Введение Генетика человека как фундаментальная , так и прикладная наука . Как фунда ментальная наука - это область генетики , которая изучает законы наследственности и изменчивости у самых интересных организмов - чел о веческих существ . Научные результаты , полученные при этом , ценны для нас не только в теоретическом плане . Вот почему генетик а - это также и прикладная наука . Важность ее для благополучия человечества очень вел и ка , успехи , достигнутые в этой области , приносят ученым большую радость , чем новые сведения , полученные в чисто теоретических или чисто прикла д ных исследованиях. По данны м Всемирной организации здравоохранения , около 2,5% н о ворожденных появляются на свет с различными пороками развития . При этом 1,5-2% из них обусловлены преимущественно неблагоприятными внешними (экзогенными ) факторами , а остальные имеют преимущественно ген етическую природу . Генетические факторы пороков развития отражают так называемый общий генетический груз популяции , который проявляется более чем у 5% населения планеты . Примерно 1% генетического груза пр и ходится на генные мутации , 0,5% - на хромосомные му тации , около 3-3,5% соответствует болезням с выраженным наследственным компонентом (ди а бет , атеросклероз , ишемическая болезнь сердца , некоторые опухоли и т.д .). Если к этому добавить , что около 40-50% ранней младенческой смертности и инвалидности с детства обусловлены наследственными факторами и пр и мерно 30% коек в детских стационарах заняты детьми с наследственной п а тологией , становится понятной безусловная необходимость правильной и рационально организованной ранней диагностики врожденных и насле д ственных болезней (пренатальной диагностики ). Знания в области генетики позволили бы не только установить диагноз еще до рождения , но и предо т вратить появление на свет детей с тяжелыми , неисправимыми пороками развития , с социально значимыми смертельными генными и хромосомными болезнями. Число генных болезней , доступных молекулярной диагностике , уже превышает 1000 и продолжает быстро увеличиваться . Созданы и постоянно совершенствуются все новые эффективные и достаточно универсальные м е тоды ДНК-диагностики , такие , ка к метод полимеразной цепной реакции (ПЦР ), автор которой – американский ученый Кэй Муллис отмечен Ноб е левской премией 1994 года , метод гибридизации , увековечивший имя его создателя Эд . Саузерна (1975 год ), и методы ДНК-секвенирования (анализ первичной посл едовательности нуклеотидов в цепочке ДНК ), разработа н ные П . Сэнджером. Несколько назад начались исследования по международной пр о грамме "Геном человека ", объединившей усилия ученых многих стран . К о нечная цель ее – создать подробную карту человеческого генома , то есть полного набора его генов . А цель предлагаемого реферата гораздо более скромная : пробившись сквозь завесу заумных терминов (в каковом отнош е нии генетика – дисциплина неудобоваримая даже для самих генетиков ), ввести читателя в курс одного из величайших научных проектов века. География генома До сих пор возможности науки позволяли составлять разве что ген е тические карты совсем простеньких организмов , вроде кишечной палочки . Если всю последовательность ее генов , составляющих единственную з а мкн утую хромосому , распечатать на бумаге в столбик мелким шрифтом , присвоив каждому гену короткое имя из трех-четырех букв , получится кн и жица страниц в 300 обычного формата . А если так же поступить с человеч е ским геномом – итоговый труд займет 200 томов по 10 00 страниц каждый. Ныне эта необъятная "библиотека " напоминает скорее свалку книг : большинство листов не заполнено , остальные перепутаны , и вообще далеко не всегда ясно , какой том за каким идет . Известно , что ге ном человека насчитывает около 80000 генов , состоящих в сумме примерно из 3 млрд . пар нуклеотидов (так называется мономер двойной спирали ДНК , подобно тому как аминокислота – мономер белковой молекулы ). Локализ о вано же всего 7000 генов – меньше 10%. Для не которых районов генома , предста в ляющих особый интерес , составлены д о вольно детальные карты , для остальных – весьма приблизительные либо вовсе ник а ких. Карты генома , как и географические , можно строить в разном ма с штабе , с различным уровнем разрешения – пос ледний зависит от точности метода анализа . Существует две разновидности карт генома – собственно генетические , получаемые косвенными методами , и физические – результат прямого исследования молекулы ДНК . Максимально возможная степень д е тализации – с точност ью до пары нуклеотидов (далее п.н .). Иными словами , самая крупномасштабная карта – полная последовательность нуклеотидов с указанием , где кончается один ген и начинается следующий . Но это предел мечтаний , и пока до него далеко . А то , чем мы сегодня распол а гаем , - гла в ным образом мелкомасштабные карты всех 23 пар человеческих хромосом с расстоянием между отдельными маркерами – мельчайшими "различимыми на местности объектами " – 7-10 млн . п.н. Начнем с карт , составляемых при помощи косвенных методов изуч е ния г енома. Карты генетического сцепления Прежде всего заметим , что человеческая ДНК состоит , строго говоря , не только из генов . Ген , или экзон , - это экспрессируемый участок молек у лы ДНК , иначе говоря , ее отрезок , на котором , как на станке , "штампуются " моле кулы того или иного белка . Но подавляющее большинство нуклеоти д ных последовательностей в ДНК – интроны , не кодирующие ничего . Не всегда ясно , зачем они нужны и что делают , но – явно нужны и делают , иначе бы их не было. Карта генетического сцепления составл яется так . Сначала нужно в ы брать маркеры – какие-нибудь признаки организма , о которых точно и з вестно , что они наследственные , а не "благоприобретенные ". Правда , пр и знак годится на роль маркера , лишь если по нему имеются различия между индивидами и если эти различия легко выявить . Скажем , цвет глаз , или группа крови , или предрасположенность к некоей болезни. После того как маркеры выбраны , начинается анализ их наследов а ния . У генов есть одно любопытное свойство – они могут рекомбинировать , т.е . перераспредел яться . Либо в процессе развития сперматозоидов и яйц е клеток цепочка ДНК случайным образом разрывается и воссоединяется в разных местах , либо просто две хромосомы , составляющие пару (гомол о гичные ), обмениваются соответственными участками . В обоих случаях п о лучается новое сочетание признаков – те , что обычно наследуются совмес т но , разделяются. Так вот , известна закономерность : чем ближе друг к дружке распол о жены два гена на хромосоме , тем труднее им "распрощаться " при рекомб и нации – один "тянет " за собой друг ой . На этом и основано построение карт сцепления . Чем реже происходит рекомбинация между данными двумя пр и знаками-маркерами , тем меньше расстояние между генами , их кодирующ и ми. Правда , таким путем можно выяснить лишь взаимное расположение "действующих " ген ом (экзонов ) – вернее , вычислить расстояние между н и ми на хромосоме по частоте рекомбинаций . Установлено , что если после д няя равна 1%, дистанция между генами составляет примерно 1 млн . п.н ., или 1 Мб (одну мегабазу – последнее слово и означает "миллион осн ов а ний ", т.е . нуклеотидов ). Одна мегабаза "на местности " соответствует 1 сМ на карте (одной сантиморганиде – название этой единице дали честь вел и кого генетика Т.Х . Моргана ). Но аналогичным способом можно картировать и интроны . Для них маркерами обычно сл ужат так называемые сайты узнавания . Дело в том , что существуют специальные ферменты , предназначенные для разрезания ДНК , - рестриктазы . Это белковые молекулы особого устройства . Грубо говоря , они попросту "шинкуют " ДНК , режут на отрезки , но не как попало, а в определенных местах . Всякая рестриктаза может опознать лишь одну ста н дартную последовательность из нескольких нуклеотидов . Последняя и ст а новится сайтом узнавания для фермента . А уж как тот "покромсает " ДНК , зависит от того , сколь густо она "усеяна " с айтами узнавания . Молекулы р е стриктазы химически связываются с ними и в этих местах рвут цепь ДНК. Имеются сравнительно простые методы измерения длин участков , на которые порезала молекулу ДНК рестриктаза . Любое изменение сайта узн а вания ведет к тому , что тот становится "невидимым " для фермента . А зн а чит , ДНК разрезается в других местах и образуются иные по длине фра г менты. Чем хорош метод картирования по генетическому сцеплению – его можно применять , не имея ни малейшего представления о структуре генов тех или иных признаков . Достаточно уверенности , что таковые гены есть , а дальнейшие мероприятия направлены на то , чтобы узнать , ГДЕ они , а не КАКИЕ они. Недостатки метода – довольно низкая разрешающая способность (7-10 Мб ) и высокая трудоемкость . Кроме того , ген на карте предстает не пр о тяженным отрезком ДНК (каков он "на местности "), а точкой на линии , изображающей ее двойную цепь. Наконец , к великому сожалению , человек – не дрозофила . Очень ле г ко считать частоту рекомбинации маркеров , скрещивая мелких мушек т ы сячами и десятками тысяч . А с Homo sapiens такой способ по понятным причинам не годится , и о частоте рекомбинации приходится судить по ст а тистическим данным – скажем , по заболеваемости таким-то наследстве н ным недугом в стольких-то семьях за столько-то де сятилетий (а то и веков ). Кстати , именно генетическое картирование помогло найти точное распол о жение на хромосомах генов многих тяжелых наследственных болезней – муковисцидоза , серповидно-клеточной анемии , хореи Гентингтона , болезни Тея-Сакса , поликистоза почек , миотонической дистрофии и других. Мелкомасштабные физические карты К ним относят хромосомные и карты кДНК ("к " значит "кодиру ю щей "). Хромосомное картирование довольно грубо , но имеет смысл , когда нужный ген держат , что называется , в руках : известн а его структура , он х и мически выделен , но неизвестно , где он "сидит ". Тогда хромосомы , извл е ченные из ядра клетки во время ее деления (когда они толстые и хорошо различимы ), обрабатывают особыми красителями , придающими им "пол о сатость ": получаются так назы ваемые бэнды – разноокрашенные участки хромосом . Искомый ген размножают в пробирке и при этом метят его к о пии , подменяя , например , водород тритием . За таким радиоактивным зо н дом очень удобно следить : если подмешать его к препарату хромосом и в ы держать нек оторое время , он химически свяжется с определенным бэндом определенной хромосомы , встав "на свое место " (это называется "гибрид и зация in situ ", т.е . "на месте "). Так были картированы гены альбумина , ко л лагена , гормона роста и некоторые другие. Средний разм ер бэнда – около 10 Мб : такова и точность хромосомной карты . Правда , позднейшее усовершенствование – гибридизация с флуоре с центной меткой ( FISH – fluorescent in situ hybridization ) – повысило разр е шение до 5-2 Мб . Более того , разработан даже метод гибридиз ации меченых генов с хромосомами , извлеченными из ядра неделящейся клетки – и зн а чит , де конденсированными , "развинченными ", а не упакованными в ко м пактные образования . В итоге удалось локализовать участки до 0,1 Мб. Карты кДНК отражают расположение экспрессирующихся нукле о тидных последовательностей . По-русски это означает следующее . Доп у стим , в клетке активно работает , производя белок , некий ген . Что за ген – неизвестно . Где он – тоже . Тогда пользуются тем обстоя тельством , что при синтезе белка в клеточном ядре сначала "штампуются " молекулы мРНК – точные копии работающего гена ("м " – матричные ). Сей промежуточный продукт можно выловить из клетки и размножить в пробирке , пометив тр и тием либо радиоактивным фосфором. А дальше все как при хромосомном картировании : зонд пристроился к участку N – значит , экспрессия шла здесь и , следовательно , здесь расположен ген , кодирующий данный белок. Крупномасштабные карты генома Их составляют по общему принципу : сначала кромсают ДНК на ку с ки , разгоняют получившиеся фрагменты в электрическом поле (электроф о рез ) и затем гибридизируют с меченым зондом . В результате фрагменты упорядочиваются – воссоздается их исходная последовательность . Для эт о го используют разные методы поиска перек рывающихся участков. В любом случае необходимо прежде всего получить фрагменты ДНК картируемого участка в больших количествах . ДНК размножают обычно двумя способами – клонированием и ПЦР. КЛОНИРОВАНИЕ – по современным понятиям сравнительно прим и тивный мето д . Последовательность действий такова : порезали рестриктазой изучаемый участок ДНК – вставили каждый ее отрезок в молекулу вектора (бактериальной , дрожжевой или другой кольцевой ДНК ), разрезанную в о д ной точке той же рестриктазой : получилась рекомбинантная кольцевая ДНК с "чужой " вставкой . Такую смешанную ДНК "вселяют " в ядро клетки-хозяина (обычно бактерии ), и та принимается делиться в культуре , благод а ря рекомбинантная ДНК – и.о . ее генома – размножается практически до любого количества копий . Результат – набор клонов разных фрагментов картируемой ДНК , или , как его обычно называют , библиотека клонов. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР ) – лабораторный си н тез фрагментов ДНК без клетки-хозяина . В пробирку к фрагменту , который надо размножить , "подсаживают ": а ) фермент ДНК-полимеразу , который осуществляет воспроизведение ДНК в живых клетках ; б ) стройматериал , т.е . отдельные нуклеотиды ; в ) прамеры – короткие цепочки нуклеотидов , соответствующие ко н цам размножаемого фраг мента . Тут , как видите , слабое место метода : про упомянутый участок надо кое-что знать заранее – а именно структуру пра й меров… Затем пробирку нагревают – фрагмент от жары "расклеивается ", ра з деляясь на две цепи ; пробирку охлаждают – праймеры присоединяютс я к концам фрагмента и полимераза начинает свое дело . Чередуя нагревания и охлаждения , можно за полтора часа довести количество копий нужного участка ДНК до нескольких миллионов – в чем и состоит главное преим у щество ПЦР перед клонированием . Но у нее есть два недостатка . Один уже упомянут – нужно знать праймеры "в лицо ", иначе реакцию не удастся з а пустить . Второй – техническая невозможность копировать фрагменты длиннее 5-6 п.н. После того как все фрагменты ДНК получены в достаточном колич е стве копий , их упо рядочивают , для чего сперва разделяют электрофорезом , а затем химически связывают (гибридизуют ) с меченым зондом , чтобы ка ж дый фрагмент встал на свое место и , так сказать , просигналил о себе : вот он я ! Крупномасштабные физические карты генома бывают двух т ипов . Первый – МАКРОРЕСТРИКЦИОННЫЕ (по принципу "сверху вниз "): ДНК режут редкощепящей рестриктазой на крупные куски , упорядочивают их , потом делят на более мелкие , которые тоже упорядочивают . Такая карта охватывает довольно большие участки генома – до 10 Мб – и не содержит пробелов . Но ее разрешение сравнительно невелико – от 1 Мб до 100 кб. Гораздо выше точность у КАРТ КОНТИГ . Их строят по обратному принципу – "снизу вверх ". Хромосому шинкуют на очень короткие фра г менты , размножают их и упорядочивают . Наб ор упорядоченных коротких фрагментов , покрывающих определенный участок хромосомы , - это и есть контига . А где сама она расположена на хромосоме , можно установить м е тодом FISH . Правда , карту контиг трудно расширить до крупных районов хром о сомы , поскольку не льзя размножать большие фрагменты ДНК – ни клон и рованием , ни ПЦР . Хотя в последние годы достигнут серьезный успех : уд а лось создать гигантскую молекулу-вектор , в которую можно встроить уч а сток человеческой ДНК размером до мегабазы . Этот вектор называется YA C – the yeast artificial chromosome , искусственная дрожжевая хромосома . До внедрения YAC в качестве векторов применялись в основном бактер и альные плазмиды – крошечные колечки ДНК , несшие вставки чужеродного материала максимум в 20-40 кб . Смысл применения Y AC – значительное уменьшение числа клонов , которые нужно упорядочивать. Прогулка по хромосоме Все описанные выше методы позволяют создавать либо приблиз и тельные карты обширных регионов генома , либо подробные "топографич е ские планы " мелких его участков . К ак совместить то и другое – закартир о вать большой район , но детально ? Современная стратегия заполнения пробелов – прогулка по хромос о ме . Ее начинают с какого-нибудь короткого участка , чья нуклеотидная п о следовательность уже расшифрована . По ней синтезируют праймер , гибр и дизируют его с первым попавшимся клоном из неупорядоченной геномной библиотеки , а затем "подключают к делу " полимеразу – она делает цепь , комплементарную данному клону . Затем эту цепь секвенируют , а ее хвостик используют в качестве праймера для следующего шага по хромосоме. Вот и прозвучало слово "секвенирование ". Так называется новейший , прославленный , подробнейший , точнейший… и , с позволения сказать , т я гомотнейший метод картирования генома . Его сущность – полная расши ф ровка последовательнос ти нуклеотидов . Чтобы в деталях объяснить , как она осуществляется , потребовалась бы двухчасовая лекция по молекулярной биологии . Посему в двух словах : из библиотеки клонов извлекают фрагмент ДНК , вновь клонируют , а получившиеся копии химически преобразуют в набор отрезков ДНК , различающихся по длине лишь на один нуклеотид (вот именно эту стадию практически невозможно описать общедоступным яз ы ком – настолько она сложна даже для генетика-профессионала ). Затем уп о мянутые отрезки разделяются на гелевой пластинк е в пул ь сирующем эле к тромагнитном поле (пульс-форез ). Послед о вательность нуклеотидов ч и тают по фореграмме : каждый отрезок "уезжает " по гелевой пластинке настолько далеко , сколь велика его длина , и з а нимает место в одном из чет ы рех стол б цов – в зависимости от того , на какой нуклеотид (а их всего четыре типа ) он дли н нее соседнего. Хотя современные ус о вершенствования позволяют изучать одновр е менно до 40 клонов на одном геле , затраты времени и средств все равно огром ны . Даже опытная раб о чая группа на лучшем обор у довании секвен и рует в год не более 100000 п.н . в год . Если принять стоимость анализа ка ж дой пары оснований за доллар – весь геном человека может быть секвен и рован за 3000 лет , и обойдется его изучение в 3 милл и арда долларов . Сумма по нынешним временам вполне приемлемая хотя бы на слух , но вот время… Сейчас , правда , развиваются технологии секвенир о вания второго поколения – высоковольтный капиллярный электрофорез , ионизационная резонансная спектроскопия . Они уско ряют процесс на пор я док – стало быть , хватит трех веков (за те же деньги ). Обнадеживает , но не слишком. По всей видимости , программа "Геном человека " будет успешно в ы полнена лишь по технологиям третьего поколения , ныне существующих в зачаточном состоянии . К ним в частности , относится прямое чтение посл е довательности нуклеотидов с помощью сканирующей туннельной или атомной микроскопии . Сегодняшняя наука делает ставку именно на такие методы – иначе прогулка по человеческим хромосомам грозит затянуться на тыся челетия. Заключение И вот на глаза мне попалась журнальная заметка , датированная ма р том 2000 года , о том , что расшифрована последовательность ДНК 22-й ч е ловеческой хромосомы . Это первая наиболее полная расшифровка целой структуры в генетическом аппарате человека и – 1 /23 часть глобального проекта "Геном человека ". Впечатляют масштабы коллективного авторства – 216 ученых из Великобритании , США , Японии , Канады и Швеции . Только эта хромосома содержит более 20 генов , изменения в которых приводят к известным з аболеваниям человека , в частности (предположительно ), и один из генов , обусловливающих шизофрению . Для полного раскрытия генома человека трудиться еще придется долго . Однако , по мнению руководителя геномного проекта Фрэнсиса Коллинза , нынешнее достижение м ожно уже сравнить с "расщеплением атома или полетом на Луну ". Жуль Верн в своем романе "20 тысяч лье под водой " предполагал с о здание машины , позволяющей человеку изучать морские глубины . Теперь батискафами , изобретенными Жаком Ивом Кусто , пользуется весь м ир , с о вершенствуя знания о морской флоре и фауне . В 1990 году Гарри Гарриссон в романе "Спасательная шлюпка " описал создание сильных , здоровых , но генетически подавленных рабов . А теперь… Может человечеству стоит задуматься над другими последствиями расшиф ровки генома человека , кроме искоренения наследственных забол е ваний . Ведь не ровен час , когда они , эти последствия сами "свалятся нам на голову ". Вспоминая нацистские чистки , начитавшегося Ницше , Гитлера , исп ы тания Водородной бомбы , попытки Генриха Гиммлер а создать сверхчелов е ка , возникает вполне резонный вопрос : А ЧТО ДАЛЬШЕ ? Список литературы 1. Журнал "Техника Молодежи ". Разные материалы за 1999-2000 г. ; 2.