Реферат: Рекомбинантные вакцины - текст реферата. Скачать бесплатно.
Банк рефератов, курсовых и дипломных работ. Много и бесплатно. # | Правила оформления работ | Добавить в избранное
 
 
   
Меню Меню Меню Меню Меню
   
Napishem.com Napishem.com Napishem.com

Реферат

Рекомбинантные вакцины

Банк рефератов / Биология

Рубрики  Рубрики реферат банка

закрыть
Категория: Реферат
Язык реферата: Русский
Дата добавления:   
 
Скачать
Microsoft Word, 2479 kb, скачать бесплатно
Заказать
Узнать стоимость написания уникального реферата

Узнайте стоимость написания уникальной работы

ОГЛАВЛЕНИЕ Введение………………………………………………………………………………………… .3 1. Принц ипы конструирования рекомбинантных противовирусных вакцин………… ..4-24 1.1. Получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты……………....… .4 1.2. Выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом отно - шении модели вектора-носи теля и клонирование соответствующего гена…… 9-21 1.2.1. Получение рекомбинантных ДНК…………………………………………… 9 1.2.2. Получение рекомбинантных РНК………………………………………… ...11 1.2.3. Стратегия клонирования генов………………………………………….… 13 1.2.4. Разнообразие векторных молекул………… ……………………………… 17 1.3. Выбор системы экспрессии клонированного гена , способной обеспечить максимальный выход и функциональную полноценность продукта…………… ..22 1.4. Создание достаточно удобных и по возможности универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки и ткани организма………………………… 23 2. Вакцина против лейкемии кошек , изготовленная с помощью генной инженерии……………………………………………………………………………….… 24 Список литературы…………………………………………………………………………… .26 ВВЕДЕНИЕ Существую щие традиционные вакцины , несмотря на очевидный положительный эффект их широкого применения , обладают рядом недостатков . К ним относятся : наличие нежелательных биологически активных и балластных компонентов в препаратах , непо л ноценные иммунологические свой ства самих антигенов . Кроме того , существуют забол е вания , не вызывающие иммунитета , вакцины против которых вообще отсутствуют и не могут быть сконструированы на основе классических принципов . Все это вызывает нео б ходимость усовершенствования уже существующ их вакцин и создания принципиально новых типов вакцин . Одним из наиболее перспективных направлений в данной области является получение вакцинных препаратов на основе методов генной инженерии. Последним достижением генной инженерии и биотехнологии стало со здание р е комбинантных противовирусных вакцин , содержащих гибридные молекулы нуклеиновых кислот . Данные вакцины обладают целым рядом преимуществ . Они характеризуются о т сутствием (или значительным снижением ) балластных компонентов , полной безвредн о стью , низк ой стоимостью , которая связана с удешевлением промышленного производства вакцин . Экспрессируемый в клетках вакцинированного животного белок имеет конфо р мацию , близкую к нативной , и обладает высокой антигенной активностью. Таким образом , рекомбинантные прот ивовирусные вакцины являются новейшим поколением вакцин . Их очевидное преимущество обуславливает широкое применение данного типа вакцин в медицине и ветеринарии для вакцинации населения и сельскох о зяйственных животных . 1. ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРО ВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН Важным условием получения эффективного вакцинного препарата является с о блюдение основных принципов его производства . Конструирование рекомбинантных пр о тивовирусных вакцин предполаг ает : 1) получение соответствующего фрагмента нукле и новой кислоты ; 2) выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом о т ношении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена (или генов ); 3) выбор системы экспрессии клонированного г ена , способной обеспечить максимальный выход и функциональную полноценность продукта ; 4) создание достаточно удобных и по возможности универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки и ткани орг а низма. 1.1. ПОЛУЧЕНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТА Н УКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Для конструирования рекомбинантных РНК или ДНК необходимо получить фра г мент нуклеиновой кислоты , который в дальнейшем и будет встраиваться в векторную м о лекулу . Фрагменты ДНК для встраивания в вектор можно получить непосредственно из х ромосомной ДНК , расщепив ее рестриктазами или разрушив случайным образом (например , с помощью ультразвука ) на сегменты с примерно одинаковой длиной . Выд е ление генов с помощью "вырезания " из генома , как правило , состоит из четырех этапов : 1) получение клоно теки фрагментов генома ; 2) выявление фрагментов генома , содержащих необходимый ген , и точная локализация гена в данном фрагменте ; 3) вырезание гена из фрагмента (ов ) с помощью рестриктаз и сшивка участков гена с помощью ДНК-лигазы ф а га Т 4, если эти участки получены из различных фрагментов ; 4) амплификация гена в с о ставе векторной молекулы . Указанный способ получения генов является наиболее прие м лимым применительно к протозойным возбудителям , бактериям и для некоторых сложно устроенных ДНК-содержащих вирусов. Такие операции проводятся , в частности , при с о здании так называемых "библиотек генов ", то есть набора одинаковых векторных систем , в совокупности несущих в себе весь геном данного организма . Однако этот подход имеет ряд существенных недостатков . Во-первых , очень сложна задача подбора рестриктаз , по з воляющих вырезать из геномной ДНК или клонированного фрагмента генома цельный ген . Как правило , вместе с геном остаются фланкирующие его лишние нуклеотидные п о следовательности , что мешает дальнейшему использован ию этого гена , или же рестрикт а зы отрезают часть гена , делая его функционально неполноценным . Во-вторых , создание клонотеки генома возбудителя представляет специальную задачу и требует больших з а трат времени . Наконец , для ряда ДНК-содержащих вирусов (папов авирусы ) доказан сплайсированный характер структуры генов . Вполне понятно , что выделенные гены этих вирусов вследствие наличия интронных областей не будут проявлять функциональной а к тивности в бактериальных клетках и окажутся непригодными при решении задач по ко н струированию рекомбинантных противовирусных вакцин . В-третьих , если ген составляет незначительную долю от всей геномной ДНК , то возникают большие трудности с его из о ляцией и идентификацией. Наиболее распространенным является путь получения генов чер ез синтез ДНК-копий (кДНК ) информационных или каких-либо других (в оптимальном случае - индив и дуальных ) РНК путем их обратной транскрипции . Данный способ включает в себя три этапа : 1) выделение высокоочищенных мРНК , кодирующих индивидуальные структурные бе лки , либо выделение геномных РНК вирусов ; 2) синтез двухцепочечной ДНК (гена ) на матрицах РНК ; 3) амплификация гена с помощью методов молекулярного клонирования. Как отмечалось , первым этапом в получении генов с помощью методов обратной транскрипции служит выделение и очистка геномных РНК и мРНК . Геномные РНК выд е ляют главным образом из очищенных вирионов , а мРНК - из инфицированных клеток . Для выделения мРНК из инфицированных клеток используют различные способы . В о д ном из вариантов выделение мРНК из инф ицированных клеток проводят непосредственно из лизированных клеток (лизис осуществляют в денатурирующих средах в целях предо т вращения разрушающего действия нуклеаз на мРНК ) с последующей экстракцией фен о лом и хлороформом или центрифигурированием лизата чер ез подушку 5,7 M С sCl (для освобождения от клеточных ДНК ) и заключительной аффинной хроматографией на ол и го ( d Т )-целлюлозе (поли (У )-сефарозе ). Выделение мРНК можно проводить и из очище н ных полирибосом инфицированных клеток . В случае необходимости получения специфических мРНК , ко дирующих индивид у альные структурные белки возбудителя , исполь зуют следующий способ . Инфицирова н ные вирусом клетки разрушают механическим путем или химическими методами (испол ь зование неионных детергентов ). Клеточный лизат освобожда ют от ядер и митохондрий методом диф ференциального центрифугирования и подвергают хроматографии на ант и тельном сорбенте . При этой процедуре с антителами , специ фичными к определенному структурному белку возбудителя , связы ваются полисомы , осуществляющие с интез этого белка . Также может быть использован метод непрямой иммунопреципитации полисом , при котором комплекс антитело - полисома преципитируется из раствора добав лением второго антитела , специфичного к первому . В качестве второ го антитела чаще всего б ерут фиксированные формалином клетки Staphilococcus aureus , на поверхности которых нах о дится так назы ваемый белок А , имеющий сродство к Fc-фрагментам Ig . Из полисом , п о лученных одним из описанных способов , далее уже выделяют мРНК . Другой путь выделения и ндивидуальных мРНК базируется на свойстве мРНК вз а имо действовать с комплементарными ДНК , связанными с твердым носи телем (целлюлоза , сефароза , нитроцеллюлозные фильтры ). Этот ме тод отбора и очистки специфических мРНК является самым эффективным . Однако ег о применение возможно только при нал и чии соответст вующих комплементарных ДНК. Получение препарата очищенной мРНК позволяет перейти к ра ботам по синтезу гена с помощью обратной транскрипции , которую осуществляют с помощью ревертазы AMV в специально подобр ан ных условиях . В процессе обратной транскрипции матрицей служит мРНК , а затравкой олиго ( dT 12-18 ) (для мРНК , имеющих поли (А )-тракт ) или хим и чески синтезированный олигонуклеотид , комплемен тарный 3'-концу мРНК . После синтеза на мРНК компле ментарной цепи Д НК и разрушения РНК (чаще используется обра ботка щелочью ) осуществляют синтез второй цепи ДНК . В этой реакции матрицей служит пе р вая цепь ДНК . Реакция может катали зироваться как ревертазой , так и ДНК-полимеразой . После получения двухцепочечной кДНК след ует стадия получения гена , заключ а ющаяся в гидролизе одноцепочечного участка ДНК , соединяющего первую и вторую ц е пи , нуклеазой S 1 . Для получения необходимых участков РНК используют две группы способов : 1) расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК в заданно м месте ; 2) синтез РНК (ферме н тативный на ДНК - или РНК-матрицах и химический ). Расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК может осуществляться в прису т ствии различных ферментов . Для этой цели используют ферменты : рибонуклеазу H , ну к леазы , ковалентно связанн ые с олигонуклеотидами (например , стафилококковая нукл е аза ), рибозимы (например , рибозим L -19). Исторически первым способом направленной ферментативной фрагментации РНК (называемой также адресованной , сайт-направленной или сайт-специфической фрагме н тацией РНК ) является разработанный в Московском университете метод гидролиза РНК ферментом РНКазой H в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов . Этот метод до сих пор остается наиболее универсальным способом направленной фра г ментации РНК. Метод осн ован на свойстве РНКазы Н расщеплять полирибонуклеотидную цепь РНК в составе ДНК-РНК-гетеродуплекса . К участку РНК , по которому планируется пр о вести ее фрагментацию , синтези руется комплементарный олигодезоксирибонуклеотид длиной в 6-10 нуклеотидных остатк ов . Далее получают комплекс этого олигонуклеотида с РНК , который затем обрабатывают ферментом . В работе обычно используют РНКазу Н из Escherichia coli - вполне доступный фермент , который может быть довольно легко очищен от всех сопутствующих нуклеазных при месей . Этот метод нашел достаточно широкое применение для сайт-специфического расщепления вирусных и рибосомных РНК , а также для иден тификации продуктов процессинга некоторых РНК. Важным достоинством рассматриваемого метода является и то , что в результате гидролиза РНК рибонуклеазой Н образуются фраг менты , у одного из которых на 5'-конце содержится фосфатная группа , а у другого 3'-конец свободен (нефосфорилирован ). Такие фрагменты можно прямо использо вать в реакции ферментативного лигирования. Серьезным ограничением этого метода является то , что участок РНК , с которым связывается комплементарный ему олигодезоксири бонуклеотид , должен иметь однотяж е вую конформацию и находиться на поверхности макромолекулы РНК , представляющей собой в усло виях расщепления к омпактную глобулу с развитой вторичной струк турой . В отдельных случаях это ограничение удается преодолеть , ис пользуя достаточно длинные олигодезоксирибонуклеотиды (15-20-членные ), которые предварительно отжигают с ч а стично или полно стью денатурированной РНК. Другое ограничение метода фрагментации полирибонуклеотидов РНКазой Н в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов заключается в том , что в общем случае предсказать , какая из фосфодиэфирных связей в гетеродуплексе (или в непосредственной близости от него ) подвергнется расщеплению , не удается . Более того , фермент зачастую гидролизует не одну , а несколько соседних межнуклеотидных связей . Ясно , что для последующего конструирования рекомбинантных РНК такие фрагменты могут оказаться непригодны м и. Расщепление РНК может проводиться и с участием нуклеаз , ковалентно связанных с олигонуклеотидами . Идея , лежащая в основе данного подхода к направленной фрагме н тации РНК , восходит к концу 60-х годов , когда Н . И . Гриневой и ее сотрудниками был предложен м етод олигонуклеотид-направляемой модификации нуклеиновых кислот . Принцип этого метода заключается в том , что с 5'- или 3'-концевым остатком олигону к леотида , комплементарного заданному району ДНК и РНК , связывают модифицирующий агент , который после образова ния дуплекса атакует одно из ближайших к нему основ а ний . Реагентами этого типа удалось направленно фрагментировать фенилаланиновую тРНК из дрожжей , РНК-компонент ( M 1 РНК ) РНКазы Р , а также 16 S рибосомную РНК E . coli . Однако , как и в случае РНКазы Н , расщеп ление РНК олигонуклеотид-нуклеазой зачастую проходит по нескольким межнуклеотидным связям , что несколько ограничивает возможности применения этого метода для получения рекомбинантных РНК. Для расщепления РНК применяют также рибозимы (природные РНК и синте тич е ские полирибонуклеотиды , способные катализировать целый ряд превращений у других РНК ). Первый рибозим , напоминающий по своим свойствам эндонуклеазы рестрикции , был получен Т . Чеком . В научной литературе его обозна чают как рибозим L -19. Этот р и бозим пр едставляет собой РНК длиной в 395 нуклеотидных остатков , в 5'-концевой обл а сти которой имеется гексануклеотидная последовательность GGAGGG , ответст венная за специфичность расщепления предшественника 26S РНК при самосплайсинге . Эта посл е довательность компл ементарна CUCUCU последовательности , расположенной на 3'-конце первого экзонного участка предшественника 26 S РНК . Если эту РНК заменить другой , но обязательно содержащей доступную для комплементарного связывания CUCUCUA п о следовательность , то рибозим L -19 в присутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов со свободной 3'-гидроксильной группой расщепит ее . Источником необходимых участков РНК может служить такой способ , как синтез фрагментов РНК . Ферментативный синтез сегментов РНК осуществляют с использован и ем разнообразных генно-инженерных конструкций . Однако в настоящее время в подавл я ющем большинстве случаев для препаративного получения РНК используются РНК-полимеразы , закодированные в геномах ряда ДНК-содержащих бактериофагов (Т 3, Т 7 и SP 6). Они характер изуются очень высокой активностью и , в отличие от клеточных РНК-полимераз , состоят из одной полипептидной цепи . Важно также то , что инициация и те р минация синтеза РНК этими полимеразами происходит на одном определенном нукле о тидном остатке. Полученные одни м из способов фрагменты нуклеиновых кислот в дальнейшем встраивают в векторные молекулы. Подводя итог изложенному , можно сделать вывод , что получение генов протекти в ных белков возбудителей представляет собой достаточно сложную задачу . Однако ее р е шение нео бходимо для создания в конечном счете рекомбинантных противовирусных вакцинных препаратов. 1.2. ВЫБОР ВЫСОКОАКТИВНОЙ И ХОРОШО ИЗУЧЕННОЙ В ИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ МОДЕЛИ ВЕКТОРА-НОСИТЕЛЯ И КЛОНИРОВАНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ГЕНА 1.2.1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИ НАНТНЫХ ДНК Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключается во встраивании фра г ментов ДНК , среди которых находится интересую щий нас участок ДНК , в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы ) - плазмидные или вирусные ДНК , кот о рые могут быть перенесены в клетки про - или эукариот и там автономно репли-цироваться . На следующем этапе проводится отбор тех клеток , кото рые несут в себе р е комбинантные ДНК (с помощью маркерных призна ков , которыми обладает сам вектор ), и затем индивидуальных кл онов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы , специфичные для данного гена или участка ДНК ). При решении ряда научных и биотехнологических задач конст руирование реко м бинантных ДНК требует также создания систем , в ко торых обеспечивается максимальная экспрессия клонируемого гена. Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторные м о лекулы . В первом случае 3'-концы фрагментов ДНК , среди которых находится интерес у ющий нас участок ДНК (ген или его сегм ент , регуляторный район ), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной послед о вательностью (например , поли (Т )). 3'-концы ли нейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комп лементарной ей гомополинук леотидной последовательн о стью (то есть по ли (А )). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплемен тарного спаривания искусственно полученных "липких " концов. Во втором случае "липкие " концы создаются с помощью расщеп ления молекул ДНК (как вектор ной , так и содержащей интересующий нас фрагмент ) одной из энд о нуклеаз рестрикции (рестриктаз ). Рестриктазы характеризуются исключительно высокой специ фичностью . Они "узнают " в ДНК последовательность из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них с трого определенные межнуклеотидные связи . Поэтому д а же в ДНК больших размеров рестриктазы вносят ограниченное число разрывов . Третий способ представляет собой комбинацию двух первых , когда липкие концы ДНК , образованные рестриктазой , удлиняются синтетичес кими последовательностями (рис . 1). Концы фрагментов ДНК можно превратить в "липкие ", наращи вая их двутяжевыми олигонуклеотидами ("линкерами "), в состав кото рых входит участок узнавания рестрикта- Рисунок 1 . Схема конструирования рекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз PstI и поли ( G )- поли (С )-линкера. зой . Обработка такого фраг мента данной рестриктазой делает его пригодным для встра и вания в векторную м олекулу ДНК , расщепленную той же рестриктаэой . Часто в качестве "линкера " применяются полинуклеотидные фрагменты , ко торые содержат специфические участки сразу для нескольких рестриктаз (их называют "полилинкерами "). После встраивания чужеродной ДНК в вект ор их ковалентное сшивание осущест в ляется ДНК-лигазой . Если же размер бреши в рекомбинированной молекуле превышает одну фосфодиэфирную связь , она застраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарирующих систем клетки. 1.2.2. ПОЛУ ЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ РНК Получение рекомбинантных РНК обычно осуществляют методами ферментативн о го или химического лигирования РНК . Кроме того , недавно появилась принципиально но вая возможность встраивания сегмента РНК в заданное положение других молекул РНК с помощью рибозимов. Ковалентное сшивание отдельных сегментов РНК при получении рекомбинантных молекул , как правило , осуществляют с помощью Т 4 РНК-лигазы . Т 4 РНК-лигаза закоди рована в геноме бактериофага Т 4. Ее выделяют из клеток E . coli , зараженных э тим фагом . Фермент сшивает друг с другом однотяжевые олиго - и полирибонуклеотиды . Для работы Т 4 РНК-лигазы необходим источник энергии - аденозинтрифосфат . На рис . 2 приведена схема ферментативного лигирования двух коротких олигонуклеотидов . Как видно из э т ой схемы , акцептором в реакции лигирования служит пол ностью дефосфорилированный , а донором - полностью фосфорилированный по концевым нуклеотидным остаткам олиг о нуклеотид . Это предотвращает возможность сшивания однотипных олигонуклео тидов. Эффективность ф ерментативного лигирования достаточно длинных полирибону к леотидов сильно варьирует и ее трудно предсказать исходя только из нуклеотидной п о следовательности сегментов РНК . Наилучшие результаты получены в тех случаях , когда сшиваемые концы полирибонуклеотидо в были пространственно сближены за счет ко м плементарного связывания соседних с ними участков РНК. Недавно было установлено , что протяженные сегменты РНК (длиной в 200-300 остатков ) могут быть с высоким выходом сшиты Т 4 ДНК-лигазой . При этом "стыковка " сегм ентов осуществляется с по мощью олигодезоксирибонуклеотида , комплементарного 3'-концу одного сегмента и 5'-концу другого. Метод химиче ского лигирования основан на активации концевой фосфатной гру п пы одного из двух сшиваемых сегментов РНК водораство римым карбодиимидом или Рисунок 2 . Схема сшивания двух олигорибонуклеотидов с помощью Т 4 РНК-лигазы. BrCN . В случае BrCN реакция про текает очень быстро и не сопровождается модификац и ей нуклеотид ных остатков , хотя под действием карбодиимидов фосфодиэфирная связь образуется с более высоким выходом . Для того , чтобы обеспечить сближенность сшива е мых концевых нуклеотидных остатков в фрагментах РНК , было предло жено использовать олигодезоксирибонуклеотиды , комп лементарные обоим фрагментам в месте их стыка . Химическое лигирование РНК , как правило , проходит с существенно меньшим выходом , чем ферментативное . Однако оно позволяет получать рекомбинантные РНК с необ ычными типами межнуклеотидной связи (например , пирофосфатной ) и необычными нуклеотидными остатками в месте стыка двух фрагментов. Получение рекомбинантных РНК с помощью рибозимов основано на обратимости реакции самосплайсинга (при отсутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов ). Это предоставляет возможность для встраивания интронной РНК в заданный участок другого сегмента РНК (рис . 3). Фрагмент РНК , в который производится встраивание , должен с о держать нуклеотидную последовательность , идентичную нуклеотидн ой последова тельности 3'-концевого участка 5'-экзонного района 26 S РНК и соот ветственно компл е ментарную той нуклеотидной последовательности в интроне , которая отвечает за спец и фичность прямой реакции . Фраг мент , в который производится встраивание , беретс я в и з бытке. В настоящее время описанная здесь цепь реакций может быть реализована только для интронной РНК , получаемой из предшест венника 26S РНК тетрахимены . Однако можно думать , что конструи рование новых рибозимов может существенно расширить возможнос ти этого подхода. 1.2.3. СТРАТЕГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ Векторные молекулы в обязательном порядке содержат маркерные гены , которые после переноса вектора в клетки-реципиенты сообщают им новые свойства . Это может быть устойчивость к антибиотику , которой до трансформации клетки не обладали , или образование фермента , синтез которого в клетках-реципиентах не происходил . Благодаря таким вновь приобретенным признакам клетки с векторными ДНК могут быть легко найдены в популяции исходных клеток . Одновременно могут быть отобраны те клетки , которые содержат векторы со встроенными в них чужеродными ДНК (рекомбинантные ДНК ). Для этого встраивание чужеродной ДНК в вектор производится таким образом , чтобы один из маркерных признаков вектора нарушался . Так , например , если бактериал ь ный вектор несет устойчивость к двум антибиотикам , то чужеродную ДНК встраивают в один Рисунок 3 . Схема прямого и обращенного процесса самосплайсинга. из генов антибиотической устойчивости . И тогда бактерии с рекомбинантной ДНК , в о т личие от бактерий с исходным вектором , могут расти в присутствии только одного из а н тибиотиков. Другой весьма распространенный пример связан с наличием в векторной Д НК наряду с генами , сообщающими клетке устойчивость к антибиотикам , фрагмента лакто з ного оперона , обеспечивающего об разование в клетках-реципиентах активного фермента -галактозидазы . Колонии клеток с таким признаком легко обн аруживаются при выращ и вании их на твердом агаре , содержащем в качестве субстрата -галактозидазы 5-бром -4-хлор -3-индолил- -галактозид ( X - gal ), по скольку его расщепление приводит к образов а нию бромх лориндола - красителя , окрашенного в голубой цвет . Если же в ген -галактозидазы этого вектора встроена чужеродная ДНК таким образом , что этот ген ок а зался нарушенным , то трансформированные им клетки будут обра зовывать бесцвет ные колонии . Само же присутствие рекомбинантного вектора в клетках может быть зафикс и ровано по их устойчивости к антибиотику. На следующем этапе среди популяции клеток с рекомбинантными векторами нео б ходимо отобрать индивидуальные клоны , содержа щие только интересующие нас гены или их фрагменты . Само собой разумеется , что это в принципе возможно только в том случае , если в исходные клетки проникло в среднем по одной молекуле рекомбинантной ДНК . Способ же отбора клонов в значительной степени зависит от прир о ды клонируемого гена. По-видимому , самым простым является случай , когда клониру емый ген способен комплементировать ауксотрофную мутацию в штамме-реципиенте . В этом случае клетки высеваются на среду , ли шенную вещества , необходимого для роста данного штамм а , и только клетки , содержащие рекомбинантную ДНК с искомым геном , способны расти на этой среде . Из таких клонов получают гомогенную культуру клеток , которую используют для получения искомого сегмента ДНК , проделывая все операции в обратном порядке (то е с ть из клеток выделяют вектор , из него вычленяют необходимый фрагмент ДНК и так далее ). Гораздо чаще для отбора необходимых клонов приходится при бегать к методу ДНК-ДНК - или ДНК-РНК-гибридизации . Для этого необходимо располагать "зондами " (индивидуальными молекула ми ДНК или РНК или их фрагментами ), комплементарными нуклеотидной последовательности клонируемого гена . Это могут быть специ ально синт е зированные олигодезоксирибонуклеотиды длиной в 15-20 остатков , последовательность которых выбрана на основании полно стью или частично известной первичной структуры гена или закодиро ванного в нем белка . Это могут быть кДНК , синтезированные на инди видуальных РНК-копиях данного гена (как таковые или в виде отклонированных , то есть существенно умноженных в количест в е фрагментов ДНК ). Наконец , это могут быть сами индивидуальные РНК , закодированные в данном гене . Ясно , что во всех случаях "зонды " должны нести радиоактивную метку (обычно 32 Р ) с достаточно высокой удельной акти в ностью . Если же индивидуальный "зонд " недо ступен , то применяют методы , которые из большого числа рекомбинантов (10 6 ) позволяют выбрать сравнительно небольшую группу (около 10 2 ), включающую рекомбинант с искомым геном . Эта группа подразделяется на подгруп пы (например , на 10) по 10 рекомбинантов . И з каждой подгруппы выделяется ДНК , которую используют для синтеза мРНК и последу ющей трансляции ее с целью о б наружения соответствующего продукта искомого гена. Трансляция мРНК может быть осуществлена в бесклеточной системе . Однако в случае эукариотических генов мРНК часто перено сят в ооциты лягушки (ксенопуса ) с п о мощью техники микроинъек ции , где она транслируется . Продукт трансляции обычно о б наружива ют с помощью антител. Далее в подгруппе , где обнаружен искомый ген , тем же методом исследуется ка ж дый кл он. При наличии зонда с чашки Петри , на которой выращены колонии клеток , делается отпечаток (реплика ) на нитроцеллюлозном фильтре . Клеткам дают вырасти на фильтре , затем их разрушают , подвергают ДНК щелочной денатурации и фильтр прогревают при 80°С , после чего ДНК необратимо с ним связывается . Фильтр отмыва ют от примесей и обрабатывают радиоактивным "зондом " в условиях , оптимальных для ДНК-ДНК - или ДНК-РНК-гибридизации . После удаления избытка "зонда " методом ауторадиографии определяют поло жение клеточног о клона , содержащего участок ДНК с нуклеотидной п о следовательностью , комплементарной "зонду ". Этот клон становит ся затем источником клеток для получения искомого гена или его фрагмента. Для селекции клонов , несущих необходимый ген , достаточно широко примен яются и иммунологические методы . Принцип отбора на первых этапах тот же , что и при испол ь зовании ДНК - и РНК-зондов . Далее с колоний с рекомбинантными ДНК делается реплика с помощью полимерной пластинки , на которой закреплены антитела к продукту искомого ге на . Положение клонов , вырабатывающих этот белок , опре деляется также с помощью антител , но уже меченных радиоактивным йодом ( 125 I ). 1.2.4. РАЗНООБРАЗИЕ ВЕКТОРНЫХ МОЛЕКУЛ Под понятием "вектор " понимается молекула нуклеиновой кислоты , способная п о сле вве дения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов р е пликации и транскрипции . Векторные молекулы должны обладать следующими свой ствами : 1) способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте , то есть быть самостоятельным реп ликоном ; 2) содержать один или несколько маркерных генов , благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые призна ки , позволяющие отличить трансформир о ванные клетки от исходных ; 3) содержать по одному или , самое большее , по два участка (са йта ) для различных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов ), но не в области , ответственной за их репликацию. В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы : 1) используемые для клонирования и а мплификации нужного гена ; 2) специал и зированные , применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов . Вторая группа векторов объединяет векторы , призванные обеспечить синтез белковых продуктов клон и рованных генов . Векторы для экспрессии содержат последо вательности ДНК , которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток. В качестве прокариотических векторов используются плазмиды , бактериофаги ; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений , векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и ряд искусственно сконструированных векторов , способных реплицироваться как в бактериальных , так и в эукариотических клетках (че л ночные векторы ). Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы п ро - и эукариот , которые автономно реплицируются в клетках . Большинство плазмидных векторов получено на о с нове природных плазмид ColE 1, pMB1 и p15A. Бактериальные плазмиды делят на два класса . Одни плазмиды (например , хорошо изученный фактор F , определяю щий пол у E . coli ) сами способны переходить из клетки в клетку , другие такой способно стью не обладают . По ряду причин , и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генети ческого материала , подавляющее большинст во бактериальных плазмидных векторов с о здано на базе плазмид второго класса . Многие при родные плазмиды уже содержат гены , определяющие устойчивость клеток к антибиотикам (продукты этих генов - ферменты , модифици рующие или расщепляющие антибиотические вещ ества ). Кроме того , в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнитель ные гены , определяющие устойчивость к другим антибиотикам. На рис . 4 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E . coli - pBR 322. Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E . coli - колициноге н ного фактора ColE 1 - и содер жит ориджин репликации этой плазмиды . Особенность пла з миды ColE1 (и pBR322 соответственно ) состоит в том , что в присутствии ингибитора си н теза белка антибиотика хлорамфеникола (оп осредо ванно ингибирующего репликацию х о зяйской хромосомы ) ее число в E . coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку , что позволяет получать большие количества клонируемого гена . При конструирова нии вект о ра pBR322 из исходных плазмид был делегирован целый ряд "лишних " сайтов для р е стриктаз. В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E . coli сконструированы плазмидные векторы для ряда дру гих грамотрицательных бактерий (в том числе таких промышленно важных , как Pseudomonas , Rhiz obium и Azotobacter ), гра м положительных бактерий ( Bacillus ), низших грибов (дрожжи ) и растений. Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагме н тов (до 10 тыс . пар оснований ) геномов небольших размеров . Если же требуется получить к лонотеку (или библиотеку ) генов высших растений и животных , общая длина генома к о торых достигает огромных размеров , то обычные плазмидные векторы для этих целей н е пригодны . Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использован ием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага . Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созда ны на базе геномов бактериофагов и М 13 E . coli . ДНК этих фагов содержит протяженные области , которые можно делегировать или за менить на чужеродную ДНК , не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E . coli . При конструировании семейства векторов на базе ДНК фага из нее сначала (путем д елений коротких участков ДНК ) были удалены многие са й ты рестрикции из области , не сущест венной для репликации ДНК , и оставлены такие са й ты в области , предназначенной для встраивания чужеродной ДНК . В эту же область часто встраивают маркерные гены , позволя ющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора . Такие векторы широко использу ются для получения "библиотек генов ". Раз меры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраи ваемого участка чужеро д ной ДНК ограничены 15-17 тыс . нуклеотидных остатков , так как рекомбинантный фаго - Рисунок 4 . Детальная рестрикционная карта плазмиды pBR 322. вый геном , который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого фага , уже не м о жет быть упа кован в фаговые частицы. Таких ограничений теоретически не существует для векторов , сконструированных на базе нитчатого бактериофага М 13. Описаны случаи , когда в геном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс . нуклеотидных остатков . Изве стно , одн а ко , что фаг М 13 становится нестабильным , когда длина чужеродной ДНК пре вышает 5 тыс . нуклеотидных остатков . Фактически же векторы , полу ченные из ДНК фага М 13, и с пользуются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов , и размеры встра и в аемых в них фрагментов намного меньше. Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой ) формы ДНК фага М 13, в которую встроены "полилинкерные " участки (пример такой конструкции показан на рис . 5). В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы . Таким о б разом , этот вектор позволяет получать клонированный ген или его фрагмент как в двут я жевой , так и в однотяжевой форме . Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при опреде лении нуклеотидной последовательн ости ДНК методом Сэнгера и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов. Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью вект о ров , полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов , вир уса папиломы быка , вируса оспы и так далее . Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме : удаление "лишних " сайтов для рестриктаз , введе ние маркерных генов в области ДНК , не существенные для ее репликации (напр и мер , гена тимидин-киназы ( t k ) из HSV (вируса герпеса )), введение регуляторных районов , повышающих уровень экспрессии ге нов. Удобными оказались так называемые "челночные векторы ", спо собные реплицир о ваться как в клетках животных , так и в клетках бактерий . Их получают , сшивая друг с другом большие сегменты век торов животных и бактерий (например , SV40 и pBR 322) так , чтобы районы , ответственные за репликацию ДНК , остались незатронутыми . Это позвол я ет проводить основные операции по конструированию век тора в бактериальной клетке (что т ехнически намного проще ), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке. Рисунок 5 . Рестрикционная карта вектор а М 13 mp8. 1.3. ВЫБОР СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННОГО ГЕНА , СПОСОБНОЙ ОБЕСПЕЧИТЬ МАКСИМАЛЬНЫЙ ВЫХОД И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ ПОЛНОЦЕННОСТЬ ПРОДУКТА Полученные рекомбинантные молекулы переносятся в определенные группы кл е ток , которые должны обеспечить экспре ссию этих генов , то есть синтез соответствующих белков в количествах , экономически рентабельных по сравнению с обычной технологией их производства. Обычно для данной цели используют бактериальные или дрожжевые культуры клеток , а также системы экспрессии на основе эукариотических клеток. Из бактериальных клеток наиболее изученной в молекулярно-генетическом отн о шении является грамотрицательная бактерия Escherichia coli , поэтому для нее можно с наибольшей определенностью планировать генноинженерные конструкции . Однако E . c oli слабо освоена промышленностью . Кроме того , она относится к условно-патогенным для человека микроорганизмам , что может создать трудности при получении на ее основе фармацевтических препаратов. Отмеченные недостатки E . coli легко преодолеваю тся при конструировании мет о дами генной инженерии штаммов-продуцентов на основе клеток Bacillus subtilis . Данная почвенная бактерия безопасна для человека и животных и прекрасно освоена микроби о логической промышленностью . Бактерия B . subtilis по степени из ученности следует за E . coli . Важное отличие ее от E . coli - способность эффективно секретировать во внешнюю среду целый ряд белков , поэтому особенно интересны работы по созданию штаммов-продуцентов B . subtilis , секретирующих чужеродные белки из клеток . Од нако данная ба к терия имеет свои недостатки : рекомбинантные плазмиды в B . subtilis характеризуются н е стабильностью , выражающейся в перестройках и делециях ДНК ; бациллы секретируют в культуральную среду большое количество протеаз , что существенно усложняет в опрос максимализации генноинженерного получения целевого белка на основе бацилл-продуцентов. Среди эукариотических микроорганизмов наиболее изученным является низший эукариот Saccharomyces cerevisiae . Одно из преимуществ S . cerevisiae как экспериме н тальной системы - простота и надежность ее генетического анализа . В клетках дрожжей имеется ферментативная система гликозилирования белков , которая обеспечивает во з можность синтеза в них полноценных белков высших эукариот . Аналогичных систем процессинга белков в бактериальных клетках нет . Многие штаммы дрожжей освоены микробиологической промышленностью . Доказана их безвредность для человека и ж и вотных . Именно на S . cerevisiae создан первый штамм-продуцент поверхностного антиг е на вируса гепатита Б , позволивший полу чить и испытать вакцину против данного виру с ного заболевания человека. С появлением генной инженерии внимание многих исследователей привлекла с и стема культивируемых клеток животных . Особый интерес к культурам клеток животных стал проявляться после обнаруже ния того , что часть эукариотических генов раздроблена и лишь в системе клеток высших эукариот можно достичь правильной экспрессии таких г е нов . Кроме того , многие белки животных и их вирусов синтезируются первоначально в виде более высокомолекулярных предш ественников , которые в результате специфич е ского протеолитического процессинга переходят в так называемую зрелую форму . Такой процессинг данных белков , по-видимому , можно ожидать лишь в системе клеток живо т ных . Все это убедительно доказывает важность разра ботки экспрессирующей системы на основе клеток животных . Для обеспечения наиболее эффективной экспрессии клонированных генов в ве к торные молекулы встраивают определенные фрагменты ДНК , позволяющие увеличить выход чужеродного белка . Так , для достижения бол ее высокого уровня экспрессии гена HBsAg в клетках E . coli были использованы различные по силе промоторы (промоторы генов cat , ka n , bla , trp и тандемно расположенных промоторов генов kan и trp ). Уровни синтеза последовательностей H В sAg (нативного и в соста ве химерных белков ) составляли в зависимости от используемых конструкций векторов от 100 до 100000 молекул на кле т ку . 1.4. СОЗДАНИЕ ДОСТАТОЧНО УДОБНЫХ И ПО ВОЗМОЖНОСТИ УНИВЕРСАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЦЕЛЕВОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В КЛЕТКИ И ТКАНИ ОРГАНИЗМА Важным моментом при конструировании ДНК-вакцин является проблема целен а правленной доставки генов в необходимые клетки и защиты вводимых ДНК от действия нуклеаз крови . В результате экспериментальной работы были созданы разнообразные конструкции , позволяющие достав лять целевые гены в клетки-мишени. Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора для д о ставки генов в такие клетки , как лимфоциты и кераноциты . В качестве модельного был использован ген , кодирующий гибридный белок : фактор некроза опух олей-альфа - инте р ферон-гамма . В центре вектора находится интактная плазмидная ДНК , содержащая д о ставляемый ген , а на поверхности располагаются антитела к клеткам-мишеням . Конъюгат полиглюкина со спермидином и антителами применяется для связи компонентов ( пол о жительно заряженный спермидин обеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК ). Описанный молекулярный вектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-мишени , сводя до минимума их попадание в другие виды клеток , защищать д о ставляемые гены от нуклеаз крови и использовать положительно заряженный комплекс спермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в клетки. В настоящее время также создана векторная модель для доставки в клетки костного мозга гена , кодирующего гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (чГ-КСФ ). Данный белок относится к семейству гемопоэтических факторов роста и явл я ется одним из физиологических регуляторов , специфически и высокоэффективно стим у лирующих пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических предшественников нейтрофилов . чГ-КСФ увеличивает продолжительность жизни клеток костного мозга , усиливает функциональную активность зрелых нейтрофилов . Созданный вектор пре д ставляет собой многослойную конструкцию . "Центральным ядром " конструкции является плазмида pGGF 8, содержащая ген чГ-КСФ . Ее окружает полисахаридная оболочка , кот о рая состоит из полиглюкина и спермидина . Внешний белковый слой содержит смесь с ы вороточного альбумина и белка доставки - трансферина . Эффективность описанной ве к торной модели была доказана опытным путем. Итак , при конструировании рекомбинантных противовирусных вакцин немалова ж ное значение имеет создание специального вектора-носителя , обеспечивающего адресную доставку генов и их защиту от действия нуклеаз крови. 2. ВАКЦИНА ПРОТ ИВ ЛЕЙКЕМИИ КОШЕК, ИЗГОТОВЛЕННАЯ С ПОМОЩЬЮ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ Возбудителем лейкемии кошек является ретровирус типа С . Вирус лейкемии кошек ( FeLV ) имеет в качестве генетического материала молекулу РНК . Заболеваемость и смертность среди домашних кошек в Швейц арии довольно высока . Вакцина против FeLV , изготовленная традиционным путем , была разработана несколько лет тому назад и находится в продаже в Швейцарии . Высокая цена современных вакцин и отсутствие ув е ренности в отношении длительности эффекта и надежност и вакцины вызвали необход и мость создания вакцины с помощью генной инженерии . При конструировании рекомбинантной вакцины оболочечный протеин вируса ( env -ген ) клонировался в пивных дрожжах ( Saccharomyces cerevisiae ). Env -ген вначале лигир о вался с промотором дрожжей (пируваткиназный промотор ), а затем клонировался в так называемом " Shuttle "-векторе . Вектор " Shuttle " (челночный вектор ) может размножаться как в бактерии E . coli , так и в пивных дрожжах S . cerevisiae .Он содержит с одной стороны репликационные ори гины как для дрожжей , так и для E . coli , а с другой стороны селекц и онный маркер для дрожжей ( leu 2 ген ) и для E . coli (резистентность к ампицилину ). Из ли т ра дрожжевой культуры выделяют множество миллиграмм env -протеина и затем тестир у ют в опыте по вакцинаци и . Результат вселяет надежду : 10 кошек были иммунизированы env -протеином , причем 4 дали ответ антителами . Через 2 недели провели заражение FeLV . Теперь все животные давали ответ антителами. Таким образом , полученная вакцина оказалась эффективным средством для борьбы с данным заболеванием . СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Грен Э . Я ., Пумпен П . П . Рекомбинантные вирусные капсиды - новое поколение иммуногенных белков и вакцин // Журнал ВХО . - 1988. - т . II , № 5. - с . 531-536. 2. Дмитриев Б . А . Проблемы и перспективы создания синтетических вакцин // Иммунология . - 1986. - № 1. - с . 24-29. 3. Лебедев Л . Р ., Сизов А . А ., Масычева В . И ., Карпенко Л . И ., Рязанкин И . А . Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени // Биотехнология . - 2001. - № 1. - с . 3-12. 4. Мертвецов Н . П ., Беклемишев А . Б ., Савич И . М . Современные подходы к ко н струированию молекулярных вакцин . - Новосибирск : Наука , 1987, 210 с. 5. Сизов А . А ., Лебедев Л . Р ., Масычева В . И ., Кашперова Т . А ., Одегов А . М . Ра з работка вирус -подобной конструкции для рецептор-опосредованного транспо р та гена чГ-КСФ в клетки костного мозга in vivo // Биотехнология . - 2001. - № 1. - с . 13-18. 6. Шабарова З . А ., Богданов А . А ., Золотухин А . С . Химические основы генетич е ской инженерии . - М .: Изд-во МГУ , 1994, 224 с . 7. Щелкунов С . Н . Клонирование генов . - Новосибирск : Наука , 1986, 232 с. 8. Юров Г . К ., Народицкий Б . С ., Юров К . П . Конструирование и использование ДНК-вакцин // Ветеринария . - 1998. - № 12. - с . 25-27. 9. Hubscher U . Генная инженерия и ветеринария . Вакцины , изготовленные с п о мощью генной инженерии , и анализ высоковариабельных участков ДНК . - Schweiz . Arch . Tierheilk ., 1987, 129, № 11, 553-564.
1Архитектура и строительство
2Астрономия, авиация, космонавтика
 
3Безопасность жизнедеятельности
4Биология
 
5Военная кафедра, гражданская оборона
 
6География, экономическая география
7Геология и геодезия
8Государственное регулирование и налоги
 
9Естествознание
 
10Журналистика
 
11Законодательство и право
12Адвокатура
13Административное право
14Арбитражное процессуальное право
15Банковское право
16Государство и право
17Гражданское право и процесс
18Жилищное право
19Законодательство зарубежных стран
20Земельное право
21Конституционное право
22Конституционное право зарубежных стран
23Международное право
24Муниципальное право
25Налоговое право
26Римское право
27Семейное право
28Таможенное право
29Трудовое право
30Уголовное право и процесс
31Финансовое право
32Хозяйственное право
33Экологическое право
34Юриспруденция
 
35Иностранные языки
36Информатика, информационные технологии
37Базы данных
38Компьютерные сети
39Программирование
40Искусство и культура
41Краеведение
42Культурология
43Музыка
44История
45Биографии
46Историческая личность
47Литература
 
48Маркетинг и реклама
49Математика
50Медицина и здоровье
51Менеджмент
52Антикризисное управление
53Делопроизводство и документооборот
54Логистика
 
55Педагогика
56Политология
57Правоохранительные органы
58Криминалистика и криминология
59Прочее
60Психология
61Юридическая психология
 
62Радиоэлектроника
63Религия
 
64Сельское хозяйство и землепользование
65Социология
66Страхование
 
67Технологии
68Материаловедение
69Машиностроение
70Металлургия
71Транспорт
72Туризм
 
73Физика
74Физкультура и спорт
75Философия
 
76Химия
 
77Экология, охрана природы
78Экономика и финансы
79Анализ хозяйственной деятельности
80Банковское дело и кредитование
81Биржевое дело
82Бухгалтерский учет и аудит
83История экономических учений
84Международные отношения
85Предпринимательство, бизнес, микроэкономика
86Финансы
87Ценные бумаги и фондовый рынок
88Экономика предприятия
89Экономико-математическое моделирование
90Экономическая теория

 Анекдоты - это почти как рефераты, только короткие и смешные Следующий
Каждый день окружающие доказывают мне, что жизнь без мозга реальна.
Anekdot.ru

Узнайте стоимость курсовой, диплома, реферата на заказ.

Банк рефератов - РефератБанк.ру
© РефератБанк, 2002 - 2016
Рейтинг@Mail.ru