более чем на тысячу тонких срезов. Полученные таким образом срезы обрабатываются затем специальными химикалиями, что обеспечивае т лучшую их видимость. Для наблюдения тонкого строения отдельных вирионов применяется метод негативного контрастирования (окрашивания) , внедрение которого значит ельно повысило качественный уровень электронного микроскопирования. В ирусные частицы при этом осторожно смешиваются с раствором фосфовольф рамовой кислоты, дающей осадок, не пропускающий электронные лучи. В резу льтате вирионы предстают в виде своих совершенно точных отпечатков, по к оторым можно изучать самые тонкие детали их поверхностей. При методе поз итивного окрашивания (или «металлизирования» препарата) применяются т акие вещества, которые способны выборочно прилипать к поверхности вири онов (например, специфические антитела, меченные ферритином, содержащим в своей молекуле железо и потому хорошо различимые в электронном микрос копе) . Общие методы изучения вирусов О присутствии вируса в организме как при спонтанном заболевании, так и при экспериментальном заражении хозяина судят по появлению тех или иных патологических симптомов. Всякий раз, ко гда возникает подозрение о присутствии вируса в изучаемом объекте, прих одится подбирать определенный комплекс условий — подходящий организм и соответствующий способ заражения, — при котором вирус вызывает в зар аженном организме распознаваемые изменения. Так что вирусологам прихо дится затрачивать большие усилия на разработку методов получения эксп ериментальных инфекций. Как известно, для доказательства того, что данное заболевание действите льно вызывается определенным микроорганизмом, необходимо выполнить та к называемые постулаты Коха: 1) показать, что данный микроорганизм регуля рно обнаруживается в больном организме; 2) получить культуру этого микро организма на искусственной питательной среде; 3) воспроизвести данное за болевание заражением экспериментального животного выделенной культу рой и, наконец, ;4) повторно выделить данный микроорганизм, но теперь уже из организма искусственно зараженного хозяина. Те же постулаты mutatis mutandis справ едливы и для диагностики вирусных заболеваний. В этом случае, согласно Р иверсу, постулаты формируются следующим образом: 1) выделение вируса из о рганизма больного, 2) культивирование вируса в организме или в клетках эк спериментального животного, 3) доказательство фильтруемости инфекцион ного агента (чтобы исключить патогенные агенты большего размера, наприм ер бактерии) , 4) воспроизведение подобного заболевания у другого предста вителя данного или родственного вида и, наконец, 5) повторное выделение то го же вируса. Культивирование и идентификация вирусов — основные вирусологические методы, используемые в практической вирусологии при диагностике вирус ных заболеваний. Материал, в котором подозревается наличие вируса, напри мер лизат бактерий, кусочек ткани или биологическая жидкость, при необхо димости измельчают или гомогенезируют с тем, чтобы при контролируемых у словиях перевести его в суспензированное состояние. Большие фрагменты клеток, а также возможные загрязняющие материал микр оорганизмы удаляют при помощи центрифугирования и фильтрования. Такую очищенную суспензию вводят подходящему хозяину, либо добавляют к суспе нзии клеток, либо наносят на монослой соответствующих клеток. В результа те в слое чувствительных клеток, таких, как бактерии, растущие в чашке с аг аром, или клетки животных, растущие на поверхности стекла, могут появить ся локальные поражения, так называемые бляшки, которые характерны для да нного вируса.. Бляшки образуются в результате заражения расположенных в данной области клеток, размножения в них вируса и их полного или частичн ого лизиса. Если размножение вируса не ведет к образованию визуально выя вляемых дискретных бляшек, вирус может быть обнаружен и охарактеризова н по изменениям, вызываемым им в культуре клеток, или по повреждению слоя клеток либо при помощи других тестов. Если исследуемый материал не наносят на слой культивируемых клеток, а вв одят в организм хозяина, то цель эксперимента — выявление общих реакций организма, свидетельствующих о развитии инфекции: появление симптомов заболевания, гибель животного или какие-либо иные специфические реакци и, например образование антител. Наконец, если ни заражение культуры клеток, ни введение материала в орга низм хозяина не ведут к появлению каких-либо симптомов вирусной инфекци и, вирусологи прибегают к так называемым «слепым пассажам» , т.е. к повторн ым переносам исследуемого материала, что часто приводит к повышению вир улентности вируса или к увеличению его титра. Общий химический состав вирусов Непременным компонентом вирусной час тицы является какая-либо одна из двух нуклеиновых кислот, белок и зольны е элементы. Эти три компонента являются общими для всех без исключения в ирусов, тогда как остальные двалипоиды и углеводы — входят в состав дал еко не всех вирусов. Вирусы, состоящие только из белка нуклеиновой кислоты и зольных элемент ов, чаще всего принадлежат к группе простых, так называемых минимальных, вирусов, лишенных дифференциации, собственных ферментов или каких-либо специализированных структур. К такого рода вирусам принадлежат вирусы растений, некоторые вирусы животных и насекомых. В то же время практичес ки все бактериофаги, которые по химическому составу, безусловно принадл ежат к группе минимальных вирусов, на самом деле являются очень сложными и высокодифференцированными структурами. Вирусы, в состав которых наря ду с белком и нуклеиновой кислотой входят также липоиды и углеводы, как п равило, принадлежат к группе сложно устроенных вирусов. Большая часть ви русов этой группы паразитирует на животных. Белки вирусов Аминокислотный состав вирусных белков Белок всех исслед ованных до настоящего времени вирусов построен из обычных аминокислот, принадлежащих к естественному L-ряду. D-аминокислот в составе вирусных ча стиц не найдено. Соотношение аминокислот в вирусных белках достаточно б лизко к таковому в белках животных, бактерий и растений. Вирусные белки не содержат обычно большого количества основных аминок ислот (аргинина, муцина) , т.е. не принадлежат к группе белков типа гистонов и протаминов с ярко выраженными щелочными свойствами. Не учитывая нейтр альных аминокислот, можно сказать, что в вирусном белке преобладают кисл ые дикарбоновые кислоты. Это справедливо как для вирусов с низким содерж анием нуклеиновой кислоты, так и для вирусов с высоким содержанием РНК и ДНК. Вирусная ДНК Главной структурной особенностью большинства вирусных м олекул ДНК, как и ДНК из других источников, является наличие двух спаренн ых антипараллельных цепей. ДНК-геном вирусов, однако, невелик и поэтому з десь возникают вопросы, касающиеся концов спирали и общей формы молекул ы ДНК, а не монотонной, фактически не имеющей концов «средней» части спир али. Полученные ответы оказались весьма удивительными: молекулы вирусн ых ДНК могут быть линейными или кольцевыми, двухцепочечными или одноцеп очечными по всей своей длине или же одно цепочечными только на концах. Кр оме того, выяснилось, что большинство нуклеотидных последовательносте й в вирусном геноме встречается лишь по одному разу, однако на концах мог ут находиться повторяющиеся, или избыточные участки. Из всех описанных до сих пор вирусных ДНК наиболее сложно организована Д НК вируса герпеса. Геном здесь, по-видимому, состоит из двух больших соеди ненных сегментов, каждый из которых имеет повторяющиеся концевые после довательности. Возможны четыре способа соединения двух таких сегменто в конец в конец, и все они как будто бы встречаются в каждом препарате вири онов. Наибольший из известных вирусов — вирус осповакцины имеет геном разме ром 15-10 8 дальтон. ДНК, выделенная из свежего препарата вирионов, по-видимому, имеет поперечные сшивки, так как не разд еляется по две цепи. Одна из возможных моделей такой молекулы — гигантс кая, не подверженная денатурации кольцевая структура, образующаяся при замыкании концов линейной двойной спирали. Помимо очень интересных различий в форме молекулы и в структуре концевы х участков вирусных ДНК, существуют также большие различия в величине ге нома. Среди наименьших «полных» вирусов (т.е. вирусов, способных размножа ться в клетке-хозяине) можно назвать фаг ЖX174, парвовирусы, паповирусы, вирусы полиомы и SV40. С другой стороны, у крупных ба ктериофагов и вирусов человека и животных (паприляр, герпеса и осповакци ны) геном значительно больше — от 1 до 1,5 . 10 8 дальтон, так что он мог бы кодировать боле е 100 белков. Действительно, у бактериофага Т4 сейчас идентифицировано боль ше ста генов. В 1953 г. Уайетт и Коэн сделали неожиданное открытие, весьма существенное дл я последующих экспериментов: оказалось, что в ДНК Т-четных бактериофагов содержится не цитозин, а 5-гидроксиметилцитозин. Это отличие дало возмож ность изучать фаговые ДНК независимо от ДНК хозяина. Были открыты кодиру емые фагом ферменты, которые изменяют метаболизм инфицированной клетк и, и она начинает синтезировать компоненты, необходимые вирусу. Еще одно биохимическое отличие ДНК бактериофага состоит в том, что к ее гидроксим етилцитозину присоединены остатки глюкозы: последние, видимо, препятст вуют прерыванию фаговой ДНК некоторыми ферментами хозяина. В противоположность этому у вирусов животных ДНК почти не подвергается модификациям. Например, хотя ДНК клеток-хозяев и содержит много метилиро ванных оснований, у вирусов имеется в лучшем случае лишь несколько метил ьных групп на геном. Большинство вирусных дезоксинуклеотидов не модифи цированы, и поэтому нахождение несомненных модификаций представляло б ы большой интерес. Вирусная РНК Исследования вирусной РНК составили один из самых значит ельных вкладов вирусологии в молекулярную биологию. Тот факт, что у виру сов растений реплицируемая генетическая система состоит только из РНК, ясно показал, что и РНК способна сохранять генетическую информацию. Была установлена инфекционность РНК вируса табачной мозаики, и выяснилось, ч то для инфекции необходима вся ее молекула; это означало, что интактност ь структуры высокомолекулярной РНК существенно для ее активности. Не ме нее важным результатом ранних исследований на том же вирусе явилась раз работка методом выделения высокомолекулярной РНК и изучения ее свойст в. Эти методы послужили в дальнейшем основой для изучения различных типо в РНК, встречающихся у других вирусов. Размеры вирионов РНК — вирусов сильно варьируют — от 7 . 10 6 дальтон у пикорнавирусов до >2 . 10 8 дальт он у ретровирусов; однако размеры РНК и, следовательно, объем содержащей ся в ней информации различаются в значительно меньшей степени. РНК пикорнавирусов — вероятно, наименьшая из известных — содержит око ло 7500 нуклеотидов, а РНК парамиксовирусов — едва ли не самая крупная — по чти 15000 нуклеотидов. По-видимому, всем независимо реплицирующимся РНК-вир усам нужен какой-то минимум информации для репликационной системы и кап сидного белка, но у них отсутствует очень сложная добавочная информация , которой могут обладать крупные ДНК-вирусы. Вирусные белки Кроме капсидных белков, образующих «футляр» для нуклеи новой кислоты, у вирусов с оболочками имеются и другие белки. Подобные пр имеры можно найти среди вирусов животных (в том числе насекомых) , растени й и бактерий. Кроме белков, входящих в состав нуклеопротеидного «ядра» , в ирионы могут содержать еще вирус — специфические белки, которые были вс троены в плазматические мембраны зараженных клеток и покрывают вирусн ую частицу, когда она выходит из клетки или «отпочковывается» от ее пове рхности. Кроме того, у некоторых вирусов с оболочкой существует субмембр анный матриксный белок между оболочкой и нуклеокапсидом. Вторую большу ю группу вирус-специфических белков составляют некапсидные вирусные б елки. Они в основном имеют отношение к синтезу нуклеиновых кислот вирион а. Аминокислотный состав вирусных белков Белок всех исследованных до нас тоящего времени вирусов построен из обычных аминокислот, принадлежащи х к естественному L-ряду. Д-аминокислот в составе вирусных частиц не найде но. Соотношение аминокислот в вирусных белках достаточно близко к таков ому в белках животных, бактерий и растений. Вирусные белки не содержат об ычно большого количества основных аминокислот (аргинина, муцина) , т.е. не принадлежат к группе белков типа гистонов и протаминов с ярко выраженны ми щелочными свойствами. Не учитывая нейтральных аминокислот, можно ска зать, что в вирусном белке преобладают кислые дикарбоновые кислоты. Это справедливо как для вирусов с низким содержанием нуклеиновой кислоты, т ак и для вирусов с высоким содержанием РНК и ДНК. Химические субъединицы вирусных белков Резюмируется имеющийся в наст оящее время материал о субъединицах вирусного белка, можно сделать выво д, что белковый компонент вирусов, как и все прочие белки, построен из пепт идных цепочек. Единственное своеобразие полипептидной цепочки вирусно го белка связано с «маскировкой» обеих или какой-либо одной С- или N — кон цевой аминокислоты, что, видимо, является эволюционным приспособлением, затрудняющим разрушение вирусного белка под влиянием протеаз в клетка х хозяина. В вирусных частицах пептидные цепочки определенным образом в заимодействуют друг с другом, приобретая вторичную и третичную структу ру. Именно в такой форме пептидные цепи являются структурными субъедини цами вирусного белка, наблюдаемые обычно в электронном микроскопе. Некоторые общие свойства вирусных белков Пептидная цепь вирусного бел ка, за исключением «маскировки» С- или N-концевых групп, не обладает сама п о себе какими-либо уникальными свойствами. Она легко гидролизуется прот еазами и обнаруживает обычную, характерную для пептидов лабильность по отношению к ряду физических и химических факторов. В то же время белкова я оболочка вирусов в целом характеризуется рядом уникальных особеннос тей. Прежде всего следует отметить устойчивость цельных частиц к протео литическим ферментам, легко гидролизующим тканевые белки. В то же время в некоторых исследованиях сообщается о частичной или полной инактивац ии как очищенных препаратов вирусов, так и экстрактов, содержащих вирус после инкубации с различного рода протеолитическими ферментами любопы тно, что даже близкородственные вирусы могут, по-видимому, различаться п о чувствительности к протеазам. Так, ни инфекционность, ни гемагглютинир ующая активность вирусов гриппа А и С не изменились после инкубации с тр ипсином, тогда как в аналогичных условиях инфекционность препарата вир уса гриппа В снижалась на 87 %, а титр гемагглютининов при этом не изменялся. Оценивая чувствительность того или иного типа вирусов к протеолитичес ким ферментам, следует так же иметь в виду, что вирусы обнаруживают диффе ренциальную чувствительность к различным протеазам. Вирус осповакцины , например, устойчивый к трипсину и химотрепсину, сравнительно быстро пе реваривается папоином, Однако как бы ни был решен впоследствии вопрос о действии протеаз на некоторые вирусы, следует все же помнить, что устойч ивость к протеазам является широко распространенным свойством белково й оболочки неповрежденных вирусов. Поэтому при выделении вирусов часто применяют обработку вирусных препаратов протеометическими ферментам и для удаления белковых загрязнений. Такая уникальная устойчивость вир усов к протеазам не связана с индивидуальными особенностями вирусного белка как такового, ибо при частичном повреждении или легкой денатураци и вирусного корпускула, равно как и при выделении вирусного белка в чист ом виде, последний легко переваривается протеазами. Поэтому устойчивос ть вирусных частиц к действию протеолитических ферментов нельзя объяс нить какими-либо аномалиями в аминокислотном составе или наличием особ ого типа связей. Это свойство вирусов обусловлено структурными особенн остями корпускула в целом, т.е. третичной и четвертичной структурой белк а, и имеет большое биологическое значение, поскольку вирусы размножаютс я в клетках, содержащих большое количество протеолитических ферментов. Второй особенностью вирусного белка является, как правило, высокая усто йчивость к воздействию ряда физических и химических факторов, хотя каки х-либо общих закономерностей в этом отношении отметить не удается. Некот орые вирусные виды, выдерживающие необычайно жесткие режимы обработки, способны инактивироваться под влиянием такого невинного фактора, как п ониженная или повышенная концентрация солей, лиофилизация и т.п. У четны х Т-фагов отделение ДНК от белковых оболочек («теней» ) легко достигается быстрым изменением осмотического давления, так называемым «осмотическ им шоком» , тогда как нечетные Т-фаги на быстрое уменьшение солевой конце нтрации среды не реагируют. Так же резко различаются вирусы по своей устойчивости в солевых раствор ах. Одним из наиболее устойчивых в этом отношении является вирус папилло мы кроликов, месяцами не теряющий активности в 2 %-ном растворе хлористого натрия и в полунасыщенном растворе сульфата аммония и сохраняющийся в т ечение десятков лет в 50 %-ном растворе глицерина на основании вышеприведе нных фактов можно действительно прийти к выводу, что имеются очень стаби льные и весьма лабильные виды вирусов, но чаще всего для вирусов характе рна избирательная чувствительность к какому-либо определенному виду в оздействий наряду с достаточной стабильностью нуклеопротеидной связи к ряду других факторов внешней среды. Стабильность того или иного вируса к определенным воздействиям нельзя считать неизменной, раз и навсегда д анной видовой характеристикой. Она, наряду с другими свойствами вирусно й частицы, может подвергаться самым радикальным изменениям в результат е мутации. При оценке стабильности вирусных частиц необходимо также име ть в виду, что физическая и биологическая инактивация вирусов не всегда совпадает. Чаще всего эти понятия совпадают в случае простых вирусов, у к оторых отсутствуют специализированные структуры, ответственные за зар ажение клеток, а физическая и химическая структура вирусных частиц отли чается высокой степенью гомогенности и одинаковым уровнем чувствитель ности по отношению к различного рода воздействиям. У более сложных вирус ов очень часто биологическая инактивация связана с повреждением специ ализированных структур, определяющих адсорбцию вирусной частицы или в ведение в зараженную клетку нуклеиновой кислоты, хотя вирусный корпуск ул в целом остается неповрежденным. Из рассмотрения данных о стабильнос ти вирусных частиц и изменений данной характеристики в процессе мутаци и становится очевидным, что какой-либо универсальной закономерности в э том отношении установить нельзя. Стабильность вируса к тем или иным физи ческим и химическим факторам определяется всей совокупностью особенно стей первичной, вторичной и третичной структуры белка и нуклеиновой кис лоты, а также их взаимодействием. Матричная РНК (м РНК) — промежуточный носитель генетической информаци и Механизм, благодаря которому генетическая информация ДНК «транскриб ируется» в матричную РНК, а затем транслируется в белок, выяснился через несколько лет после того, как молекулярные биологи осознали, что нуклеот идные последовательности в ДНК генов прямо ответственны за аминокисло тные последовательности белка. Тот факт, что некоторые вирусы растений и животных содержат в качестве генетического материала РНК и что вирусна я РНК сама по себе инфекционна, уже говорит о вероятной промежуточной ро ли РНК в переносе генетической информации. Когда Жакоб и Моно предсказал и существование короткоживущего, нестойкого посредника между генами и аппаратом белкового синтеза, поиски молекулы РНК с такими свойствами бы ли уже начаты. Первые указания на наличие фаговой РНК, которая вновь синт езировалась после фаговой инфекции и была ассоциирована с предсуществ овавшими бактериальными рибосомами. Окончательное доказательство рол и м РНК в синтезе полипептидов было получено в опытах с бесклеточной бел ок-синтезирующей системой. Экстракты нормальных клеток Е coli могли быть за программированы для синтеза специфических белков фага F 2 добавлением РН К из этого фага. В дальнейшем м РНК была идентифицирована и изучена как в бактериальных, так и в животных клетках. Позже было показано, что многие молекулы м РНК, и вирусные и невирусные, способны программировать синтез специфических белков в самых разных клеточных экстрактах. Это подтверждало, что специф ичность синтеза белка в различных системах зависит от м РНК, а не от систе мы, синтезирующей белок. Во всех клетках первым этапом экспрессии генов оказалась «транскрипция» ДНК с образованием соответствующей м РНК. Углеводы Четверым компонентом, обнаруживаемым иногда в очищенных виру сных препаратах, являются углеводы (в количестве, превышающем содержани е сахара в нуклеиновой кислоте) . Глюкоза и гентибиоза, обнаруживаемая в с оставе Т-четных и некоторых других фагов, — компоненты нуклеиновой кисл оты и рассматриваются в разделе, посвященном составу ДНК и РНК. Помимо эт их «экстра» -углеводов, в составе бактериофагов могут быть и другие поли сахариды. Единственная группа вирусов, в которой наличие углеводов точн о доказано, — вирусы животных, хотя различные авторы приводят весьма пр отиворечивые данные как о количественном, так и о качественном составе и х углеводного компонента. В составе элементарных телец вируса гриппа и к лассической чумы птиц находятся до 17 % углеводов. Ферменты вирусов Аспекты проблемы Термин «ферменты вирусов» может упо требляться в узком и широком смысле слова. В первом случае имеется в виду ферментативная активность, связанная с покоящимися вирусными частицам и, с вирусом внеклеточным. Широкое толкование этого термина обозначает в сю совокупность ферментных систем, принимающих участие в синтезе вирус а в зараженной клетке, т.е. ферменты размножающегося внутриклеточного ви руса. Было доказано, что присутствие в вирусных препаратах одного фермента пр едставляет собой достаточно редкий феномен, установленный в настоящее время с полной достоверностью для лизоцимной и фосфатозной активносте й бактериофагов и нейтраминидазной активности миксовирусов. Во всех ос тальных случаях либо не было получено убедительных доказательств собс твенно вирусного происхождения определяемого фермента, либо, наоборот, твердо доказано происхождение активности фермента от клеточных загряз нений. Компоненты вирионов, не относящиеся к нуклеиновым кислотам и белкам На иболее важный из таких компонентов мы уже упоминали это двойной слой лип идов, образующий основную массу наружной оболочки у тех вирусов, у котор ых она имеется. Полагают, что липиды оболочек просто заимствуются из пла зматической мембраны клетки-хозяина и поэтому, строго говоря, не могут с читаться «вирус-специфическими» . Действительно, парамиксовирусы, разм ножающиеся в различных клетках, могут содержать и соответственно разны е липиды. Поэтому специфика вирусной оболочки зависит от вирусных глико протеидов, находящихся на ее поверхности. Высокоочищенные препараты ви рионов содержат ряд низкомолекулярных компонентов, функция которых в н екоторых случаях понятна. У бактериофагов и вирусов животных и растений обнаружены полиамины. Возможно, что их единственная физиологическая фу нкция состоит в нейтрализации отрицательного заряда нуклеиновой кисло ты. Например, вирус герпеса содержит достаточно спермина, чтобы нейтрали зовать половинку вирусной ДНК, а в вирусной оболочке, кроме того, присутс твует спермидин. В состав некоторых вирусов растений (морщинистости турнепса, крапчатос ти фасоли, табачной мозаики) входит бис (3-аминопропил) амин. Полагают, что э тот полиамин, подобно полиаминам фагов нейтрализует заряды вирусной РН К; поскольку он не был обнаружен в здоровых листьях, возможно, что он синте зируется только в зараженных клетках. Типы организации вирионов Основным структурным компонентом вириона я вляется капсид, в котором заключена нуклеиновая кислота. Капсиды постро ены из белковых субъединиц, собранных строго определенным образом в соо тветствии с относительно простыми геометрическими принципами. Именно поэтому капсиды совершенно различных вирусов, например фагов, вирусов ж ивотных или вирусов растений, могут быть построены точно по одному плану и быть практически неразличимыми морфологически. Крик и Уотсон, исходя из того, что содержащаяся в нуклеиновой кислоте вир уса генетическая информация недостаточна для того чтобы вирус мог коди ровать множество различных белков, пришли к выводу, что капсиды вирусов должны быть построены из множества идентичных субъединиц. Существуют д ва типа организации, при которой идентичные асимметричные субъединицы, такие, как молекулы белка, могут соединиться друг с другом с образование м правильного капсида: спиральная сборка и формирование замкнутых белк овых оболочек. Соответственно существуют лишь два типа капсидов: спирал ьные и изометрические (или квазисферические) ; капсиды всех вирусов отно сятся к одной из этих двух категорий. Каждый из этих типов структур образ уется белками капсидов в результате процесса, называемого самосборной. Этот процесс идет лишь в том случае, если он энергетически выгоден. Это оз начает, что из всех возможных форм капсида реализуется именно та, котора я отвечает минимуму свободной энергии специфических белков данного ви руса. Реальная форма и размеры капсида, таким образом, определяются спец ифической формой молекул белка, являющихся субъединицами, из которых ст роится капсид, и характером связей, которые эти субъединицы образуют дру г с другом. Стабильность структуры, возникающей в конечном счете, зависи т от числа и силы слабых связей, образующихся между белками, входящими в с остав данного капсида. Чем больше свободная энергия, выделяющаяся в проц ессе сборки капсида, тем прочнее собранный капсид. Спиральные капсиды. Вирионы многих вирусов растений и ряда фагов имеют « голый» спиральный капсид, без внешней оболочки. Наиболее хорошо изученн ым вирусом данной группы является ВТМ. Капсиды ВТМ — это относительно жесткие по структуре палочки. Столь же ж естки по структуре капсиды по крайней мере еще одного фага. Капсиды друг их вирусов растений, например вируса желтухи сахарной свеклы и Х-вируса картофеля, тоже представляет собой спиралеобразные палочки, но палочки эти гибкие. Гибки также спиральные капсиды ряда обладающих внешней обол очкой вирусов животных. Гибкость этих палочковидных капсидов свидетел ьствует о том, что субъединицы, из которых они построены, образуют друг с д ругом менее прочные и более подвижные связи, чем те, которые образуются м ежду субъединицами палочек типа вирионов ВТМ. Изометрические (квазисферические) капсиды. Капсиды многих вирусов по фо рме почти идентичны сфере, однако электронная микроскопия показывает, ч то на самом деле эти капсиды представляют собой не сферы, а правильные мн огогранники. Такие капсиды называют изометрическими, так как их линейны е размеры вдоль ортогональных осей идентичны. Сложные капсиды. Серологические и морфологическое исследование капсид ов показало, что они представляют собой сложные структуры. При детальном электронно-микроскопическом анализе строения капсидов на их поверхно сти части удается обнаружить выступы, иначе называемые шипами, которые о бычно расположены на каждой из 12 вершин икосаэдра. Эти шипы играют важную роль в инициации инфекции. В литературе описан «волосатый» фаг, у которо го от поверхности головки вириона отходят многочисленные фибриллы. У самых крупных фагов имеются отростки, «хвосты» . Эти отростки являются органами, при помощи которых фаги прикрепляются к поверхности бактерии- хозяина. Существует мало биологических объектов, которые были бы более у дивительны, чем Т-четные фаги. Вирионы этих фагов собраны более чем из 50 видов различных белков и облада ют высокоорганизованной, изумительно сложной и правильной структурой. Воротничок и базальная пластинка этих фагов обладают гексагональной с имметрией. Белковая оболочка их головки представляет собой деформиров анный икосадельтаэдр с дополнительным рядом субъединиц, вследствие че го в одном направлении она длиннее, чем в других. Гексагональный отросто к такого фага каким-то образом присоединен к макушке головки по плану пе нтагональной симметрии. При сборке фага Т4 иногда образуются вирионы с д вумя отростками вместо одного. Многие вирусы животных, некоторые вирусы растений и, по крайней мере, один класс бактериофагов имеют внешнюю обол очку, окружающую их капсиды. Неотъемлемой структурой этих оболочек, как и всех других биологических мембран, является двойной слой фосфолипидо в, в который погружены молекулы специфических белков. В тех случаях, когд а двойной слой фосфолипидов расположен на поверхности вириона и, следов ательно, легко доступен для эфира или других растворителей липидов, вири оны легко разрушаются и интактивируются такими растворителями. Фосфол ипиды внешних оболочек вирусов бывают идентичны липидам клетки-хозяин а или сходны с ними, что, например, характерно для большинства оболочек ви русов животных, в других случаях наблюдаются достаточно выраженные раз личия между фосфолипидами. Оболочки вирусов животных формируются в сос таве плазматической или ядерной мембраны клетки. Электронные микрофот ографии зараженных вирусами клеток показывают, что белки вируса появля ются на небольших участках плазматической мембраны клетки, к которой в п оследствии мигрируют капсиды вируса, что, в конечном счете, ведет к форми рованию вириона и его отпочкованию. Следует, однако, подчеркнуть, что дал еко не у всех вирусов животных вирионы имеют квазисферическую форму. Нап ример, вирионы рабдовирусов по форме напоминают пулю; их оболочка, так же как и у других вирусов животных, образуется в результате отпочкования от плазматической мембраны клетки. Оболочки других вирусов, например виру са оспы, построены значительно сложнее и полностью формируются в цитопл азме клетки. Такие вирионы нечувствительны к действию эфира, не дают пер екрестных иммунологических реакций с белками клетки-хозяина и, по-видим ому, состоят только из компонентов, специфичных для вируса. Проблемы и методология Вирусная частица, или вирион, — это инертная ста тическая форма вируса. Когда вирионы находятся вне клетки, они не размно жаются и в них не происходит никаких метаболических процессов. Все динам ические события — биосинтез вирусных компонентов, повреждение органи зма-хозяина — начинаются лишь тогда, когда вирус проникает в клетку. Даж е у многоклеточного хозяина решающие события при вирусной инфекции про исходят на клеточном уровне. Распространение вируса совершается в резу льтате повторных циклов взаимодействия вируса с клетками и рассеяния в ирионов во внеклеточной среде. Все то, что мы уже знали о различных компон ентах вирионов, заставляет предполагать, что внутри клетки-хозяина орга низация этих компонентов должна быть не такой, как в свободной вирусной частице. И действительно, в зараженных вирусом клетках происходит глубо кая перестройка вирусного материала, а часто также и компонентов клетки- хозяина. Возникает новая система — комплекс вирус-клетка, функциональн ая организация, которой определяется взаимодействием вирусных и клето чных функций. Активные механизмы этого комплекса существенно отличают ся от механизмов незараженной клетки. Фазы развития: эллипс, репликация и созревание С помощью различных мето дов было обнаружено много разнообразных ситуаций, которые, однако имеют между собой нечто общее, а именно то, что у каждого вируса взаимодействие с хозяином представляет собой специфическую последовательность событ ий. Каждый вирус — это организм со своими собственными процессами онтог енеза и морфогенеза, а также со своим филогенетическим прошлым. Однако ц иклы развития разных вирусов, если их рассматривать в широком плане, име ют ряд общих черт. После прикрепления вируса в клетке происходит ряд событий, ведущих к осв обождению вирусного генетического материала внутри клетки. При этом ин фицирующие вирионы перестают существовать как организованные структу ры. Так как инфекционность свободной вирусной нуклеиновой кислоты, как п равило, намного меньше инфекционности цельного вириона, освобождение в ирусного генома и переход его внутрь клетки-хозяина сопровождаются уме ньшением или исчезновением инфекционности. Это явление получило назва ние эклипса. Проникновение нуклеиновой кислоты вируса в клетку в процес се ее заражения может происходить различными способами. Например, у фаго в, ингецирующих свою ДНК, ориентированным образом через оболочку бактер иальной клетки, нуклеиновая кислота освобождается непосредственно у п оверхности клетки. Некоторые фаги прикрепляются к жгутикам или ворсинк ам бактерий, после чего вводят через эти органеллы свой генетический мат ериал или же используют их для того, чтобы приблизиться к поверхности кл етки. Вирусы, обладающие наружной оболочкой, могут сливаться с клеточной мембраной, и в цитоплазму клетки проникает весь внутренний капсид вирус а, после чего происходит освобождение вирусного генома. Как только вирус ный геном освободится от белка, он может служить источником информации к ак для репликации, так и для транскрипции, действуя как матрица для биоси нтеза соответствующих продуктов. Размножение вирусных геномов идет пу тем репликации генетического материала, т.е. ДНК или РНК. Репликация ДНК п роисходит в основном с помощью тех же биохимических механизмов, что и ре пликация генетического материала клетки. Репликация вирусного ДНК-ген ома в клетке хозяина возможна, если геном является репликоном, который р аспознается репликационным аппаратом клеточного или вирусного происх ождения. В процессе репликации могут совместно участвовать и клеточные и вирусные ферменты. В некоторых случаях репликация начинается лишь пос ле ряда предварительных этапов и создания особых условий. При вирусной и нфекции набор клеточных ферментов может пополняться — иногда за счет ф ерментов, привносимых в клетку вирионом (вирусы осповакцины, везикулярн ого стоматита и гриппа, ретровирусы) , а иногда — за счет ферментов, вновь синтезируемых как продукты вирусных генов. Последние, в частности, доказ ано для некоторых фагов, для репродукции которых нужны особые компонент ы ДНК. Эти фаги содержат информацию, необходимую для синтеза соответству ющих ферментов. Вирусы могут также вызывать синтез ферментов, катализир ующих реакции, которые уже ранее осуществлялись с помощью клеточных фер ментов. Большинство РНК-содержащих вирусов размножаются путем образования коп ий РНК без участия промежуточных ДНК-матриц, и поэтому их репликация мож ет происходить в клетках с ингибированным синтезом ДНК. Эти вирусы кодир уют собственную РНК-репликазу. Клетки хозяина такого фермента не имеют. У некоторых групп РНК-содержащи х вирусов РНК реплицируется на промежуточной комплиментарной ДНК, синт езируемой на вирусной РНК с помощью обратной транскриптазы. Этот фермен т привносится в клетку хозяина вирионом вместе с вирусной РНК. Введение уже синтезированного вирусного фермента в клетку — явление не столь ре дкое. Число компонентов биосинтетического аппарата, которое мог бы кодирова ть вирус, лимитируется величиной вирусного генома. Самые малые вирусы со держат около 10 6 дальтон ДНК или РНК. Так как соотношение молекулярных весов кодирующей нуклеиновой кислоты и кодир уемого белка составляет примерно 9: 1 для РНК или одноцепочной ДНК и 18: 1 для д вухцепочной ДНК, эти вирусы в состоянии обеспечить синтез лишь нескольк их белков, и обычно это лишь структурные белки вириона. Очевидно, что все в ирусы в значительной степени зависят от ферментного аппарата клеток — хозяев. Некоторые вирусы нуждаются даже в помощи других вирусов. Наприме р, РНК вируса — сателлита некроза табака состоит всего из 1200 нуклеотидов, а белковая субъединица капсида, которую эта РНК кодирует, состоит из 400 ам инокислотных остатков. Очевидно, что ни для какой другой информации в ге номе этого вируса не хватило бы места. Поэтому он способен размножаться только в тех клетках, которые одновременно заражены вирусом некроза таб ака. Последний и служит источником необходимой репликазы. Есть и другие примеры вирусов, сохраняющихся в естественных условиях только благода ря вирусам — помощником, инфицирующим те же клетки. Во время своей репликации вирусная нуклеиновая кислота не связана со сп ецифическими белками, имеющимися в зрелых вирионах. При определенных ус ловиях репликация нуклеионовых кислот происходит тогда, когда синтез б елков химическим путем ингибирован. В ходе инфекции, ведущей к образован ию и высвобождению новых вирусных частиц, синтез вирионных белков обычн о начинается после того, как репликация нуклеиновой кислоты уже разверн улась. В результате синтеза этих белков накапливается фонд предшествен ников, служащий источником материала, используемого при сборке капсидо в. Созревание — сложный и необратимый процесс: ни нуклеиновая кислота, н и структурные белки, включенные в полный капсид или его часть, снова уже н е освобождаются в той же клетке. Таким образом, при сборке капсида вирусн ый геном исключается из реплицирующейся популяции нуклеиновой кислоты , а капсидные белки — из фонда белковых предшественников. Если вирусы им еют наружную оболочку, то она присоединяется к капсиду позднее, либо в ци топлазме клетки, либо при взаимодействии с клеточной мембраной. Такой пр оцесс сборки, включающий этапы наполнения предшественников позволяет объяснить явление фенотипического смешения, когда в клетке, зараженной двумя различными, но совместимыми вирусами, образуются вирионы с капсид ами, построенными из субъединиц, кодируемых разными геномами. Вновь образованные вирионы освобождаются во внешнюю среду (нередко вме сте с незрелыми формами) либо в результате лизиса клетки — хозяина, вызы ваемого вирусными ферментами, как при инфекции бактерий фагами, либо пут ем выталкивания участков цитоплазмы, либо, наконец, путем выхода отдельн ых вирионов или небольших их групп. Некоторые вирусы животных с трудом о свобождаются из клеток в культурах in vitro; в живом организме выходу таких ви русов из клеток и их распространению способствует захват поврежденных вирусом клеток фагоцитами и их переваривание. Вирусы растений обычно не освобождаются путем лизиса клеток, а переходят из клетки в клетку через межклеточные соединения. Взаимодействие фага с бактериями Основные проблемы и явления Бактерио фаги являются паразитами представителей почти всех групп прокариотиче ских организмов от крошечных Dellovibrios, которые сами паразитируют на других ба ктериях, до некоторых крупных сине-зеленых водорослей. Общие свойства фа гов обычно служат отражением свойств клетки бактерии-хозяина. Наличие ж есткой клеточной стенки у большинства прокариот требует особых механи змов для проникновения или выхода вирусов. Прокариоты не дифференцирую тся в стволовые или специализированные клетки, а являются популяцией бо лее или менее сходных клеток, которые продолжают размножаться, пока имее тся соответствующая питательная среда. Поэтому взаимодействие фагов с бактериями происходит в бактериальной культуре циклически, пока не нас тупит некое равновесное состояние, которое определяется числом клеток- хозяев и вирусных элементов и скоростью их воспроизведения. Другая ситу ация возникает тогда, когда бактерии способны к дифференцировке, наприм ер при споруляции или смене состояний. Прикрепление и проникновение Прикрепление вирионов фага к бактериаль ной клетке является реакцией первого порядка и происходит обычно на кле точной поверхности. Последняя различна по своей структуре у разных типо в бактерий. Некоторые фаги прикрепляются к особым выростам, так называем ым F и L-ворсинкам, которые принимают участие в процессе конъюгации. Вирион ы фагов группы х обратимо прикрепляются к жгутикам бактерий и затем соск альзывают вдоль них к поверхности клетки, причем этому процессу, по-види мому, способствует движение самих жгутиков (поскольку неподвижные бакт ериальные мутанты не бывают хозяевами этих фагов) . На поверхности бакте риальной клетки имеются специфические рецепторы для фагов, однако данн ые об их природе весьма ограничены. Тот факт, что фаг неспособен адсорбир оваться на бактериальном мутанте, не обязательно означает, что мутант ут ратил химические группы, выполняющие роль рецепторов фага, — последние могут быть просто скрыты другими компонентами клеточной оболочки. Реце пторы не всегда необходимы для самой клетки; например, при росте бактери й в определенных температурных условиях они могут утрачиваться. Из оболочки бактерий, чувствительных к фагу, удается экстрагировать спе цифическое вещество, способное инактивировать фаг. Возможно, это вещест во является самим рецептором или компонентом рецепторной структуры на поверхности бактерий. Сами по себе рецепторы, по-видимому, способствуют лишь первому обратимому этапу адсорбции. Не исключено, что они также уча ствуют в других процессах, частности в транспорте ионов железа. После пр икрепления фага бактерия в течение некоторого времени (латентный перио д) не претерпевает заметных морфологических изменений даже и в том случа е, если заражение, в конце концов, приведет к лизису клетки, поскольку лизи с наступает всегда внезапно. Проникновение фагового генома в клетку сопровождается физическим отде лением нуклеиновой кислоты от большей части капсидных белков, которые о стаются снаружи. Кроме фаговой нуклеиновой кислоты внутрь бактериальной клетки инъецир уется также небольшое количество белка и некоторые другие вещества, в то м числе олигопептиды и полиамины. Роль этих веществ в процессе развития фага неизвестна, некоторые из них являются остатками протеолиза капсид ных белков при сборке вирионов. Если бактериальные клетки способны погл ощать свободную ДНК из среды, то и геном фага может проникнуть в них в виде свободных молекул ДНК. Это явление называют трансфекцией. Способность б актерий поглощать молекулы ДНК может возникнуть как нормальное явлени е на некоторых этапах роста, что наблюдается, например, у В subtilis. В некоторых случаях такое состояние вызывается искусственно, как, напри мер, у Е coli. Процесс развития фага после трансфекции принципиально не отличается о т происходящего при нормальной фаговой инфекции, за исключением того, чт о в этих случаях не наблюдается резистентности, вызываемой отсутствием рецепторов или другими свойствами оболочки клетки. Проникновение генома фага в чувствительную к нему бактерию приводит ли бо к лизогенной, либо к литической инфекции, в зависимости от природы фаг а (а иногда и бактерии) и от окружающих условий, например температуры. При лизогенном типе взаимодействия геном фага в неинфекционной форме пере дается бактериальными клетками из поколения в поколение, причем время о т времени в некотором количестве клеток синтезируются соответствующие вирионы, лизирующие эти клетки и выходящие затем во внешнюю среду. Лизог енные клетки, повторно зараженные этими вирионами, не лизируются (ибо он и иммунны к этому фагу) , так что лизогенная культура продолжает нормальн о расти. Присутствие свободных вирионов можно выявить путем воздействи я на клетки каких-либо иных, нелизогенных штаммов бактерий, лизируемых д анным фагом. Фаги, способные лизогенизировать заражаемые ими бактерии, н азываются умеренными, а фаги, у которых такая способность отсутствует, — вирулентными. Следует, однако, помнить, что даже умеренные фаги при пер вой инфекции чувствительных к ним бактерий вызывают продуктивную инфе кцию у многих или даже у всех клеток. Возникновение лизогении и предупре ждение созревания вирионов и лизиса клеток требуют серии определенных событий, которые вовсе не всегда случаются со всякой зараженной бактери ей. Вероятность появления лизогении или продуктивной инфекции варьиру ет от фага к фагу и зависит от условий культивирования. Связь между строением вириона и началом инфекции Длинные нити (фибрилл ы) отростка служат для специфического узнавания фагом определенных уча стков на поверхности клетки-хозяина, к которым он прикрепляется. Мутации генов, кодирующих белки нитей, приводят к изменению или полной утрате сп особности фага прикрепляться к клетке-хозяину. Еще одним доказательств ом важной роли нитей отростков служат эксперименты с антифаговыми анти сыворотками, показавшими что прикреплению фага к клеткам препятствуют только антитела к белкам дистальных частей концов нитей. Нити обвиваются вокруг отростка таким образом, что их средняя часть подд ерживается «усиками» , прикрепленными к тому месту, где головка соединяе тся с отростком. Синтез белка «усиков» , вероятно, кодируется геном wac. Сопр икосновение концов нитей с рецептором клетки, возможно, обусловливает и х разворачивание и выпрямление. Отличительное свойство фага Т4, которое легко утрачивается вследствие мутации и отбора, заключается в том, что о свобождение нитей отростка от «усиков» зависит от Lтриптофана как кофак тора. Зависимость выпрямления нитей и последующего прикрепления фага к клетке от концентрации триптофана указывает на то, что контакт некоторы х нитей с клеткой может способствовать освобождению остальных нитей. Дл я следующего этапа взаимодействия фага с бактерией необходимо правиль ное пространственное положение базальной пластинки отростка, что в сво ю очередь, обеспечивается, вероятно, контактом всех шести нитей с рецепт орами клетки. По-видимому, прикрепление фаговой частицы с помощью нитей отростка позволяет ей производить определенные скользящие движения по поверхности клетки, пока не будет найден участок, через который можно вв ести ДНК. В этом отношении весьма важным оказалось наблюдение, согласно которому необратимое прикрепление фага к клетке и проникновение в нее е го ДНК происходят лишь на определенных участках оболочки (всего их около 300) , где цитоплазматическая и внешняя мембраны образуют прочные контакты , устойчивые к мягкому осмотическому шоку. Это справедливо, вероятно, и дл я других бактериофагов. Весьма важно было бы выяснить, каково отношение этих участков к местам синтеза мембранных компонентов и фаговых рецепт оров. На следующем этапе взаимодействия фага с клеткой происходит сокра щение чехла отростка, в результате чего стержень проникает в клеточную о болочку. Сокращение стимулируется базальной пластинкой, изменяющей св ою конформацию под влиянием нитей отростка. В процессе сокращения прини мают участие все 144 субъединицы чехла, и их совместное перемещение привод ит к уменьшению длины чехла в два раза. Было высказано предположение, что энергия для сокращения чехла поставляется молекулами АТФ, ассоциирова нными с фагом, однако окончательно это еще не доказано. Дистальная часть стержня подводится вплотную к внутренней цитоплазматической мембране , но не обязательно проникает через нее. ДНК из обработанных мочевиной фа гов, имеющих сокращенные чехлы и экспонированные стержни, может проника ть в сферопласты Е coli, у которых внешние мембраны и жесткие оболочки либо с овсем удалены, либо в значительной мере разрушены. Заражение сферопласт ов, осуществляемой в гипертонических средах, приводит к образованию нор мального фагового потомства. В сферопласты можно вводить цельные или фр агментированные молекулы фаговой ДНК, которые затем реплицируются и уч аствуют в рекомбинации. Естественно, что в процессе заражения сферопластов поверхностные реце пторы не участвуют. Поэтому обработанные мочевиной фаги Т4 могут заражат ь устойчивые к ним мутанты Е. Coli или даже устойчивые бактерии отдаленных в идов. Прикрепление к сферопластам фаговых частиц, обработанных мочевин ой, блокируется фосфатидилглицерином, который, вероятно, является соста вной частью мембран, стимулирующей введение ДНК в клетку. Если бактерию, уже зараженную Т-четным фагом, спустя несколько минут вно вь инфицируют этим же фагом, то второй контингент фага не участвует в раз множении (так называемое исключение при суперинфекции) и не передает сво ей ДНК потомству. Было показано, что ДНК фаговых частиц, попавших в клетку при повторном заражении, разрушается (разрушение при суперинфекции) . Об а этих процесса находятся под контролем активируемых в клетке-хозяине ф аговых генов, функция которых может нарушаться при соответствующих мут ациях. Сборка вирионов В отличие от ранних этапов развития фага ход сборки кап сидов и полных вирионов не программируется последовательной экспресси ей фаговых генов. По-видимому, все белки вириона и другие поздние белки, ка к, например, лизоцим фага, синтезируются более или менее одновременно и, н акапливаясь, образуют «фонд предшественников» . Отсюда они извлекаются путем прямого специфического взаимодействия с другими белковыми молек улами, в результате чего возникают субструктуры, которые затем собирают ся уже в цельные вирионы. Общий ход сборки стал понятен из результатов оп ытов in vivo с мутантными фагами и при изучении лизатов; однако после того, как была открыта возможность сборки предобразованных фаговых предшествен ников in vitro, с помощью этого эффективного метода было получено много новых данных. Сборка вириона состоит из четырех основных этапов, приводящих к образованию промежуточных структур, взаимодействующих между собой лиш ь в определенных критических точках. 1. Базальная пластинка фагового отростка построена из 15 белков, в синтезе которых, кроме основных, участвуют и некоторые другие гены. Весьма интер есно, что пластинка содержит, по-видимому, несколько молекул двух кодиру емых фагом ферментов — дигидрофолатредуктазы и тимидилатсинтетазы, а также некоторое количество фолиевой кислоты. 2. Собранная базальная пластинка после присоединения к ней белка гена Б4 служит затравкой для сборки стержня отростка, состоящего из 144 молекул пр одукта гена 19. Вокруг стержня происходит сборка чехла, представляющего с обой полимер, построенный из 144 молекул продукта гена 18. Продукты двух друг их генов стабилизируют всю эту структуру. Непонятно, каким образом дости гается постоянство длины стержня при сборке. Возможно, что существуют ещ е какие-то линейные белки, отмеряющие нужное расстояние, или контакт с ба зальной пластинкой придает субъединицам стержня такую специфическую к онформацию, которая имеет минимум свободной энергии только в случае опр еделенного размера стержня. Эта последняя гипотеза указывает на то, что процесс сборки, возможно, не является чисто механическим. 3. Оболочка фаговой головки, построенная из более чем 10 белков, образуется в результате активности многих генов. Основной из них представляет собо й продукт гена 23, входящий в состав законченной головки лишь после отщепл ения от основного полипептида фрагмента с мол. весом 10000. Протеолиз осущес твляется главным образом продуктом гена 22, а также, возможно, гена 21, отсутс твующим в зрелом вирионе. Однако белок гена 22 представляет собой, по сущес тву, внутренний белок, превращающийся, в конце концов, в результате самоп ереваривания в мелкие пептиды, причем некоторые из них остаются в головк е фага. Здесь присутствуют также и другие внутренние белки, подвергающие ся частичному перевариванию белком гена 22. 4. После окончания раздельной сборки головки и отростка они самопроизво льно объединяются как in vitro, так и in vivo. 5. Нити отростка состоят из продуктов четырех генов. Их сборка идет незав исимо, но прикрепляются они к базальной пластинке только после соединен ия головки и отростка. Для этой реакции нужен белок гена 63, а также взаимод ействие с «усиками» , которые прикреплены к воротничку, расположенному м ежду головкой и отростком. Головка фага имеет специфическую форму, определяемую белком гена 23 и дру гими белками. Ее строение изменяется в результате мутаций соответствую щих генов. Нормальная головка фага 74 имеет форму неправильного икосадел ьтаэдра, по длинной оси которого расположен дополнительный ряд субъеди ниц, состоящих из 840 копий белка гена 23. Субъединицы белка гена 20 располагаю тся на вершинах. Такая форма головки отражает наличие определенных прос транственных ограничений, накладываемых белок — белковыми взаимодейс твиями. При отсутствии этих ограничений строение фага сильно изменяетс я. Бактериофаг l Бактериофаг l является умеренным фагом, т.е. он может либо пе реходить из клетки в клетку в процессе инфекции, либо передаваться от од ного поколения к другому в ходе размножения данного бактериального шта мма. В последнем случае латентный геном фага называется профагом, а клет ки, несущие такой профаг, — лизогенными. Присутствие генома фага в лизог енной культуре можно обнаружить при спонтанном освобождении фага из не большой части клеточной популяции, в которой произошло спонтанное разв итие фага. Естественным хозяином фага l служит штамм Е coli K 12, генетика которого хорошо изучена. Поэтому фаг l был избран в качестве объекта интенсивных исследо ваний, направленных на выяснение природы лизогении. Исходный дикий штам м К 12 является лизогенным по фагу, который не образует бляшек на этом штам ме, обладающем, подобно большинству лизогенных бактерий, иммунитетом по отношению к фагу, содержащемуся в нем в виде профага. Обычно фаг l размножа ется на вариантах штамма К 12, «извлеченных» от профага. Такие извлеченные варианты обнаруживаются в небольших количествах среди клеток, выживши х после интенсивного облучения. При образовании устойчивой лизогенной клеточной линии должны быть выполнены следующие два условия. Во-первых, профаг должен находиться в клетке в таком состоянии, чтобы при клеточном делении каждая дочерняя клетка получала по крайней мере одну его копию. В случае фага l эта задача решается путем включения его ДНК в бактериальн ую хромосому, в результате чего ДНК профага пассивно реплицируется и сег регируется с помощью аппарата клетки-хозяина. Во-вторых, те вирусные ген ы, продукты которых потенциально способны нарушить целостность клетки, должны регулироваться таким образом, чтобы клетки могли благополучно р асти и размножаться. Это достигается путем репрессии транскрипции гено в. В клетках, лизогенных по фагу l, не транскрибируется ни один из вирусных генов, необходимых для продуктивной инфекции. В лизогенных культурах об наруживается лишь очень небольшое количество вирусной м РНК. Вирусы животных Адсорбция и проникновение в клетку Первые этапы вирус ной инфекции, независимо от того, о каком вирусе идет речь, традиционно пр инято называть адсорбцией, проникновением и «раздеванием» (разрушение м вирусной оболочки) . Под адсорбцией принято понимать первичный контакт вируса с клеткой. Часто этот контакт сначала бывает очень слабым — обра тимая адсорбция. Затем прочность контакта возрастает — необратимая ад сорбция. Эти термины в равной степени приложимы для описания начальной с тадии проникновения в клетки любых вирусов. Термин «проникновение» оши бочен потому, что он подразумевает активное воздействие на атакуемую кл етку определенной части вириона, что не было доказано. Более вероятно, чт о во многих случаях на самом деле имеет место совсем другой процесс — пр икрепление вируса к клетке вследствие физико-химической комплементарн ости между поверхностью вируса и молекулами рецепторов, находящихся на поверхности клетки, индуцирует в клетке изменения, необходимые для прон икновения в нее вируса. Общая картина адсорбции вирусов животных Результаты, полученные при и зучении адсорбции на клетках самых различных вирусов животных (как с обо лочкой, так и без нее) , создают следующую общую картину процесса прикрепл ения вируса к клетке. Процесс начинается со случайных столкновений мнро жества вирионов с поверхностью клетки, но к образованию связи между физи чески комплементарными друг другу участками поверхности клетки и вири она ведет лишь одно столкновение из каждых 10 з или 10 4 . Возможно, что в образовании та ких связей принимают участие и ионы культуральной среды. Непосредствен но реализовать эти связи могут находящиеся на поверхности вирионов выс тупы, состоящие из особых вирусных белков, такие, как «шипы» у вирусов с об олочкой, например микровирусов, тогавирусов и парамиксовирусов, или бел ковые нити (фибриллы) , отходящие от вершин икосаэдрических вирионов (нап ример, у некоторых аденовирусов) . Участок связывания на поверхности вир иона, непосредственно взаимодействующий с рецептором клетки, может сос тоять из индивидуального структурного вирусного белка, а может и предст авлять собой мозаику из нескольких белков капсида (по-видимому, именно т ак обстоит дело у пикорнавирусов) . Рецептором во всех случаях служит рас положенный на поверхности клетки белок или гликопротеид. На поверхност и клетки имеются различные рецепторы, каждый из которых специфичен для с воего вируса. Специфичность этих рецепторов не абсолютна, что приводит к возможности группировки вирусов по этому свойству в своеобразные «сем ейства» . Вирусы, родственные друг другу по данному признаку, могут быть р одственны и по другим признакам, однако это условие не является обязател ьным. На поверхности единичной клетки может содержаться от 10 4 до 10 5 копий каждого в ида рецептора. Следует подчеркнуть, что сам факт адсорбции вируса на клетке еще никоим образом не означает инициации вирусной инфекции. Связи, образующиеся пр и адсорбции между вирусом и клеткой, могут быть «слабыми» , а адсорбция «о братимой» , т.е. вирион может покидать поверхность клетки. Однако некотор ые из адсорбировавшихся на клетке вирионов связываются с ней более проч ными «необратимыми» связями. Проникновение вирусов животных в клетку и «раздевание» Следующий этап после прочного прикрепления вириона к поверхности чувствительной кле тки — это проникновение внутрь клетки всего вириона или его части и нач ало синтеза вирус-специфического белка или вирусной м РНК. В основе нача льного связывания самых различных вирусов с клеткой могут лежать принц ипиально сходные процессы. Напротив, проникновение вирионов в клетку и а ктивация вирусного генома могут происходить у разных вирусов по-разном у. Ясно, что вирусы с оболочкой и «голые» вирусы должны проникать в клетку в результате разных физико-химических процессов. Уже давно предполагал и, что в основе проникновения в клетку вирусов с оболочкой, вероятно, лежи т процесс, в какой-то мере подобный «плавлению мембраны» , или процесс «сл ияния» . Что же касается таких относительно больших белковых структур, к ак голые вирионы, то для них известен только один механизм проникновения в клетку — это фагоцитоз, и уже давно предполагается, что такие вирусы пр оникают в клетки в результате варианта фагоцитоза, названного «виропек сисом» . В последние года стала известна еще одна важная подробность, кас ающаяся проникновения вирусов в клетки. Действительно, в ряде случаев ед инственным компонентом вириона, непосредственно ответственным за синт ез новых компонентов вируса, является его нуклеиновая кислота, а в други х еще и входящая в состав вириона РНКили ДНК-полимераза. Размножение вирусов животных РНК-содержащие вирусы Одно из резких раз личий между вирусами бактерий и вирусами животных состоит в неодинаков ой продолжительности их одиночного цикла репродукции. Так, одиночный ци кл репродукции даже у наиболее быстро размножающихся вирусов животных продолжается 5-6 г, а у ряда других вирусов — несколько дней. Кроме того, мно гие вирусы вызывают лишь персистентные инфекции, при которых клетки-хоз яева не погибают, хотя вирус все время образуется и в них и в их потомках. С толь длительный цикл репродукции вирусов животных по сравнению с более коротким циклом репродукции большинства фагов, вероятно, зависит от отн осительных размеров соответствующих клеток-хозяев. Многие особенности вирусов животных связаны со специфическими особенн остями архитектуры эукариотических клеток. ДНК большинства ДНК-содерж ащих вирусов синтезируется в ядре клетки. Напротив, белки всех без исклю чения вирусов синтезируются в цитоплазме. Заражение клеток вирусами в п ринципе может привести к двум последствиям. Зараженная клетка может либ о погибнуть, образовав при этом большое количество вируса (литический ти п взаимодействия вирусов с клетками) , либо продолжать жить и делиться, си нтезируя небольшие количества вируса. Культуры размножающихся клеток, продуцирующих вирус, называют персистентно инфицированными. Почти люб ой вирус животных при соответствующих условиях может вызвать персисте нтную инфекцию. Более того, многие вирусы лизируют клетки очень редко, и о бычно в зараженных клетках устанавливается состояние устойчивого равн овесия — образуется персистентно инфицированная культура клеток. Установлено, что при успешной литической инфекции в зараженных клетках происходит пять четко отличающихся друг от друга событий, реализуемых ф ункционально активными вирус-специфическими белками. В ходе одиночног о цикла репродукции вируса эти события развиваются либо параллельно, ли бо последовательно. Их временная последовательность определяется спец ифическими свойствами каждого вируса. Это следующие события: 1) подавлен ие вирусом ряда клеточных функций; 2) синтез вирусных м РНК; 3) репликация ви русного генома; 4) морфогенез вирионов; 5) освобождение вирионов из клетки. Согласно правилам спаривания оснований по Уотсону и Крику, для каждой да нной молекулы РНК можно записать комплементарную ей нуклеотидную посл едовательность. Для удобства классификации вирусов вирусную м РНК усло вно обозначают как «плюс» -цепь, а комплементарную ей последовательност ь, как «минус» -цепь. Исходя из структурной взаимосвязи между нуклеиново й кислотой вириона и его м РНК, все вирусы животных можно разделить на шес ть классов. Конечно, эту классификацию можно применить также и к бактери офагам, и к вирусам насекомых, и растений, но в настоящее время разумнее вс его ограничить ее применение вирусами животных. К классу I относятся вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК, например, вир ус осповакцины м РНК этих вирусов синтезируется таким же образом, как и к леточные м РНК, геном вируса — двухцепочечная ДНК — служит матрицей дл я синтеза м РНК. Класс II включает вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК. И х м РНК по нуклеотидному составу, вероятно, полностью гомологична ДНК ви риона. Поэтому м РНК должны транскрибироваться с «минус» - цепи ДНК, входя щей в состав репликативного промежуточного комплекса-вируса. К остальн ым классам относятся вирусы, у которых геном служит РНК. Класс III включает вирусы, содержащие двухцепочечную РНК, например реовирусы. Эта РНК служи т мартицей для асимметричного синтеза вирусных м РНК. Оказалось, что у вс ех до сих пор обнаруженных вирусов класса III геном сегментирован, т.е. сост оит из множества хромосом, каждая из которых кодирует один полипептид. В ирусы, относящиеся к классу IV, содержат «плюс» -цепи РНК. Геном этих вирусо в имеет ту же полярность, что и их м РНК. Вирусы данного класса делятся на д ва подкласса. У вирусов подкласса Ivа, типичным представителем которых яв ляется вирус полиомиелита, все белки синтезируются при трансляции одно й-единственной молекулы м РНК. Образующийся при этом полипротеин расщеп ления затем протеолитическими ферментами с образованием функциональн о активных белков. Все м РНК этих вирусов имеют ту же длину, что и РНК-геном. Вирусы подкласса Ivв называют также тогавирусами. Они синтезируют в клет ке по меньшей мере два вида вирусных м РНК: м РНК одного вида имеет ту же дл ину, что и РНК вириона, а м РНК второго вида представляет собой фрагмент РН К вириона. Вирусы класса V называют также «минус» — РНК-вирусами. По нуклеотидной п оследовательности м РНК этих вирусов комплементарна РНК вирионов. След овательно, вирион содержит матрицу для синтеза м РНК, но не для синтеза бе лков. Различают два подкласса вирусов класса V. Геном вирусов подкласса Vа представляет собой одну молекулу РНК, с которой транскрибируется целый ряд м РНК, причем все до сих пор изученные м РНК этих вирусов моноцистронн ые. Вирусы подкласса Vв имеют сегментированный геном. Каждый из сегменто в генома служит матрицей, с которой транскрибируется лишь один вид молек ул м РНК. Один из этих м РНК кодируют мноцистроенные, а другие — полицистр оенные полипротеины. Вирусы, относящиеся к классу VI, называют также ретро вирусами. Это самые необычные из всех известных РНК-содержащих вирусов, ибо при транскрибировании их РНК синтезируется не РНК, как обычно, а ДНК, к оторая в свою очередь служит матрицей для синтеза м РНК. Следовательно м РНК этих вирусов и РНК их вирионов не отличаются по полярности друг от др уга, а некоторые из них идентичны и по длине. Из удивительных свойств этих генетических систем вытекает не мало замечательных следствий. Плюс — РНК-вирусы: пикоркавирусы (класс IV а) Вирусы этого подкласса, из кот орых наиболее интенсивно изучался вирус полиомиелита, известны под общ им названием «пикоркавирусы» . К их числу относятся также вирус менго, ви рус энцефаломиокардита (пикоркавирусы мышей) , риновирусы (вирусы, вызыв ающие у человека один из видов острых респираторных заболеваний, — так называемую простуду_ и вирус ящура. Тогавирусы (класс IV в) К тогавирусам относятся все плюс — РНК-вирусы, в кот орых образуются м РНК двух типов, различающиеся по своим размерам. Назва ние «тогавирусы» отражает особенности внешней оболочки их вирионов. Си нтез этой оболочки рассматривается в другом разделе, а здесь мы обсудим только механизмы синтеза РНК и белков, используемые вирусами данного кл асса. Прежде чем перейти к рассмотрению молекулярной биологии тогавиру сов, интересно вспомнить, как были обнаружены вирусы этой группы. Эпидем иологи установили, что многие вирусы, вызывающие заболевания позвоночн ых животных, переносятся клещами или комарами. Тогавирусы, патогенные для человека, обычно эндемичны для различных вид ов животных и передаются человеку лишь через укус какого-либо членистон огого переносчика. Вирусы этой группы были названы арбовирусами (означа ет «переносимый членистоногими» ) . Впоследствии, однако, стало ясно, что п од этим названием объединены вирусы, резко различающиеся по своим биохи мическим свойствам. Общим у них обычно является способность размножать ся как в клетках насекомого-переносчика, так и в клетках тех или иных позв оночных животных. Основная часть арбовирусов по своим биохимическим св ойствам относится к тогавирусам. Серологически тогавирусы делятся на д ве группы (А и В) , которые в настоящее время называются альфавирусами и фл авирусами соответственно. К числу тогавирусов относятся по меньшей мер е два вируса, не являющиеся арбовирусами, — вирус краснухи и вирус, повыш ающий в крови зараженного им животного содержание лактатдегидрогеназы .. Вирусы, содержащие минус — цепь РНК (класс V) : вирус везикулярного стомат ита Минус — РНК-вирусы подразделяются на три главные морфологические к атегории: рабдовирусы, парамиксовирусы и ортомиксовирусы. В плане биохи мической стратегии рабдовирусы и парамиксовирусы очень близки друг к д ругу и составляют большую часть хорошо изученных вирусов класса Vа. В дан ном разделе основное внимание будет уделено только одному рабдовирусу — вирусу везикулярного стоматита (ВВС) , так как он изучен наиболее детал ьно. Хотя ВВС и патогенен для крупного рогатого скота, вызываемые им забо левания протекают легко и не приводят к серьезным экономическим убытка м. В культурах клеток ВВС размножается быстро и урожай его достигает выс оких титров. Зараженные им клетки погибают. При заражении чувствительны х клеток другими рабдовирусами или парамиксивирусами обычо развиваетс я персистентная инфекция, не приводящая к гибели клеток. Поэтому такие с истемы вирус-клетка намного труднее поддаются изучению. Ортомиксовиру сы, из которых наиболее известными являются вирусы гриппа человека, имею т сегментированным геном, состоящий из ряда отдельных минус-цепей РНК. Вирион ВВС, подобно вирионам всех других тогавирусов, покрыт внешней обо лочкой, но в отличие от них имеет характерную форму пули. Само название «р абдовирусы» происходит от греческого корня, означающего «палочка» , и об условлено асимметричностью этих частиц. Пулеобразная форма вириона от ражает форму его нуклеокапсида, предоставляющего собой свернутую в цил индр спираль и содержащего одну молекулу РНК с мол. Весом 4 . 10 6 . Эта РНК не облада ет ни одним из характерных признаков м РНК вирусов эукариот: на ее 3-м конц е нет последовательности poly (А) , а на 5-м конце нет «шапочки» . Кроме того, она н е обладает инфекционностью. Ее функция состоит в том, что она служит март ицей для синтеза вирусных м РНК и, следовательно, является минус — цепью РНК. Нуклеокапсид ВВС представляет собой очень стабильную структуру, и н аходящаяся в нем РНК полностью защищена от действия рибонуклеазы. Нукле окапсид этого вируса инфекционен, но его удельная инфекционность очень мала. Вирион ВВС содержит пять различных белков, и других вирусных белко в в зараженных клетках не обнаруживается. Белок, на долю которого приход ится основная масса белков нуклеокапсида и вириона в целом, называется б елком N. Нуклеокапсид содержит небольшое количество еще двух белков, наз ываемых белками L и № 9. Они принимают участие в синтезе вирусной РНК. Прост ранство между нуклеокапсидом и липопротеидной оболочкой вириона запол нено молекулами еще одного вирусного белка, называемого белком М. Наконе ц, снаружи от двойного слоя липидов оболочки находится белок G, образующи й упорядоченную систему расположенных на поверхности вириона шипов. В отличие от рабдовирусов парамиксовирусы не имеют пулеобразной формы, а представляют собой неправильные сферы, что отражает менее упорядочен ную укладку их нуклеокапсидов. Внешние оболочки вирусов Общим свойством тогавирусов, минус-РНК-вирусо в и ретровирусов является наличие у них липопротеидной внешней оболочк и, окружающей рибонуклеопротеидную сердцевину. Механизм образования т акой оболочки у всех вирусов один и тот же: рибонуклеопротеид связываетс я с внутренней поверхностью измененного участка плазматической мембра ны клетки и при выходе из клетки окружается этой измененной мембраной. Т акой процесс называется почкованием, а образующаяся вирусная частица в тот период, когда она еще связана с плазматической мембраной, носит назв ание почки. На электронных микрофотографиях ультратонких срезов клето к эти почки очень хорошо видны, ибо они представляют собой характерно из мененные оболочки плазматической мембраны. Строение вириона В состав вирионов, имеющих внешнюю оболочку, входят тр и главных класса структурных белков: глинопротеиды, белки матрикса и бел ки нуклеокапсида. Макроструктура вириона определяется свойствами пове рхности двойного слоя липидов, окружающего нуклеокапсид. Наружная пове рхность двойного липидного слоя покрыта гликопротеидом, а внутренняя к онтактирует с белками матрикса или нуклеокапсида. Все липиды, содержащи еся во внешней оболочке вириона, имеют клеточное происхождение, так как не обнаружено какого-либо вирус-специфического обмена липидов. По своем у составу липиды вириона очень сходны с липидами плазматической мембра ны клетки-хозяина: в их число входят холестерин, гликолипиды и фосфолипи ды. Клетки различных видов существенно различаются между собой по липид ным компонентам плазматических мембран. Поэтому липидный состав вирус а, формирующегося в данной клетке, точно соответствует липидному состав у ее плазматической мембраны. Гликопротеиды, содержащиеся в оболочках различных вирусов, обладают ка к специфическими свойствами, так и свойствами, общими для всех вирусных гликопротеидов. Все они находятся на внешней поверхности вириона и могу т быть удалены под воздействием протеаз. Поскольку протеазы отщепляют о т интактных вирионов только гликопротеиды, ясно, что наружу из двойного слоя липидов выступают лишь эти молекулы вирусных белков. Следует отмет ить, что протеазы удаляют лишь часть молекулы гликопротеида. Другая ее ч асть — «ножка» , состоящая из высокогидрафобного полипептиада — по-вид имому, погружена в двойной липидный слой и недоступна для протеазы. Сборка вириона На первой стадии формирования вириона происходит синте з его индивидуальных белков. Белки каждого из трех классов синтезируютс я, по-видимому, независимо друг от друга и часто на отдельных м РНК. Гликопротеиды образуются на связанных с мембранами м РНК и в свободном с остоянии в клетках никогда не встречаются. Молекулы белка «созревают» п о мере их передвижения из шероховатого эндоплазматического ретикулума в гладкий, а затем, возможно, в аппарат Гольджи и, наконец, в плазматическу ю мембрану клетки. Присоединение углеводов к белкам происходит при пере мещении последних по внутриклеточным мембранам. В конце концов они выхо дят на поверхность клетки, где, вероятно, свободно плавают в жидком двойн ом липидном слое плазматической мембраны. Вирусы, содержащие двухцепочечную РНК (класс III) Вирусы данного класса бы ли обнаружены у плесеней, высший растений, насекомых и позвоночных живот ных. Ни один из этих вирусов не содержит липидов. Их капсиды состоят из дву х слоев — внутреннего (сердцевины) и наружного, образующего оболочку во круг сердцевины. В сердцевине находится множество сегментов двухцепоч ечной РНК и варьирующее число небольших олигонуклеотидов, не имеющих, по -видимому, никаких генетических функций. Наиболее тщательно изучены рео вирусы человека, которые, как правило, не вызывают каких-либо явных патол огических симптомов. Исключение составляют, по-видимому, реовирусоподо бные агенты, выделяемые при гастроэнтеритах у детей. Тем не менее эти вир усы часто выделяют из организма человека, причем в лабораторных условия х они хорошо размножаются. Некоторые данные получены также об отдельных вирусах растений и насекомых, содержащих двухцепочечную РНК. Размножение вирусов животных ДНК-содержащие вирусы и ретровирусы Поск ольку в нормальных клетках нет никаких эквивалентов генетических сист ем РНК-содержащих вирусов, такие вирусы способны размножаться лишь в том случае, если они синтезируют ферменты, необходимые для транскрипции и р епликации их генома. В случае ДНК-содержащих вирусов, напротив, синтез их м РНК происходит так же, как и м РНК нормальных клеток. Репликация их геном а и генома клетки формально также весьма сходны. Более того, транскрипци я и репликация ДНК большинства вирусов, так же как и клеточной ДНК происх одит в ядре. Сходство основных процессов у клеток и ДНК-вирусов наводит н а мысль, что для размножения последних нет никакой необходимости в индук ции каких-то особых ферментов, отсутствующих в незараженной клетке. Отсю да следует, что для размножения ДНК-вируса достаточно присутствия белко в его капсида, так что геном такого вируса вполне может состоять только и з генов, кодирующих его капсид. Следует, однако, подчеркнуть, что, хотя так ие простые ДНК-вирусы действительно существуют, жизненный цикл большин ства ДНК-вирусов значительно сложнее. Различные ДНК-вирусы очень сильно отличаются друг от друга как по величине, так и по сложности их строения. М олекулярный вес ДНК наименьших из них составляет всего 1,5х10 6 дальтон, а самых крупных — в 100 раз больше. По мере ув еличения вирусных геномов они становятся все сложнее и сложнее. Возраст ает общее число генов и усложняется механизм репликации ДНК. Поскольку мелкие ДНК-вирусы способны к интенсивному размножению, предс тавляется удивительным сам факт возникновения крупных ДНК-вирусов. Одн о из преимуществ, которое может получить вирус при увеличении его генома — это уменьшение зависимости от клетки. Парвовирусы Самыми простыми из всех известных вирусов, вероятно, являю тся парвовирусы. Их геном представлен одноцепочечной ДНК с мол. Весом вс его 1,5х10 6 дальтон. Однако для единственного кодируемого этим вирусом продукта — белка его капсида — даже эта малая молекула слишком велика. Размножение этого крошечного паразита, по-види мому, действительно полностью зависит от соответствующих систем клетк и-хозяина. Существует два основных класса парвовирусов — автономные и д ефектные. Все до сих пор известные автономные парвовирусы — это вирусы грызунов; для транскрипции, репликации и других функций эти вирусы испол ьзуют соответствующие ферменты клетки-хозяина. Дефектные парвовирусы размножаются лишь в клетках, которые заражены одновременно аденовирус ом, выполняющим некоторые необходимые функции. До сих пор не найдено нор мальных клеток, в которых могли бы размножаться дефектные парвовирусы. В клетках, находящихся в стационарной фазе, автономные парвовирусы не раз множаются, они размножаются лишь в клетках ДНК которых уже реплицируетс я, т.е. в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла. Это ограничение касается типа клеток, поражаемых данными вирусами. Парв овирусы вызывают аномалии развития у эмбрионов и дефекты растущих ткан ей у новорожденных. Они вызывают также нарушения функции кишечника, что, вероятно, является следствием их размножения в быстро делящихся клетка х крипт. Дефектные парвовирусы размножаются только в клетках, зараженных адено вирусом — помощником, и не зависят от фазы клеточного цикла. Их вирусом- п омощником могут быть только аденовирусы. Герпесвирусы также способны в ыполнять некоторые из необходимых функций вируса — помощника, однако п олные инфекционные частицы парвовирусов в этом случае не образуются. Им енно по этой причине дефектные парвовирусы называют также «аденоассоц иированными» вирусами (ААВ) . Одно из характерных различий между автономными и дефектными парвовиру сами состоит в том, что геном первых представлен уникальной одиночной це пью ДНК, а геном дефектных парвовирусов — эквимолярными количествами о дноцепочечных комплелянтарных друг другу молекул ДНК. При гибридизаци и одноцепочечные молекулы ДНК, выделенные из вирионов ААВ, легко превращ аются в молекулы двухцепочечных ДНК. Вирионы парвовирусов близки по вел ичине к рибососмам — их диаметр 20 нм. Не содержащие липидов капсиды этих вирусов состоят из трех полипептидов различной длины. Молекулярный вес самого большого из них 90000 дальтон. Судя по пептидной карте, малые полипепт иды представляют собой части большого; поэтому полагают, что вирусная м РНК кодирует только полипептид с мол. весом 90000. Паповавирусы Паповавирусы известны лучше других благодаря принадлеж ащим к этой группе подробно исследованным онкогенным вирусам — вирусу полиомы и SV40, которые размножаются лишь в очень узком кругу клеток млекоп итающих. Обычно при изучении онкогенных свойств этих вирусов, имеется в виду их способность трансформировать клетки in vitro — ими заражают клетки т ех видов, которые они трансформируют, но в которых не размножаются, а след овательно, и не вызывают их лизис. В состав группы паповавирусов, кроме вирусов полиомы и SV40, входит ряд друг их вирусов. Свое наименование паповавирусы — группа получила от назван ий трех вирусов: вируса кроличьей папилломы, вируса полиомы (по) и вакуоли зирующего (ва) обезъянеьего вируса, тип 40 (SV40) . У человека эти вирусы не вызыв ают заболеваний, хотя SV40 иногда заражает клетки человека. У людей широко р аспространены три других паповавируса — вирус JC, ВК и вирус бородавок. Пр едполагается, что вирус JC является этиологическим агентом прогрессирую щего дегенеративного заболевания центральной нервной системы человек а. Вирус ВК часто обнаруживают в моче лиц, принимавших иммунадепрессанты , однако пока его не связывают с какой-либо патологией у человека. Вирус бо родавок человека, как и вирусы папиллом животных, вызывает лишь доброкач ественную пролиферацию эпидермиса. Вирусы паполломы плохо размножаются в клеточных культурах, поэтому до с их пор изучены в основном, лишь их физические свойства. Установлено, что и х ДНК несколько крупнее, чем ДНК вирусов SV40 и полиомы. Аденовирусы Хотя в вирионах аденовирусов содержится в 608 раз больше ДНК, чем в паповавирусах, и геном аденовирусов кодирует соответственно боль шее число белков, циклы репродукции этих вирусов в основном сходны. Так, у аденовирусов, как и у паповавирусов, имеется механизм, контролирующий пе реключение синтеза ранних макромолекул на синтез поздних, а их м РНК. Так же считываются с обеих цепей вирусной ДНК. Однако ДНК аденовирусов — ли нейная молекула, и поэтому механизм ее репликации должен отличаться от м еханизма репликации ДНК паповавирусов. В отличие от ДНК паповавирусов ч астота рекомбинации ДНК аденовирусов достаточно велика, благодаря чем у последние можно изучать и методами формальной генетики. Разнообразие аденовирусов Аденовирусы выделены от самых разнообразны х видов животных. Более того, от каждого из этих видов выделено много разл ичных аденовирусов. Так, среди аденовирусов человека идентифицирован 31 серологический тип. Однако в молекулярно-биологическом аспекте аденов ирусы весьма сходны, поэтому при дальнейшем обсуждении мы не будем прово дить между ними различий. Аденовирусы в основном вызывают острые респир аторные заболевания; некоторые серотипы аденовирусов человека при вве дении хомячкам вызывают у них опухоли. Почти все штаммы аденовирусов спо собны вызывать трансформацию фибробластов крысы в культуре, но ни один и з этих вирусов не имеет отношения к злокачественным опухолям у человека . Из сказанного ясно, что аденовирусы представляют интерес и как инфекци онные агенты, вызывающие респираторные заболевания у человека, и как вир усы, способные вызывать опухоли, и как объекты молекулярно-биологически х исследований. Вирионы аденовирусов отличаются изяществом структуры. В синтезе вирус ных частиц участвуют 14 видов белков, а быть может, и больше. В это число вход ят и белки, из которых построены компоненты поверхности вириона — гексо ны, пентоны и фибриллы. Герпесвирусы Герпесивирусы, столь различные по характеру репродукции , но весьма сходные морфологически и по содержанию ДНК, составляют часть биохимически гомогенной группы. Наиболее детально изучены герпесвирус ы, вызывающие лизис зараженных клеток. К их числу относятся вирусы прост ого герпеса, типы 1 и 2 и ряд быстро размножающихся герпесвирусов животных . Из вирусов этой группы, не вызывающих лизиса, наиболее изучен вирус Эпшт ейна-Барр, вызывающий инфекционный мононуклеоз — этот вирус постоянно выделяют из клеток двух видов опухолей человека — лимфомы Беркитта и ка рциномы носоглотки. В отличие от вирусов простого герпеса типов 1 и 2, разм ножающихся в культурах многих клеток и вызывающих лизис, вирус Эпштейна- Барр заражает только В-лимфоциты приматов и размножается не во всех из н их. ДНК герпесвирусов кодирует не менее 49 различных белков, для синтеза кото рых используется почти вся кодирующая способность вирусного генома. Из учение физиологии столь сложной системы — задача далеко не легкая. Поксвирусы У всех ДНК-содержащих вирусов, о которых речь шла выше, ДНК си нтезируется в ядре зараженной клетки, там же и созревают их вирионы. Все с тадии размножения поксвирусов происходят только в цитоплазме. Следова тельно, репродукция поксвирусов происходит в совершенно иных условиях по сравнению с «ядерными» ДНК-содержащими вирусами. Известно большое ра знообразие поксвирусов. Наиболее важным из них для человека является ви рус натуральной оспы. Однако наиболее детально изучен вирус осповакцин ы и родственные ему вирусы кроличьей оспы и коровьей оспы. Все поксвирус ы имеют общий антиген. Автономность размножения поксвирусов Электронная микроскопия зараже нных клеток показывает, что процесс размножения поксвирусов ограничен цитоплазмой. Наиболее убедительно об этом свидетельствует тот факт, что почти весь цикл размножения вирусов этой группы может реализоваться в к летках, которые в результате воздействия на них цитохалазина В лишены яд ра. Заражение таких фрагментов приводит к синтезу в них вирусной ДНК и мн огих вирусных белков: вирионы же в безъядерных клетках не синтезируются . Следовательно, поксвирусы переносят центр функциональной активности клетки из ядра в цитоплазму. Можно ожидать, что для этого вирус должен обл адать обширной специфической информацией, и поксвирусы действительно такой информацией обладают, что выражается в числе кодируемых и синтези руемых ими белков. В полном соответствии с этим является то, что молекуля рный вес ДНК таких вирусов больше, чем у любого другого вируса животных, и что репродукция данного вируса связана с инициацией активности самых р азнообразных ферментов. Размножаясь в цитоплазме, поксвирусы во многом ближе к РНК-вирусам, чем к «ядерным» ДНК-вирусам. И действительно, подобно некоторым РНК-вирусам, размножение поксвирусов как таковое начинается с транскрипции ДНК вириона РНК-полимеразой, содержащейся в самом вирион е, вирион содержит все ферменты, необходимые для превращения РНК-предшес твенника в функционально активные м РНК. Ретровирусы Ретровирусы обладают свойствами как РНК, так и ДНК-содержа щих вирусов. В вирионе ретровирусов содержится РНК, однако внутри клетки они существуют в виде ДНК, интегрированной с геномом клетки-хозяина. По с уществу, РНК этих вирусов, проникая в клетку, превращается в ее гены, котор ые могут передаваться потомкам в виде стабильных интегрированных моле кул ДНК. ДНК-вирусов, которые наследовались бы подобным образом, не обнар ужено, так как все ДНК- содержащие вирусы вызывают продуктивную инфекцию и убивают клетки, в которых они размножаются. Включаться в геном клетки-х озяина ДНК-содержащие вирусы могут только в случаях «непродуктивных» в ирусных инфекций. Ретровирусы, напротив, размножаясь путем почкования, п одобно многим другим РНК- вирусам, поддерживают продуктивную инфекцию, н е вызывая гибели клетки-хозяина. Из сказанного ясно, что центральная про блема, без решения которой нельзя понять механизм репродукции этих виру сов, состоит в том, каким образом они превращаются из РНК-вирусов в ДНК-ген ы; этот процесс был назван обратной транскрипцией, ибо здесь направление потока биологической информации изменено на обратное. Обнаружено много самых разнообразных ретровирусов. Некоторые из них сп особны вызывать злокачественные опухоли. Лучше других изучены вирус са ркомы Рауса и вирусы, вызывающие лейкозы у кур и мышей. Из всех известных Р НК-содержащих вирусов злокачественные опухоли могут вызвать только ре тровирусы. Именно поэтому их принято называть общим термином «опухолер одные РНК-вирусы» , хотя многие ретровирусы не вызывают ни злокачественн ых, ни каких-либо иных клинически выраженных заболеваний. Поэтому в един ую классификационную группу их объединяет лишь способ репродукции. Под обно другим группа вирусов, различные виды ретровирусов также отличают ся друг от друга по размеру и морфологическим особенностям вирионов, чис лу белков, а также по кругу чувствительных хозяев. Влияние вирусной инфекции на клеточном уровне Различают три вида возде йствий, оказываемых вирусами животных на клетки. Легче всего выявляется деструктивный, или цитолитический, эффект, для которого характерно обши рное повреждение множества различных клеточных органелл. Вероятно, вир ус — специфические макромолекулы вызывают первичное повреждение, вле кущее за собой цепь вторичных деструктивных процессов, в которых участв уют уже продукты метаболизма самой клетки. На другом конце спектра возмо жных последствий находится явление трансформации, когда зараженная ви русом клетка приобретает способность к неограниченному делению. По-вид имому, это результат устойчивой интеграции вирусного генома или его час ти с геномом клетки, которая не приводит к ее гибели. Трансформированная клетка часто выходит из-под контроля механизмов, регулирующих клеточно е деление. Действие некоторых вирусов, геном которых не включается в хро мосомы клеток, занимает промежуточное положение между резко выраженны м деструктивным эффектом и трансформирующим действием. В этих случаях з араженные клетки еще некоторое время функционируют и по меньшей мере в о дном случае — при заражении парамиксовирусами — продолжают расти и де литься, одновременно продуцируя вирус («персистентная инфекция» ) . Возм ожна еще одна категория реакции клеток, при которой можно говорить об ин дуктивном действии вируса. Многие вирусы способны индуцировать образо вание в зараженной клетке белков, кодируемых не вирусным, а клеточным ге номом, но, по-видимому, синтезируемых клетками в ответ на вирусную инфекц ию. Этот тип реакции не обязательно связан с тем или иным конечным резуль татом взаимодействия вируса с клеткой. Цитолическое действие вирусов: биохимические данные Зная, что многие в ирусы вызывают резкие деструктивные изменения клеток-хозяев, биохимик и заинтересовались вопросом, прекращается ли при этом синтез всех клето чных белков РНК и ДНК, и если да, то в какой последовательности. Ответы сво дятся к следующему: 1. Вероятно, различные вирусы подавляют синтез клето чных белков, используя разные механизмы. Степень и время этого подавлени я тоже неодинаковы. 2. Нередко вирус блокирует накопление клеточной РНК, приостанавливая пр оцессинг пре-р РНК, но никак не влияя на ее синтез. Образование клеточной т РНК часто не снижается. Во многих случаях бывает нарушен синтез клеточн ых м РНК, но механизм этого нарушения совершенно неясен. 3. Нередко бывает подавлена инициация синтеза клеточной ДНК, однако при некоторых вирусных инфекциях клетки, уже вошедшие в фазу S, могут заверши ть цикл синтеза ДНК, а клетки, прошедшие через фазу S, могут пройти и через м итоз. Ингибирование синтеза клеточной ДНК- это вероятно, вторичное следс твие прекращение синтеза белка, так как синтез ДНК идет лишь в том случае, если одновременно продолжается синтез белка. Интерферон Рассматривая здесь интерферон только как белок, синтезируе мый клеткой в ответ на вирусную инфекцию и придающий устойчивость к инфе кции другим клеткам, это значило бы игнорировать историю открытия интер ферона и связь его с давно известным явлением интерференции вирусов. Уже давно было известно, что животное часто приобретает защиту от вируле нтного действия одного вируса в результате одновременного или предшес твующего заражения менее вирулентным штаммом того же вируса или каким-л ибо другим, неродственным вирусом. Впервые это явление было подвергнуто количественному анализу при изучении тормозящего действия ненейротро пных штаммов вируса гриппа на размножение нейратропного штамма. Такое д ействие оказывает не только живой вирус: образование инфекционного вир уса гриппа в куриных эмбрионах вирусом гриппа, облученным ультрафиолет ом. Айзекс и Линдеман обнаружили, что аллантоисная жидкость куриных эмбрио нов, в которые был введен облученный вирус, тоже обладает интерферирующе й активностью. Вещество, ответственное за эту активность, было названо и нтерфероном. Оно блокирует репродукцию самых различных РНК- и ДНК- вирус ов как в куриных эмбрионах, так и в культурах клеток. Интерферон образует ся и в организме многих животных. Это также синтезирует in vitro клетки самых р азличных типов, как нормальные, так и злокачественные, хотя и в весьма раз ных количествах. Особенно хорошими продуцентами интерферона могут слу жить клетки Lмыши и специально выведенная линия фибробластов человека. Б ольшие количества интерферона вырабатывают также циркулирующее в кров и лейкоциты. Наконец, некоторые ткани, по-видимому, накапливают интерфер он, так как введение в организм различных неспецифических токсичных вещ еств, например бактериального эндотоксина, быстро приводит к появлению в сыворотке крови больших количеств вещества, тормозящего размножение вирусов — скорее всего интерферона. Одно время полагали, что интерфероны строго водоспецифичны, однако это н еверно. Например, интерфероны человека и обезьяны защищают от вирусов ка к клетки человека, так и клетки обезьян, позднее было обнаружено, что это о тносится и к интерферонам более далеких друг от друга видов, например че ловека и различных грызунов. Однако эффективность гетерологичных инте рферонов сильно варьирует. Степень защиты того или иного вируса определяется типом клеток, а не инт ерферона. Интерферон человека защищает клетки человека от вируса везик улярного стоматита лучше, чем от вируса леса Семлики, и такое же соотноше ние наблюдается при защите клеток человека интерфероном обезьяны. Напр отив, клетки обезьяны получают большую защиту от второго из этих вирусов , чем от первого, независимо от того, какой из двух интерферонов к ним доба вляют. Интерферон — очень активный белок. Человеческий интерферон уже в конце нтрации 10 -11 М препятствует размножению вир уса везикулярного стоматита в фибробластах человека. Для сравнения нап омним, что полипептидные гормоны, например инсулин, глюкагон и другие, фи зиологически активны в концентрациях от 5х10 -10 до 1х10 -8 М. Даже без полной очистки интерферона можно продемонстрировать его гете рогенность. Интерфероны, продуцируемые клетками одного вида, например ч еловека, могут защищать от вирусов клетки других, весьма отдаленных видо в, например кролика. Стюарт и Десмайтер определили молекулярный вес инте рферона человеческих лейкоцитов, защищавшего от вирусов клетки как чел овека, так и кролика. В неочищенных препаратах они обнаружили два вида ак тивных молекул с мол. Весами около 21000 и 15000 соответственно. Активность меньш е молекул в отношении клеток человека оказалась в 20 раз большей, чем в отн ошении клеток кролика, тогда как более крупные молекулы были в обоих слу чаях одинаково активны. Кроме того, интерферон с мол. Весом 15000 полностью ин активировался под действием В-меркаптоэтанола, который разрывает дису льфидные мостики, а активность интерферона с мол. Весом 21000 не изменялась. Т аким образом многие клетки (если не большинство их) продуцируют два вида полипептидов, обладающих активностью интерферона. Индукция синтеза ин терферона и индукция интерфероном «противовирусного» состояния клетк и — два тесно связанных между собой, но, вероятно различных явления. Клет ки, приобретающие устойчивость к вирусам, могут продуцировать интерфер он. Однако за устойчивость клеток почти наверняка ответствен не сам инте рферон, а какой-то другой белок, ибо от момента добавления интерферона до полного развития у них устойчивости к вирусам проходит много часов, и по сле этого клетки могут и не продуцировать обнаружимых количеств интерф ерона. Тем не менее добавление вируса к клеткам, защищенным с помощью инт ерферона, может привести к дополнительной выработке интерферона этими клетками. Индукция интерфероном устойчивости клеток к вирусам Клетки в культуре in vitro, в которых синтез интерферона индуцирован убитым вирусом или полинук леотидами, также становятся устойчивыми к вирусам. Кроме того, многие кл етки, подвергшиеся воздействию интерферона, при заражении их вирусом вы рабатывают очень большие добавочные количества этого вещества. Однако некоторые клетки обезьян хотя и становятся устойчивыми к вирусам после воздействия интерферона обезьяны, не могут вырабатывать обнаружимых к оличеств интерферона и не приобретают устойчивости к вирусам после воз действия poly (е) poly (с) и других двухцепочечных РНК. Кроме того, клетки этой лини и в отличие от большинства других почечных клеток обезьян после заражен ия их вирусом краснухи не становятся устойчивыми по многим другим вирус ам. Показано также, что в тех случаях, когда индукция интерферона при помо щи poly(е) poly (с) сочетается с добавлением к культуре анти-интерфероновых антит ел, клетки не становятся устойчивыми к вирусной инфекции. Все этим данные позволяют предполагать, что для создания устойчивости к вирусам нужно, чтобы на поверхности клетки оказались небольшие количес тва интерферона. Возможно, что при индукции устойчивости с помощью poly (е) poly ( с) вначале образуется интерферон, а затем уже этот интерферон индуцирует состояние устойчивости. Однако после того как это состояние полностью с формировалось, образования клетками интерферона обнаружить не удается и если не прибавляют снова интерферон, устойчивость исчезает. Результат ы ряда других экспериментов также подкрепляют гипотезу о том, что интерф ерон индуцирует устойчивость клеток к вирусам, взаимодействуя с клеточ ной мембраной. Молекулярная основа устойчивости клеток к вирусам Хотя устойчивость, индуциорованная интерфероном, защищает клетки от самых различных ДНК Р НК-вирусов, степень защиты от разных вирусов неодинакова. Кроме того, для достижения сходной степени защиты клеток одной и той же культуры от разл ичных вирусов нужны различные количества интерферона. Миксовирусы, тог авирусы и вирус осповакцины, у которых имеется оболочка, содержащая липи ды, более чувствительны к действию интерферона, чем аденовирусы и энтеро вирусы. Однако ряд вирусов, обладающих оболочкой, в том числе вирусы герп еса и ньюкаслской болезни, более устойчивы к интерферону. Наиболее устой чивы мелкие РНК-содержание икосаэдрические вирусы. Интерферон блокиру ет вирусную инфекцию после адсорбции вируса и проникновения его в клетк у. Поскольку интерферон может подавлять репликацию как РНК-, так и ДНК-сод ержащих вирусов, логично предположить, что он ингибирует трансляцию вир усных м РНК на рибосомах клетки — процесс, общий для всех вирусов. Такого рода эффект мог бы реализоваться при участии противовирусного белка, сп особного отличать клеточные м РНК от вирусных. Однако при изучении синте за белка в экстрактах клеток, обработанных интерфероном, не было получен о убедительных данных о том, что такие системы нормально транслируют кле точные м РНК, но не транслируют вирусных м РНК. Таким образом, несмотря на привлекательность простейшей гипотезы, объясняющей действие интерфер она избирательным подавлением трансляции вирусных м РНК, нужно признат ь, что ни один простой механизм не согласуется со всеми известными данны ми об устойчивости клеток к вирусной инфекции. В клетках, подвергшихся действию интерферона, а затем зараженных вирусо м осповакцины, синтез «ранних» м РНК вирионной ДНК-зависимой РНК-полимер азой не подавляется, но эти м РНК не транслируются и синтеза ранних вирус ных белков не происходит. При заражении клеток реовирусами большие коли чества интерферона тоже лишь очень незначительно подавляют синтез вир усных м РНК и намного сильнее ингибируют их трансляцию Однако ни в том, ни в другом случае не было показано, что вирусные м РНК подвергались надлеж ащей модификации — что к 3-концу присоединялась метилированная «шапочк а» или (в случае вируса осповакцины) к 3-концу добавлялась цепочка poly (А) . Поэ тому возможность, что индуцированная устойчивость к вирусам связана не с изменением аппарата трансляции, а с образованием неполноценных вирус ных м РНК. Интерференция вирусов без участия интерферона Некоторые вирусные инф екции исключают возможность последующего размножения в тех же клетках других неродственных, а в некоторых случаях и родственных вирусов. Это я вление было названо интерференцией. В отличие от действия интерферона о но связано не с реакцией генома клетки на вирусную инфекцию, а с тем, что п ервый вирус образует в клетке специфические продукты, препятствующие р азмножению в той же клетке другого вируса. Было исследовано множество па рных сочетаний различных вирусов: вероятно, в большинстве случаев интер ференция обусловлена блокадой трансляции м РНК второго вируса. Однако в некоторых случаях первый вирус блокирует способность второго надлежащ им образом проникать через плазматическую мембрану клетки. Разнообразие возбудителей и вызываемых ими заболеваний Ни одна из поп ыток построить простую систему классификации патогенных вирусов пока не увенчалась успехом. Нет такого клинического синдрома, который мог бы быть вызван вирусом только одного типа, и нет такой группы вирусов, котор ая поражала бы только одну определенную ткань. Например, легко протекающ ие заболевания верхних дыхательных путей могут быть вызваны пикорнави русами (риновирусами, вызывающими так называемые простудные заболеван ия) , аденовирусами, миксовирусами (вирусом гриппа) парамиксовирусами (ре спираторно-синцитиальным вирусом) и, вероятно, другими, например реовиру сами, обладающими оболочкой, — короновирусами. Печень могут поражать то гавирусы (например, вирус желтой лихорадки) и вирус гепатита (он, вероятно , содержит ДНК и липиды) . Заболевания нервной системы, приводящие к парали чам и смерти, могут вызвать тогавирусы) к этой группе относятся десятки р азличных возбудителей энцефалита) , рабдовирусы (например, вирус бешенст ва) , пикорнавирусы (вирус полиомиелита) и ряда других. К системным вирусны м болезням, сопровождающимся обильными кожными высыпаниями, относятся оспа — едва ли не самая грозная из вирусных инфекций и такие распростра ненные и легкие болезни, как корь, ветряная оспа, краснуха. Вирус оспы, кот орый еще недавно губил множество людей в развивающихся странах, являетс я типичным представителем группы поксвирусов. Вирус кори — возбудитель быстро проходящего заболевания, при котором, о днако иногда поражается и центральная нервная система — относится к па рамиксовирусам, а вирус краснухи, обычно легкого заболевания, проявляющ егося в основном сыпью, — к тогавирусам. Болезнь, называемая «ветряной о спой» на самом деле вызывается герпесвирусом, совсем не родственным вир усу оспы. Этол в высшей степени контагиозный вирус, почти неизменно вызы вающий клинически явно выраженное заболевание. Персистентные инфекции Большинство упомянутых выше вирусных инфекци й приводит к развитию соответствующих симптомов в течение нескольких д ней или максимум двух-трех недель. Заболевания эти острые, т.е. начинаются они более или менее внезапно и длятся определенное, достаточно короткое время. Однако во многих других случаях вирусы весьма долго взаимодейств уют с организмом животного или человека. Различают следующие формы таки х инфекций: 1) латентные инфекции, при которых содержащийся в организме ви рус лишь время от времени вызывает характерные поражения, вскоре исчеза ющие сами собой. Из пораженных участков можно выделить вирус, но потом он становится «латентным» , т.е. его уже выделить не удается. 2) хронические инфекции — длительно протекающие заболевания, при которы х вирус присутствует постоянно. Симптомы могут полностью отсутствоват ь или же могут вызываться комплексами вирус-антитело либо взаимодейств ием противовирусных антител с зараженными клетками, вероятнее всего с и х мембранами. 3) медленные инфекции — медленно прогрессирующие заразные заболевания с исключительно длинным латентным периодом. Иммунные реакции Наиболее специфическая реакция на вирусную инфекцию — это, конечно, выработка антител. Циркулирующие антитела, по-видимому, и грают важную роль в предупреждении некоторых вирусных инфекций. Наприм ер, как после заболеваний, вызываемых многими вирусами, так и после вакци нации наблюдается длительный иммунитет и в сыворотке крови выявляются специфические антитела. Циркулирующие антитела при ряде вирусных инфе кций, вероятно, служат барьером, препятствующим распространению вируса по всему организму. На это указывает тот факт, что при кори и свинке раннее введение глобулина блокирует дальнейшее развитие болезни. Вероятно, пр и естественно протекающих заболеваниях быстрое появление антител в кр ови может препятствовать распространению вируса из первичного очага и нфекций. После инъекции кроликам вируса полиомиелита уже через 24 часа с п омощью достаточно чувствительного метода в сыворотке можно обнаружить антитела к этому вирусу. Поэтому вполне возможно, что именно такие ранни е антитела ответственны за тот факт, что у человека размножение этого ви руса в глотке и кишечнике в большинстве случаев не ведет к его распростр анению по всему организму. Как полагают по той же причине немедленная ва кцинация укушенного больным животным человека защищает его центральну ю нервную систему от поражения вирусом бешенства. Опухолеродные вирусы За годы, прошедшие с тех пор, как впервые был устан овлен факт возникновения вирусных сарком у кур, многочисленными исслед ователями у разных видов позвоночных были обнаружены онкогенные вирус ы, принадлежащие к двум группам: ДНК — содержащие и ретровирусы. Среди он когенных ДНК-вирусов есть паковавирусы, адековирусы и герпесвирусы. Из Р НК-содержащих вирусов опухоли вызывают только ретровирусы. Диапазон опухолей, вызываемых онкогенными вирусами, необычайно широк. Х отя вирус полиомы вызывает главным образом опухоли слюнных желез, уже са мо его название показывает, что он способен вызывать и многие другие опу холи. Ретровирусы вызывают главным образом лейкозы и саркомы, которые не редко бывают причиной опухолей молочной железы и ряда других органов. Хо тя рак — это заболевание целого организма, аналогичное по сути явление, называемое трансформацией, наблюдается и в культурах клеток. Такие сист емы используются в качестве моделей для изучения онкогенных вирусов. Сп особность трансформировать клетки in vitro лежит в основе методов количеств енного определения многих онкогенных вирусов. Эти же системы использую тся и для сравнительного изучения физиологии нормальных и опухолевых к леток. Что такое трансформированная клетка? Один из способов получения популяции трансформированных клеток состои т в заражении нормальных клеток онкогенным вирусом, например вирусом са ркомы Рауса или вирусом полиомы, и последующем выделении колоний измене нных клеток. Изменения могут касаться морфологии клеток (например, их ок ругление) и характера роста (“наползание” клеток друг на друга в отличие от нормального роста в виде однослойной культуры или приобретение спос обности размножаться в полужидкой среде, в которой нормальные клетки не размножаются) . Существуют и иные критерии отбора трансформированных клеток. Как прави ло, клетки отобранные по одному из критериев, удовлетворяют и большинств у других. Способностью трансформировать клетки in vitro обладает большинств о онкогенных ДНК-вирусов и вызывающих саркомы ретровирусов. Ретровирус ы, вызывающие лейкозы, напротив, размножаются в клетках, не вызывая их тра нсформации. Получив культуру клеток, признанных трансформированными п о одному из упомянутых критериев, следует сопоставить их с нормальными к летками по ряду других параметров. Во многих книгах такого рода перечисл ены те изменения свойств клеток, которые происходят в процессе трансфор мации. Известны две большие группы изменений: 1) изменения регуляции рост а и продолжительности жизни, и 2) изменения клеточной поверхности (плазма тической мембраны) . Изменения свойств клеток, определяющие рост и размножение Большинство нормальных клеток, размножаясь, прикрепляются к субстрату (к стеклянной или пластмассовой стенке сосуда) . Нормальные клетки перестают делиться еще до истощения питательной Среды. Они остаются прикрепленными к субст рату жизнеспособными покоящимися клетками. Если такие клетки снять с су бстрата и поместить в условия пониженной плотности популяции, они начну т снова делиться. На первый взгляд кажется, что клетки нормальной культу ры, рост которой прекратился, располагаются в виде монослоя. Однако на са мом деле в таких культурах не перекрываются лишь наиболее заметные част и клеток — их ядро, тогда как цитоплазма, напротив, перекрывается на весь ма значительной площади; тем не менее, такие культуры принято называть о днослойными. В отличие от нормальных большинство трансформированных клеток не пере ходят в стадию покоя, а продолжают непрерывно делиться. Это, по-видимому, н аиболее характерная особенность трансформированных клеток. Непрерывн о делящиеся клетки не реагируют на контакт с соседними клетками: натолкн увшись на своем пути на другую клетку, они не прекращают свое деления: рас тут они хаотически, подползая под другие клетки или наползая на них, в рез ультате чего и образуются многослойные бесформенные массы. Трансформированные клетки действительно выглядят злокачественными п о сравнению с нормальными. Из сопоставления беспорядочной организации трансформированных клеток со строго упорядоченной организацией норма льных создается впечатление, что нормальная клетка “ощущает” момент ко нтакта с соседней, что и приводит к остановке деления ; трансформированн ые же клетки не обладают таким “сесорным” механизмом и поэтому растут, н аползая друг на друга. Методом замедленной киносъемки было показано, что в “разреженной” нормальной культуре при встрече двух клеток происходи т остановка одной из них или обеих, а затем их движение продолжается, но в другом направлении. Этот хорошо изученный феномен известен как контакт ное торможение. В культуре трансформированных клеток этого не наблюдае тся. Именно благодаря контактному торможению культуры нормальных клет ок представляют собой упорядоченные однослойные системы. Более вероятно, что критическим фактором является не контакт с соседним и клетками, а нехватка каких-то лимитирующих факторов, необходимых для р азмножения. Полагают: что роль таких факторов играют вещества, содержащи еся в сыворотке крови, прибавление которой к культуре поддерживает клет очное деление. Установлено, что оптимальная концентрация сыворотки для размножения трансформированных клеток значительно меньше, чем для раз множения нормальных клеток. Для понимания сущности трансформации очен ь важен следующий факт. Подавляющее большинство нормальных клеток разм ножается лишь при условии прикрепления к плотному субстрату. Трансформ ированные клетки, напротив, размножаются и образуют колонии и в отсутств ие такой опоры, например, будучи суспендированы в геле-агаровом метилцел люлозном. Этим свойством пользуются для непосредственного отбора тран сформированных клеток. Согласно данному методу, из популяции нормальны х клеток, зараженных трансформирующим вирусом, отбирают отдельные клет ки и высеивают в среду с агаром, выросшие в данной среде колонии состоят и з трансформированных клеток. Изменения свойств поверхности Заражение клеток трансформирующими ви русами приводит не только к упомянутым выше изменениям их морфологии и с пособности к размножению, но и к резко выраженным биохимическим и биофиз ическим изменениям их строения и функций. До сих пор объектом большинств а таких исследований была плазматическая мембрана, ибо не исключена воз можность, что в основе трансформации клеток лежат изменения строения и с войств именно их плазматической мембраны, хотя не менее существенные из менения происходят и в других системах. К числу первых изменений, наблюд аемых в таких клетках, относятся изменения их функций, и в частности усил ение транспорта сахара. Другое изменение — повышение аглютинабельности клеток под действием лектиков, например, конканавалика А. Лектины — это природные вещества р астительного происхождения, поливалентные макромолекулы которых спец ифически связывают определенные углеводы. Образуя поперечные связи ме жду молекулами гликопротеидов клеточной поверхности, они вызывают агг лютинацию клеток. Почти все опухолевые клетки значительно легче агглют инируются под действием лектинов, чем их нормальные предшественники. Пл азматические мембраны нормальных и трансформированных клеток отличаю тся друг от друга по целому ряду свойств. Так, в плазматической мембране т расформированных клеток повышено содержание гиалуроновой кислоты и св язанной с белками сиаловой кислоты, а содержание ганглиозидов, напротив , понижено. Так называемый LETS-белок (с мол. весом 250 000) , в норме один из главных б елков плазматической мембраны, в трансформированных клетках отсутству ет. Поверхность трансформированных клеток также более гофрирована, чем у нормальных клеток. Еще одним результатом трансформации клетки является повышение подвижн ости поверхностных белков, связывающих конкавалин А. Сшивание белков плазматической мембраны под действием этого лектика п риводит к их слиянию с образованием агрегатов — “пятен” . При одной и той же концентрации конкавалина образование пятен у трансформированных кл еток значительно усилено по сравнению с нормальными. Повышенная подвиж ность поверхностных белков, по всей вероятности, обусловлена разрушени ем цитоскелета, а не изменением микровязкости липидов. Повышенной подви жностью поверхностных белков, возможно, объясняется большая склонност ь опухолевых клеток (по сравнению с нормальными) к аглютинации под дейст вием лектинов. Агрегаты лектин — рецептор на поверхности трансформиро ванных клеток служат местами формирования прочных связей между клетка ми ; на поверхности нормальных клеток лектины реагируют с рецепторами не столь эффективно, и потому межклеточные связи не столь прочны. Одно из важных свойств опухолевых клеток — их инвазивность. Трансформи рованным клеткам также присуща инвазивность, о чем свидетельствует спо собность их проникать сквозь хориоллантоисную мембрану куриного эмбри она. Ни клетки первичных культур, ни клетки стабильных линий не обладают такой способностью. Возможно, что способность к инвазии является следст вием вызванных вирусом изменений плазматической мембраны и (или) способ ности клеток выделять протеазы во внеклеточную среду. Различия между но рмальными и трансформированными клетками далеко не исчерпываются разл ичиями в свойствах их плазматических мембран. Так, заражение куриного эм бриона вирусом саркомы Рауса ведет к транскрипции генов, кодирующих син тез фетального гемоглобина, — факт прямого влияния трансформации на фу нкцию генов. Пожалуй, правильнее всего будет предположить, что трансформ ацию клетки вызывают продукты вирусных генов, которые действуют как общ ие депрессоры, включающие транскрипцию обширных областей клетки. Именн о эти деприссированные белки в конечном счете и ответственны за способн ость трансформированных клеток непрерывно размножаться в тех условиях , в которых деление нормальных клеток прекращается. Вирусная генетическая информация в трансформированных клетках Все тр ансформированные вирусом клетки содержат его генетический материал. З а исключением ДНК вируса ЭБ, который поддерживается в трансформированн ых им лимфоцитах в виде плазмиды, вирусная ДНК ковалентно интегрирована с ДНК клетки — хозяина. Что касается ретровирусов, то интеграция провир уса с геномом клетки вообще является естественной стадией их репродукт ивного цикла. В отношении ДНК опухолевых вирусов, напротив, нет данных об обязательном участии интеграции в их литическом цикле, хотя при продукт ивной инфекции в таких зараженных клетках обнаружены нуклеотидные пос ледовательности, состоящие из фрагментов вирусной и клеточной ДНК. Наиболее убедительные доказательства линейной интеграции вирусной и к леточной ДНК представили Ботган и др. Эти исследователи расщепляли рест рикционными пидонуклеазами ДНК клеток, трансформированных вирусом SV 40, и получали фрагменты, которые содержали среди клеточных нуклеотидных по следовательностей полные интегрированные с ними геномы вируса. Эти авт оры установили также последовательность расположения в геноме вируса выделенных фрагментов ДНК. В результате было обнаружено, что в каждой из исследованных клеточных линий кольцевая ДНК вируса расщеплялась в раз ных точках и встраивалась в разные области клеточной ДНК. Таким образом, в отличие от строго локализованной интеграции генома фага Л с бактериал ьным геномоминтеграция генома SV 40 с геномом клетки — хозяина скорее всег о представляет собой процесс неспецифический. в большинстве случаев в т рансформированных клетках обнаруживаются лишь фрагменты вирусной ДНК . В клетках, трансформированных ДНК вирусами, содержится вирус специфиче ская РНК. Используя сыворотки животных с опухолями, индуцированными соо тветствующими вирусами, методом флуоресцирующих антител установили, ч то в трансформированных клетках содержатся вирусные антигены. Так, в кле тках, трансформированных паповавирусами, всегда содержится Т-антиген-б елок, синтезируемый на ранней стадии литического цикла вируса. Следоват ельно, в трансформированных вирусами клетках содержатся вирусные ДНК, Р НК и белки ; это наводит на мысль, что за трансформированное состояние отв етственны молекулы, кодируемые геномом вируса. Роль трансформации при литической инфекции Согласно общепринятым взг лядам, способность вируса вызывать заболевание — это всего лишь побочн ый эффект работы механизмов, лежащих в основе размножения вируса. Для са мого вируса нет очевидной “необходимости” в том, чтобы вызывать симптом ы того или иного специфического заболевания у организма — хозяина. Быть может, в основе развития у вирусов способности вызывать опухоли лежит т от факт, что в делящихся клетках вирусы размножаются лучше, чем в неделящ ихся. По-видимому, именно на этой основе развилась характерная для онког енных вирусов способность побуждать клетки к росту и делению. По крайней мере в отношении паповавирусов и аденовирусов такое объяснение звучит весьма убедительно: эти вирусы, проникая в клетки, вскоре индуцируют син тез ДНК, ибо синтез ДНК является одной из стадий их литического цикла. Вер оятно, гены вируса, продукты которых ответственны за индукцию синтеза ДН К, — это те же самые гены, которые ответственны за трансформацию клетки. Т аким образом, онкогенные свойства этих вирусов могут быть прямым следст вием работы механизма их репликации. Поскольку ДНК — содержащие вирусы трансформируют клетки только при тех условиях, при которых сами размнож аться не могут, их способность превращать нормальные клетки в трансформ ированные, т.е. в клетки способные к беспрерывному делению, может и не игра ть роли в их собственном размножении. Более того, вариабельность точек и нтеграции вирусной и клеточной ДНК наводит на мысль, что интеграция их г еномов развилась в процессе эволюции случайно, а не как необходимая стад ия. И действительно, в естественных условиях не описано случаев злокачес твенной опухоли, вызываемой паповирусами, хотя доброкачественные опух оли, например бородавки у человека и папилломы у кроликов, эти вирусы выз ывают. Индукция опухолей Реализация способности вируса вызывать образовани е опухолей зависит от многих факторов. Одним из критических факторов мог ут быть свойства самого вируса: например, избирательной способностью вы зывать опухоли молочных желез обладает лишь один класс ретровирусов. Оп ределяющим фактором могут быть и свойства клеток — мишеней, например на личие на их поверхности соответствующих неблокированных рецепторов ил и присутствие внутриклеточных ограничивающих факторов. Конечный резул ьтат может определяться и свойствами тканей, не содержащих клеток — миш еней для данного вируса. В качестве примера можно указать на способность организма — хозяина к иммунной реакции на данный вирус или зараженные им клетки. Чтобы заражение организма вирусом привело к возникновению оп ухоли, все факторы, имеющие отношение к этому процессу, в том числе физиол огические и генетические, способные блокировать индукцию опухоли или е е развитие, должны быть представлены в пермиссивном варианте. Первым усл овием реализации вирусного онкогена является наличие в организме хозя ина чувствительных к данному вирусу клеток. Когда речь идет о вирусах с у зким кругом чувствительных клеток — мишеней (к числу таких относится, н апример, вирус лейкоза Френд, который специфически поражает только незр елые клетки мышей) , следует иметь в виду, что наличие в организме чувствит ельных клеток может зависеть и от возраста или физиологического состоя ния. Возможен и вариант, при котором в организме животного имеются клетки-миш ени, однако рецепторы вирусов блокированы. Ситуация такого рода возника ет, например, когда рецепторы, предназначенные для связывания с данным в ирусом, блокированы вирусными глико-протеидами родственного ему эндог енного ретровируса, находящегося в клетке — мишени. Онкоген под влияние м унаследованного вируса не является простым результатом индукции лат ентного генома клетки — мишени. Более вероятно, что для этого соответст вующий вирус должен попасть в клетку — мишень, распространяясь по орган изму из какого-то исходного пункта, где происходит индукция. Прямым свид етельством экзогенной инфекции клеток при наследственном лейкозе явля ется факт увеличенного числа вирусных генов в опухолевых тканях. Иммунн ая система организма реагирует на опухолевые клетки лишь в том случае, е сли они имеют новые поверхностные антигены. Если животное предваритель но иммунизировать клетками опухоли, индуцированной паповирусом, то дру гая опухоль, индуцированная тем же вирусом, у него при имплантации оттор гается — свидетельство того, что данные вирусы вызывают на поверхности трансформированных ими клеток образование специфического опухолевог о трансплантационного антигена. Этот антиген является вирус — специфи ческим. Так, вирус полиомы и SV 40 индуцируют различные трансплантационные антигены. Вирусы и злокачественные опухоли у человека Одним из аргументов проти в роли вирусов в возникновении большинства злокачественных опухолей у человека считается тот факт, что в подавляющем большинстве случаев злок ачественные опухоли не заразны, тогда как при вирусной этиологии можно о жидать передачи от человека к человеку. Если, однако, допустим, что в возни кновении опухолей играет роль активация наследуемых вирусов экзогенны ми факторами, то следует ожидать, что будут выявлены факты наследственно го предрасположения к злокачественным опухолям. Такое предрасположени е к развитию некоторых опухолей действительно обнаружено, но этому можн о найти различные объяснения. Несмотря на 10 лет интенсивной работы, напра вляемой специальными правительственными программами, связь между злок ачественными опухолями у человека и вирусами все еще остается проблема тичной. Представляется в высшей степени странным, что онкогенные вирусы , которые играют столь очевидную роль в возникновении опухолей у самых р азных животных, должны почему-то “обходить” человек Взаимодействие ме жду вирусами растений и их хозяевами Экспериментальные системы До неда внего времени большая часть исследований, касающихся размножения виру сов растений и других аспектов взаимодействия этих вирусов с их хозяева ми, проводилась с применением различных комбинаций косвенных методов, и бо отсутствовали культуры клеток растений, необходимые для количестве нного изучения вирусной инфекции в системе in vitro. Однако за прошедшие десят ь лет в этом отношении удалось добиться существенных успехов. Во-первых, был разработан метод получения протопластов клеток растений, причем ок азалось, что эти культивируемые in vitro структуры можно заражать вирусами. Во -вторых, было установлено, что из организмов насекомых — переносчиков в ирусов, вызывающих заболевания растений, — можно получать однослойные культуры клеток, чувствительных к соответствующим вирусам. Оба этих под хода открывают широкие возможности разработки точных методов титрован ия вирусов растений и изучения их биосинтеза. Уже сейчас стало ясно, что у вирусов растений общая стратегия их взаимодействия с хозяевами, реализ ующаяся на уровне одной клетки, та же, что и у сходных с ними вирусов живот ных. Протопласты, выделенные из мезофильных клеток табака, можно заразит ь ВТМ и таким образом, изучить одиночный цикл размножения этого вируса. У становлено, что после проникновения вирионов в клетку происходит быстр ое освобождение их РНК от белковой оболочки (декапсидирование) , вследст вие чего инфекционность экстрактов клеток, находящихся на стадии эклип са, снижается. Декапсидирование ВТМ осуществляется путем удаления из сп ециального капсида составляющих его субъединиц. Напротив, у ВЖМТ, имеюще го икосаэдрическую форму, РНК освобождается из вириона, по-видимому, без разрушения его белковой оболочки. Освобожденная РНК превращается в реп ликативную и промежуточную репликативную формы с помощью механизмов, в ероятно сходных с теми, которые существуют у РНК — содержащих фагов и пи корнавирусов. Вначале общее содержание вирусной РНК возрастает экспон енциально, но на более поздней стадии, когда происходит образование глав ным образом плюс — цепей РНК, скорость синтеза становится линейкой. Соз ревание вируса начинается через 4-5 ч. после заражения. Молекулы вирусной Р НК, синтезирующиеся на данной и последующих стадиях инфекции, быстро зак лючаются в капсиды. Однако из клеток выделяется лишь очень небольшое чис ло варионов. Для большинства заболеваний, вызываемых вирусами растений, характерно, что зараженные клетки продолжают продуцировать вирус, не по двергаясь лизису и оставаясь жизнеспособными. Благодаря этому в клетка х растений, зараженных такими вирусами, как ВТМ, концентрация вируса мож ет достигать огромных значений. Инфекция передается от клетки к клетке г лавным образом путем прямого переноса вирионов по межклеточным мостик ам (плазмодесмам) . Количественное изучение циклов репродукции вирусов растений можно про водить на вирусах, размножающихся в однослойных культурах клеток насек омых. Так, например, для ВЖКК, относящегося к группе рабдовирусов, была пол учена кривая его размножения в культуре клеток цикадки, из которой видно , что стадия эклипса продолжается 9 ч., а период размножения 20 ч. ; при этом вых од вируса превышает 10 000 вирионов на клетку. Провести такой точный анализ э той кривой оказалось возможным, потому что, как было установлено при пом ощи метода флуоресцирующих антител, данным вирусом удается синхронно з аразить все 100 % клеток культуры, а новосинтезированный вирус можно эффект ивно оттитровать, используя для этого однослойные культуры клеток насе комых. При заражении интактных растений первый цикл репродукции вируса трудно исследовать из-за того, что вначале вирус заражает лишь очень неб ольшое число клеток растений, а на более поздних стадиях инфекции, когда количество вируса или вирусных продуктов становится достаточным для п роведения точного анализа, циклы репродукции вируса начинают перекрыв ать друг друга. Если ВЖКК накапливается в культивируемых клетках насеко мых в очень больших количествах, то он вызывает слияние этих клеток с пом ощью механизма, который, вероятно, сходен с механизмом слияния клеток по д воздействием паралинсовирусов. Репликация РНК вирусов растений, по-видимому, катализируется специфиче скими РНК — репликазами. Из листьев, зараженных ВТМ, были выделены две фо рмы РНК — репликазы. Одна из них — нерастворимая форма, связанная с РНК В ТМ и способная катализировать синтез специфической РНК с использовани ем рибонуклеозидтрифосфатов. Вторая — растворимая форма с молекулярн ым весом около 150 000, способная использовать в качестве матрицы для неспеци фического синтеза РНК любую из нескольких исследованных в этом отношен ии РНК. Связанная форма репликазы, которую можно экстрагировать из клето к на поздних стадиях вирусной инфекции, катализирует главным образом си нтез плюс — цепей вирусной РНК. РНК ВТМ представляет собой одиночную цепь с молекулярным весом 2,3 10, спосо бную кодировать полипептид с молекулярным весом около 2,4 х 10. В системе in vivo э та РНК кодирует синтез нескольких белков, в том числе белка оболочки (мол екулярный вес 17 500) и двух больших полипептидов (молекулярный вес 160 000 и 140 000) . Со вершенно очевидно, что генетической информации, содержащейся в плюс — ц епи РНК ВТМ, было бы недостаточно для кодирования всех этих белков, если б ы они синтезировались независимо друг от друга. Следовательно, либо нукл еотидные последовательности, кодирующие синтез этих белков, перекрыва ют друг друга, либо сначала синтезируется длинный полипептид, который за тем расщепляется на более мелкие полипептиды, либо какой-то из этих поли пептидов синтезируется на минус — цепи РНК. Цитологические данные, полученные при изучении вирусных инфекций В те чение долгого времени считали, что репликация ВТМ происходит только в ци топлазме. Однако некоторые данные, полученные при цитологических и цито химических исследованиях, позволяют предполагать, что первичным место м репликации РНК этого вируса является, вероятно ядро. Эксперименты с ис пользованием конъюгированных с ферритином акти — ВТМ — антител показ ывают, что белок ВТМ появляется в клетках листьев через несколько дней п осле их заражения и сначала обслуживается в цитоплазме главным образом вокруг ядерной мембраны. Белок ВТМ выявляется также и в ядре клетки, одна ко, судя по результатам электронной микроскопии, завершенные вирионы со держаться только в цитоплазме, но не в ядре. Напротив, вирионы некоторых д ругих вирусов растений, например вируса штриховатости ячменя, обнаружи ваются в нуклеоплазме. На срезах клеток, зараженных вирусом желтой карли ковости картофеля, для которого характерно наличие внешней оболочки и к оторый морфологически весьма напоминает рабдовирусы, видно, что вирион ы этого вируса тесно ассоциированы с ядерной оболочкой. Возможно, что яд ерная оболочка служит источником некоторых компонентов входящих в сос тав внешней оболочки этого вируса. В ядре вирионы этого вируса не обнару живаются. Одним из наиболее частых и характерных воздействий, оказываемых вируса ми растений на клетки, является образование внутриклеточных включений. В большинстве случаев эти включения представляют собой агломераты вир усных частиц, либо свободных, либо связанных с составными частями клетки . Морфология и локализация включений варьируют в зависимости от вируса, вызвавшего заболевание. Большинство вирусов растений образует только цитоплазматические включения, но вирус гравировки табака, а также некот орые другие вирусы образуют кристаллические включения в ядре клетки. Вк лючения, формирующиеся в клетках, зараженных другими вирусами растений, также могут быть кристаллическими или амебоидными. в клетках опухолей, в ызываемых вирусом раневых опухолей, обнаруживаются цитоплазматически е шарики, или вироплазмы, состоящие из микрокристаллов этого вируса. Распространение вирусов по растению Вирусы, введенные в растение путе м механической инокуляции, медленно распространяются по непроводящей ткани от первично зараженных клеток к соседним. Скорость распространен ия ВТМ составляет примерно 1 мм в день, а иногда и меньше. По-видимому, вирус , попавший в клетку, сначала в ней размножается, а затем уже проникает в со седние клетки по межклеточным канальцам, или плазмодесмам. Прежде чем ВТ М начинает двигаться из первично зараженной клетки в соседнюю, проходит несколько часов. Из одной клетки в другую могут мигрировать как интактны е вирионы, так и вирусная РНК; с помощью электронной микроскопии вирионы были обнаружены в плазмадесмах. По тканям растения могут распространят ься также и вирионы, неспособные к созреванию. Когда вирус попадает в проводящую ткань либо из соседних паренхимных кл еток, либо непосредственно вводится туда насекомым — переносчиком, он б ыстро движется сначала по жилкам, затем по черешку листа и, наконец, попад ает в стебель. В принципе вирус может распространиться по всему растению , причем степень генерализации процесса зависит как от свойств вируса — хозяина. Большинство вирусов, переносимых механически, относится к числ у гистологически “неограниченных” вирусов, а это означает, что они могут проникать почти во все ткани зараженного растения. Как правило, первыми атакуются вирусом активно растущие ткани и корни. Перенос вируса на знач ительные расстояния происходит главным образом по флоэме вместе с токо м пластических веществ, хотя вирусы могут мигрировать и по водопроводящ ей ткани растения — ксилеля. Вирусы могут перемещаться вместе с водным раствором органических веществ по членикам ситовидных трубок флоэмы, н о это не обязательно приводит к заражению вирусом этих клеток. Однако не кроз флоэмы при вирусных болезнях растений — отнюдь не редкое явление, доказательством чего может служить некроз этой ткани, вызываемый вирус ом скручивания листьев картофеля. Перенос вирусов семенами наблюдаетс я редко, а перенос пыльцой — еще реже. Особенности процесса морфогенеза цветка, очевидно, таковы, что они препятствуют проникновению вируса в га меты. Вообще же клетки апикальных меристем, зараженных вирусом растений , как правило, содержат мало вируса, а иногда и вовсе свободны от вирусных частиц. Степень распространения вируса по зараженному растению определяется о тветной реакцией зараженных клеток на инфекцию, а сама эта реакция может быть весьма различной. К наиболее выраженным ее проявлениям относятся н екротические поражения. В этом случае клетки погибают так быстро, что ча сто даже не успевают передать вирус соседним клеткам. Обнаружено, что пр и некротической вирусной инфекции в клетках повышается уровень полифе нолоксидазы. К наиболее выраженным проявлениям реакции растений на заражение вирус ом относятся почти бессимптомные инфекции, обнаруживаемые лишь по очен ь слабым симптомам или благодаря тому, что вирус, не причиняющий явного в реда одним растениям, вызывает заболевания других. В этих случаях зараже нные клетки повреждаются незначительно и, как правило, сохраняют способ ность к делению. Типичной реакцией клеток растений на заражение некотор ыми вирусами является интенсивное их деление и даже опухолевая трансфо рмация. Механизм опухолеродного действия вируса раневых опухолей пока остается неизвестным. Следует учитывать возможность совместного дейст вия гормонов растений с вирусами (синергизм) в процессе индукции и стиму ляции роста опухоли. Большая часть изменений обменных процессов наблюд аемых при вирусных болезнях растений, вероятно, возникает в результате п обочных воздействий, оказываемых вирусной инфекцией на процессы фотос интеза, дыхания, регуляции роста, а также транспорта воды, пластических и других веществ. Нарушения регуляции роста приводят к морфогенетически м аномалиям самой различной значимости — от мозаичности листьев и цвет ков до некротических поражений и аномальной пролиферации побегов и обр азования опухолей. В местах некротических поражений часто накапливают ся некоторые вещества типа скополетина — флуоресцирующего ароматичес кого соединения, однако доказательства специфической роли вируса в био синтезе этих веществ пока отсутствуют. Механизмы передачи вирусов растений Механическая передача вирусов ра стений на поверхность листа может быть осуществлена в эксперименте со м ногими вирусами, однако маловероятно, чтобы такой путь передачи был осно вным способом распространения вирусов растений в естественных условия х. Одним из немногих исключений в этом отношении является ВТМ. Передачу п очти любого вируса можно осуществить прививкой. Хотя этот способ зараже ния используется главным образом при экспериментальных исследованиях , он может играть значительную роль в распространении вирусных болезней плодовых деревьев и декоративных кустарников. Паразитное растение пов илика, гаустории которой внедряются в стебли растений — хозяев (таким о бразом устанавливается живая связь между сосудистыми системами растен ия — хозяина и паразита) , служит полезным инструментом для изучения пер едачи вирусов новым хозяевам. Однако очевидно, что такой механизм переда чи вирусов не может быть основным способом их распространения в природе . Передача вирусов растений членистоногими переносчиками В естественн ых условиях наиболее важную роль в передаче вирусов от одного растения к другому играют животные, питающиеся на этих растениях. Иногда передача вируса растению переносчиком осуществляется чисто механическим путем , но в большинстве случаев — это специфический процесс, отражающий опре деленные связи, существующие между вирусом, переносчиком и растением. Основными переносчиками вирусов растений служат членистоногие, особен но насекомые, но иногда также и клещи. Есть много общего между взаимоотно шениями некоторых вирусов растений с их членистоногими — переносчика ми и взаимоотношениями арбавирусов животных (переносимых членистоноги ми) с их переносчиками. Членистоногие — переносчики с колющим хоботком, высасывающие сок растений, весьма эффективно переносят вирусы, посколь ку они обладают способностью вводить вирус в относительно глубоко расп оложенную ткань растения — флоэму. Небольшое число вирусов попадает в к силему, значительно большее их число встречается во флоэме. Наиболее шир ок спектр вирусов растений, переносимых тлями. Различают несколько типо в передачи вирусов растений насекомыми: 1) Внешняя передача, осуществляе мая стилетом, без персистенции вируса в организме переносчика. В этом сл учае вирус сорбируется на вершине стилета насекомого, когда оно питаетс я на зараженном растении, и может быть сразу же перенесен на здоровое рас тение. Способность к передаче вируса может быть утрачена очень скоро, а м ожет и сохраняться в течение нескольких дней, но не обнаруживается после очередной линьки. Возможно, что некоторые продукты жизнедеятельности р астений способствуют переносу вируса по этому механизму. 2) Регургитативная передача. Вирус сохраняется в передней кишке насекомы х (тлей и жуков) в течение довольно длительного времени и передается здор овому растению путем отрыгивания содержимого кишки. 3) Циркулятивная передача. При данном типе переноса вирус может быть пере дан другому растению не сразу после питания переносчика на больном раст ении, а лишь по окончании определенного латентного периода. Продолжител ьность его может составлять от нескольких часов до нескольких дней. При такой передаче способность переносчика передавать вирус другому расте нию сохраняется намного дольше, чем при регуртативной передаче. Было пок азано, что вирус циркулирует в тканях насекомого и при линьке оно не утра чивает способности к переносу вируса. 4) Пропагативная передача. Вирус действительно размножается в тканях нас екомого, прежде чем достигает его ротовых частей. Длительность латентно го периода определяется временем, необходимым для размножения вируса. В конечном счете, вирус попадает в слюнные железы насекомого и со слюной п ереносится в растение. Большой класс переносчиков вирусов растений — ц икадки почти всегда осуществляет передачу вирусов растениям именно по этому механизму. К данному классу относится переносчик вируса раневых о пухолей и многие другие. Способность насекомого переносить тот или иной вирус контролируется г енетически и может определяться различием в одном гене, который, по-види мому, контролирует проницаемость кишечника для вируса. В пользу такой то чки зрения говорит тот факт, что после пункции брюшка насекомое, неспосо бное передавать вирус, приобретает эту способность. Аналогичное явлени е наблюдается и у насекомых — переносчиков некоторых вирусов животных. Принимая во внимание тесные связи между насекомыми и растениями, которы ми они питаются, можно предположить, что вирусы в ходе эволюции распрост ранились от одного класса хозяев к другому и оказались избирательно ада птированными к “двойному” образу жизни. Существенный этап инфекции так ого рода представляет проникновение в клетку вирусной нуклеиновой кис лоты, генетические потенции которой, объединенные с генетическими поте нциями клетки, и определяют возможность размножения вируса. Способ прон икновения вирусной нуклеиновой кислоты в клетку, вероятно, имеет менее в ажное значение, чем метаболические и биосинтетические условия, существ ующие в клетке, в которую проник вирусный геном. Как уже упоминалось выше, некоторые вирусы растений, передаваемые насек омыми, по ряду свойств напоминают вирусы животных. Передача вирусов растений нематодами и грибами Заболевания растений, передающиеся через почву, известны давно. Однако роль нематод в переносе некоторых вирусов растений, в том числе вируса кольцевой пятнистости та бака и вируса погремковости табака, была установлена относительно неда вно. Эти черви “приобретают” и передают вирус, паразитируя на корнях рас тений, и могут служить ему убежищем в течение ряда месяцев, однако через я йца вирус, по-видимому, не передается потомству червей. Известно, что вирус некроза табака и по крайней мере еще два вируса расте ний переносятся примитивным паразитическим фикомицетом. Способность к передаче специфична как в отношении штаммов вируса, так и в отношении шт аммов переносчика, и вирус переносится, по-видимому, зооспорами гриба. Др угие грибы, вероятно, также могут служить переносчиками вирусов, связанн ых с почвой. Вирусы, патогенные для насекомых Включения в их связь с вирусной инфекц ией У насекомых известно много различных вирусных болезней. Некоторые и з них поражают полезных насекомых, таких, как тутовый шелкопряд, другие — насекомых — вредителей, в борьбе с которыми они могут играть важную р оль. При многих вирусных заболеваниях насекомых в их клетках образуются полиэдрические включения. Поэтому такие заболевания были названы поли эдрозами. Полиэдры — специфические продукты инфицирующих клетку виру сов. При одних инфекциях они образуются в ядре клеток, при других — в цито плазме. При некоторых вирусных заболеваниях, называемых гранулезами, в п ораженных клетках образуются не полиэдры, а гранулярные включения, или к апсулы. Иногда патогенные для насекомых вирусы вовсе не образуют внутри клеточных включений. Ядерные полиэдрозы Ядерные полиэдрозы были описаны у чешуекрылых, пер епончатокрылых и двукрылых. Типичным примером может служить полиэдроз тутового шелкопряда. Через несколько дней после инъекции гусенциале ви руса или поедания ими инфицированного корма в ядрах клеток большинства тканей появляются мелкие включения. Постепенно их число и размеры увели чиваются и некоторые из них могут достигать 10-15 мкм. В одном ядре может соде ржаться до 100 полиэдров. Ядерный хроматин исчезает, клетки в концов гибнут , и свободные полиэдры появляются в гемолимфе. Полиэдры тутового шелкопр яда представляют собой кристаллы, состоящие из белка с большим молекуля рным весом (около 300 000) , который состоит из субъединиц с молекулярным весом около 20 000. Белок полиэдров очень устойчив к действию протеолитических фе рментов. Белки полиэдрических включений, выделенных от различных насекомых, даю т перекрестные серологические реакции, но между белками организма — хо зяина и белками полиэдров серологического родства нет. Возможно, что бел ки полиэдров кодируются структурными генами вируса. Некоторые вирусы у давалось в эксперименте передавать другим насекомым — хозяевам, хотя ч астое наличие у насекомых латентных вирусов осложняет интерпретацию т аких результатов. Белки полиэдров, образуемых данным вирусом у разных хо зяев, серологически идентичны. Внутри полиэдров лежат вирусные частицы, расположенные поодиночке или группами. Подвергая полиэдры мягкому щел очному гидролизу, легко выделить содержащиеся в них вирионы. Они состоят в основном из палочкообразных капсидов, внутри которых находится двухц епочная ДНК, окруженная двумя мембранами — внутренней (это, вероятно, од ин слой белка, соответствующий капсиду) и внешней, окружающей скопления вирусных частиц и состоящей из белка и липидов. Для ДНК каждого вируса насекомых характерен свой нуклеотидный состав. К оличество ДНК в каждом вирионе составляет около 10 дальтон. Размеры вирио нов у разных вирусов насекомых варьируются в пределах от 30 до 50 нм в попере чнике до 200-320 нм в длину. Наряду с такими крупными часто встречаются и мелки е частицы — не развивающиеся, а скорее неполные или распавшиеся вирионы . Латентные инфекции Одна из удивительных особенностей вирусов насеком ых — их способность сохраняться в организме хозяина в латентном состоя нии в течение многих генераций. У насекомых почти наверняка имеет место трансовариальная передача вируса, хотя не исключается и возможность за ражения личинок во время их выкормки. Находясь в латентном состоянии, ви рус не вызывает каких-либо видимых симптомов. Однако он может быть актив ирован каким-либо внутренним или внешним фактором, что приводит к синтез у инфекционного вируса и появлению симптомов болезни. Такое действие мо жет оказать тепловой шок или смена пищи, например замена листьев одной ш елковицы листьями другой. Сходный эффект получали с помощью рентгеновс ких лучей и некоторых веществ. Так, Ямафудзи сообщил, что у тутового шелко пряда стимулами, провоцирующими симптомы полиэдроза, могут служить фор мальдегид, гидроксиламин, перекиси, оксины и нитриты. На основании этих д анных Ямафудзи выдвинул теорию об образовании полиэдрических вирусов из генетического материала хозяина в результате мутагенного воздейств ия на хромосомную ДНК. Интересно, что к этой мысли он пришел тогда, когда м утагенные свойства многих из упомянутых веществ еще не были известны. Од нако теория Ямафудзи не встретила большой поддержки, так как известно, ч то намеренное заражение гусениц тутового шелкопряда вирусом полиэдроз а часто приводит не к заболеванию, а к латентной инфекции. Значит, гусениц ы, у которых после химического воздействия проявляются вирусы, уже могли быть его скрытыми носителями. Поэтому “провирусная” теория латентност и вирусов полиэдроза кажется более правдоподобной, чем теория образова ния вирусных геномов из генетических элементов клетки- хозяина. Агент, вызывающий у дроздофилы чувствительность к СО Важная серия иссл едований была посвящена изучению трансмиссивного агента, контролирующ его чувствительность к СО некоторых рас дроздофилы. При концентрации СО , вызывающей у устойчивых мух лишь обратимое состояние наркоза, у чувств ительных мух наступает паралич, и они погибают. Генетический фактор, отв етственный за эту особенность, получил обозначение О. Своей трансмиссив ностью, мутабильностью, размерами и специфичностью по отношению к хозяи ну он напоминает вирус. В некоторых отношениях он сходен с умеренными ба ктериофагами. В организме мух, чувствительных к СО, содержится вирус, кот орый можно извлечь из их тканей и инъецировать устойчивым мухам, в резул ьтате чего последние тоже становятся чувствительными. Чувствительност ь к СО возникает через несколько дней, причем это время зависит от величи ны инокулума. Судя по инфекционным титрам экстрактов, полученных из инок улированных вирусом мух, содержание вируса в организме сначала снижает ся, а затем быстро возрастает до максимума, и именно в это время мухи стано вятся чувствительными к СО. Вслед за заражением устойчивых к СО, но воспр иимчивых к вирусу мух этот вирус после периода эклипса проходит стадии в егетативного размножения и созревания, в результате чего содержание ви рионов — потомков в организме мухи достигает определенного максимума. Когда количество вегетативного вируса достигает пороговой величины, м уха становится чувствительной к СО. Стабильное состояние, возможно, соот ветствует более интимной интеграции вируса с организмом хозяина, при ко торой вирус переходит в неинфекционное состояние и лишь изредка может п орождать зрелые вирионы. Стабилизированная форма вируса может передав аться самками всем потомкам обоего пола. При внесении вируса в зиготу му жской гаметой он переходит в нестабилизированную вегетативную форму. Был установлен неожиданный и важный факт — морфологическое сходство в ируса О с рабдовирусами. Более того, оказалось, что один из рабдовирусов — вирус везикулярного стоматита, — будучи введен дроздофиле, может выз ывать персистентную инфекцию и обуславливать стабильную чувствительн ость у СО. Таким образом, установлен еще один случай родства между вируса ми, найденными у очень далеких друг от друга хозяев. Происхождение и природа вирусов Вирусы как независимые генетические с истемы Какое место занимают вирусы в биологическом мире? Каково их проис хождение и кто их ближайшие родственники? Сведения о вирусах, изложенные в этой книге, четко подтверждают положение, высказанное в самом ее начал е: вирусы нельзя уподоблять очень мелким клеткам. Вирусы — это элементы генетического материала, у которых есть своя собственная эволюционная история, ибо в них имеется все необходимое для их передачи от одного хозя ина другому. В этом смысле вирусы представляют собой независимые генетические сист емы. Это не случайно отделившиеся фрагменты генома какой-то клетки. Виру сам присуща генетическая непрерывность и способность мутировать, они с одержат набор генов, в результате согласованного действия которых обра зуются новые частицы того же вируса. И наконец, вирусы имеют свою эволюци онную историю, по крайней мере отчасти независимую от эволюции организм ов, в которых они репродуцируются. В то же время вирусы не стоят в стороне от эволюционной истории клеток и организмов. Их генетический материал в химическом отношении сходен с генетическим материалом всех клеток, хот я у многих вирусов он состоит из РНК — кодирующего полимера, оттесненно го в процессе эволюции клеток на второстепенную роль, в клетках РНК служ ит подсобным переносчиком генетической информации, а не ее первичным но сителем. Если сравнить ДНК с Солнцем, то клеточные РНК будут планетами, ко торые светят отраженным светом; однако, в РНК — содержащих вирусах эти п ланеты вновь стали самостоятельными светилами. Между тем независимость вирусов как генетических систем сама подверже на эволюционным изменениям. Например, геном умеренного фага может как фи зически, так и функционально интегрироваться с геномом бактерии. Он може т существовать в двух формах — в виде вируса и в виде группы хромосомных генов клетки — хозяина. Когда в результате мутации умеренный фаг теряет способность превращаться в профаг, он утрачивает одну из своих форм сущ ествования — становится в большей степени клеточным компонентом, набо ром генов клетки. И наоборот, когда профаг мутирует, превращаясь в дефект ный профаг (т.е. в профаг, неспособный осуществлять все функции, необходим ые для собственной репродукции и заражения другой бактериальной клетк и) , он как бы, становится в меньшей степени вирусом и в большей — клеточны м компонентом, теперь его дальнейшее существование зависит от сохранен ия данной клеточной линии или же от “помощи” со стороны другого, недефек тного вируса. Хотя физическая интеграция генома вируса с хромосомой клетки — хозяин а детально изучена только в системе фаг — бактерия, известно, что многие опухолеродные вирусы тоже включают свой геном в хромосому клетки. Во все х группах вирусов известны также дефектные вирусы, нуждающиеся в помощн ике. И это не только варианты, изредка возникающие в лабораторных экспер иментах: такие вирусы существуют в природе и, несомненно, имеют значение для эволюции. Превращение обычного вируса в дефектный, включившийся в ге ном клетки — хозяина, формально можно рассматривать как превращение гр уппы вирусных генов в подгруппу генов клетки. И наоборот, группы клеточн ых генов могут превращаться в геномы вирусов, и это относится не только к генам, внесенным в клетку вирусами. Не исключено, что вирусные геномы мог ут возникать из невирусных генетических элементов клетки. И мы должны по ставить вопрос: какие события играют важную роль в возникновении вирусо в как организмов и в эволюционной истории их генетического материала. РНК — содержащие вирусы и клеточные РНК Само существование РНК-вирусо в ставит ряд трудно разрешимых вопросов. Ни у бактерий, ни у других органи змов нет ничего достаточно похожего на репликацию генетического матер иала в форме РНК. Правда, данные о том, что РНК — содержащие фаги, относящи еся к одной и той же группе, обладают разными специфичными для каждого фа га механизмами репликации, заставляют воздерживаться от окончательных выводов. Если эти данные верны, то не исключено и существование пока еще н е выявленных клеточных РНК — реплицирующих систем. Такую возможность д ействительно постулировали, но большей частью без достаточных основан ий. Если же клеточных аналогий не окажется, нам придется выбирать одну из ря да других альтернатив. Например, мы может рассматривать РНК — содержащи е вирусы как уникальную группу, представляющую особое направление эвол юции. Можно также предположить, что эти вирусы произошли от ДНК — вирусо в, информационная РНК которых приобрела способность прямой репликации, так что транскрипция ее с ДНК стала излишней. Но если считать это возможн ым, то нет причин ограничиваться гипотезой возникновения РНК — вирусов на основе вирусной информационной РНК: столь же серьезно мы должны рассм отреть и возможность происхождения таких вирусов от клеточных информа ционных РНК. Необходимым для этого этапа было бы приобретение соответствующего мех анизма репликации и способности к образованию вирионов. Существование вирусов, кодирующих обратную транскрптазу — фермент, транскрибирующи й РНК вириона в соответствующую ДНК, — показывает еще одну возможность: некоторые вирусы могли бы приобрести РНК — репликазу, что позволило бы им обойтись без обратной транскрипции, а заодно исключило бы возможност ь их интеграции с хромосомой клетки. Перечисленные выше возможности, взя тые в целом, иллюстрируют ряд путей, которые могли бы при участии механиз мов репликации РНК вести к превращению сегментов хромосомного генетич еского материала вирусные гекомы и наоборот. К сожалению, слишком больши е пробелы в наших знаниях пока не позволяют построить обоснованную моде ль такого рода. Еще одну загадку составляет существование вирусов с генами из нескольк их фрагментов двухцепочечной РНК. Среди таких вирусов есть паразиты сам ых различных организмов — бактерий, грибов, растений, насекомых и позво ночных. Произошли ли все эти вирусы от общего предка? Или разные группы их возникали независимо на разных путях эволюции вследствие каких-то преи муществ, связанных с подобным строением генома? Ответов на эти вопросы п ока нет. Происхождение вирусов и происхождение клетки Проблема происхождения вирусов — это, по существу проблема независимости генетических элемен тов в репродуктивном и эволюционном отношении. Основные вопросы здесь к асаются того, насколько длинный путь прошли вирусы в своей независимой э волюции и в какой точке разошлись пути эволюционного развития вирусов и тех генетических элементов, которые мы находим в настоящее время в клетк ах. Вирус, проникнув в клетку, может оставаться в ней либо в течение какой- то доли клеточного цикла, либо на протяжении многих клеточных генераций . У организмов, размножающихся половым путем некоторые вирусы могут пере даваться последующим поколениям через гаметы. Вирус, долго сохраняющий ся в клетке, практически не отличим от клеточного компонента. Такую част ицу мы могли бы счесть вирусом, плазмидой или геном в зависимости от типа воздействия, благодаря которому ее удалось обнаружить. Таким образом, пр облема происхождения вирусов включает: 1) вопрос об отношении между виру сами и клеточными компонентами, 2) вопрос о происхождении клеточных комп онентов и 3) вопрос о родстве между различными генами вирусов. Довольно ши роко распространено представление о “монофилетическом” происхождени и клетки — о том, что набор ее генов, то есть геном создавался в результат е дифференциации одного исходного самовоспроизводящегося элемента, ко пии которого иногда не разделялись и благодаря мутациям приобрели разл ичные формы и функции. Из таких групп генов должны были затем образовать ся хромосомы, ибо наличие какого-то организованного механизма, обеспечи вающего равное распределение генетического материала, дает большое пр еимущество — помогает сохранять благоприятные комбинации генов. Появление полового процесса в ходе дальнейшей эволюции усложнило эту с хему, однако у организмов, у которых еще не было полового процесса, все ген ы должны были возникнуть в пределах одной клеточной линии. Согласно само й простой гипотезе, цитоплазма целиком является продуктом деятельност и генов. Таким образом, все генетические компоненты клеток, относящихся к одной линии, должны иметь единое происхождение. Передача генетическог о компонента — гена или хромосомы — другой клетке была бы уже слиянием части генетического материала одной линии с геномом другой линии. С друг ой стороны, не исключена возможность и полифилетического происхождени я нормальной клетки. Несколько первичных самореплицирующихся молекул могли, объединившись, создать благоприятную комбинацию и сформировать в дальнейшем клеточный геном. Или же, наконец, какие-то генетические элем енты могли проникнуть в уже образовавшуюся клетку. Слияние генетическо го материала разных линий могло бы произойти на относительно раннем эта пе эволюции клетки, и тогда приобретение геном, хромосомой или плазмидой способности переходить из одной клетки в другую было бы возвращением к исходной независимости и повторением исходного процесса слияния. Таким образом, все теории происхождения вирусов сводятся к рассмотрени ю различных возможностей слияния двух или большего числа генетических элементов и образования из них функционирующей генетической системы. В случае вирусов, вызывающих быстрое разрушение клетки, такое слияние мож ет не быть очевидным, и фундаментальное значение этого процесса не было замечено ранними вирусологами, для которых вирус, размножающийся в клет ке, был подобен бактерии, растущей в культуре. На самом же деле даже клетка , зараженная вирулентным вирусом и обреченная на быструю гибель, предста вляет собой функциональную систему, чья конечная судьба — полная дезин теграция — это лишь побочный результат главного события, а именно генет ической и биохимической интеграции вирусных и клеточных механизмов. Сл ияние может приводить к длительной интеграции клетки с вирусом, которая сохраняется в течение нескольких клеточных генераций, иногда даже при п оловом процессе. В случае профагов, а возможно, и некоторых опухолеродны х вирусов интеграция может стать почти постоянной. Некоторые плазмиды и , быть может, даже сегменты хромосом могли сформироваться именно таким п утем. С другой стороны, эволюция механизмов, реализующих передачу генети ческого материала, могла привести к превращению отдельных генов и групп генов в плазмиды и вирусы. Из всех живых существ, быть может именно для вирусов монофилетическое пр оисхождение наименее вероятно, ибо вирусы всегда реплицируются в окруж ении больших количеств невирусных нуклеиновых кислот, способных включ аться в их геном. К какой категории мы отнесем данный генетический элеме нт — к генам, плазмидам, или вирусам, — в конечном счете будет зависеть о т того, насколько длительным был период общности его эволюционной истор ии с историей других компонентов генома. Способность к возвращению неза висимости может определяться не только мутабельностью, но длительност ью совместного существования, которая может приводить ко все большей вз аимозависимости между различными компонентами клетки. Экзогенный элем ент внесенный в клеточную линию, вероятно, подвергнется столь же выражен ным эволюционным изменениям, как и любой другой генетический компонент клетки, и будет не более похож на своего первичного предка, чем похожи на с воих предков эти компоненты. Передаваемые генетические элементы, быстро разрушающие новую для них к леточную систему, должны были бы в большинстве случаев исчезать, так как они могли бы сохраниться только при доступности для них бесчисленного м ножества клеток — хозяев. Часто, однако, слияние могло быть долговремен ным. При этом остается важный вопрос, на который пока нельзя ответить: явл яется ли такое слияние новой и необычной особенностью, ведущей в основно м к образованию аномальных комплексов, не имеющих значительной эволюци онной ценности, то есть больных клеток, или же это один из процессов, котор ый играл и все еще играет существенную роль в эволюции (а возможно и в онто генезе) ? Вирус может быть и регрессировавшим паразитом, и фрагментом клеточного генома, ставшим инфекционным, в зависимости от того, какую фазу его эволю ционной истории мы наблюдаем. В различное время он может быть и тем и друг им. Подобно тому как изучение структуры и размножения вирусов в конце ко нцов всегда приводит нас к клетке как системе, в которой имеют место проя вления жизни, так и проблема происхождения вирусов возвращает нас к вопр осу о происхождении клеток как интегрированного целого. Вирус — это, по существу, часть клетки. Мы считаем вирусами те компоненты клетки, которые достаточно независимы для того, чтобы передаваться друг им клеткам, и сравниваем их с другими клеточными компонентами, более про чно связанными со всей системой. И именно эти свойства вирусов делают их бесценными для биологов, предоставляя им уникальную возможность наблю дать в относительно изолированном виде активные детерминанты биологич еской специфичности — по истине те кирпичики, из которых построено все живое.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Мораль сказки про Золушку в следующем: как бы случайно оставь у него одну из своих вещей, чтобы ему пришлось потом ещё раз с тобой встретиться.
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Обратите внимание, реферат по медицине и здоровью "Можно ли считать вирусы живыми?", также как и все другие рефераты, курсовые, дипломные и другие работы вы можете скачать бесплатно.

Смотрите также:


Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru