Получение моноклональных антител

Введение Для многих иссл едований , связанных с изучением биологич е ских структур большую ценность представляют р еагенты , способных специфически взаимодействовать с данной структурой . Универсальным реагентом , обладающим указанным свойством , считается моле кула иммуноглобулина . Несмотря на то , что иммуноглобулины , являясь а нтителами , вза имодействуют только с антигеном , то есть с молекулой способной вызвать иммунный ответ , для большинства структур удается подобрать условия , при которых они становятся антиг енами и индуцируют выработку комплиментарных антител (например , при ко н ъюгации с сильными иммуногенами ). Именно этим объясняе тся большое распространение иммунологических мет одов , связанных с использованием антител , в различных областях биологии и медицины. Серьезную проблему при применении антисывороток для идентификац ии и ко личественного определения антигено в в различных областях исследований представл яет неспецифическое связывание и перекрестная реактивность антител. История создания метода Многие исследователи пытались отыскать сп особы получения антител с узкой специфично стью . Так , при определенных условиях и ммунизации бактериальными полисахаридами удается получить высокогомогенный аппарат антител с узкой специфичностью . Кроме того , возможно сли яние плазмацитомы (опухоли , возникшей из антит елообразующей клетки или ее пред ш ественника ) с клетками селезенки иммунизированног о животного , получив таким образом гибридные клетки (гибридомы ), унаследовавшие от опухолев ых клеток способность неограниченно размножаться , а от клеток селезенки – синтезировать антитела предопределенной с п ецифично сти. Предпосылками для возникновения метода по лучения гибридом , синтезирующих моноклональные ан титела , были разработки двух методологических подходов : 1) получение ми елом , адаптация их к условиям культивирования вне организма ; 2) метод сомати ческ ой гибридизации клеток. У мышей довольно легко получить миеломы (плазмацитомы ). Эти опухоли являются потомками одной кл етки (то есть имеют моноклональное происхожде ние ) и секретируют уникальные иммуноглобулины , некоторые из которых могут взаимодействовать с известными антигенами . Опухоли индуциру ют у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного твердого пластика . Для возникновения миелом большое значение имеет генетический статус животного , и только у двух линий инбредных мышей э кспериментаторам удалось получить та кие опухоли. Миеломные клетки мыши оказались чрезвычай но удобными для изучения биохимии продукции иммуноглобулинов и дали очень многое для понимания структуры , механизмов секреции и их функции . Однако , миеломная система как источник антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей – н е удавалось иммунизировать животных , а затем получить мышиные миеломы , продуцирующие анти тела к иммунизирующие антигену . Из тысяч м иеломных опухолей , индуцированных у мыше й , лишь единичные вырабатывали иммуноглобулин ы , которые реагировали с известными антигенам и , что было обнаружено путем грубого скрин ирования с множеством потенциальных антигенов . Таким образом , миеломные белки оказывались с неизвестной антигенной специфичн о ст ью. Другой предпосылкой возникновения метода получения гибридом явилась техника гибридизации соматических клеток , разработка которых широ ко проводилась после открытия феномена спонта нной гибридизации . При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двум я или большим числом ядер – гетерокарион ы . После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро с набором хромосом от всех слившихся партнеров – образуетс я гибридная клетка . Низкую частоту образовани я гибридов можно было увеличить , исп о льзовав ряд агентов , вызывающих слияние : вирус Сендай , лизолецитин , полиэтиленгликоль . Даже при использовании агентов , повышающи х слияние , частота образующихся гибридов край не низка . Для их выделения необходимы селе ктивные среды , позволяющие расти преимущ е ственно образовавшимся гибридам . В настоящее время разработано несколько принципов селекции гибридных клеток . Одним из наиболее распрос траненных является метод , основанный на приме нении системы , содержащей гипоксантин , амидоптерин и тимидин (система ГАТ ). Селекция гибридных клеток основана на том , что в ГАТ среде родительские миело мные клетки погибают , а нормальные клетки селезенки не обладают способностью расти при данных условиях культивирования , так что выживают и размножаются только гибридные клет ки , у наследовавшие от родительских клеток способность размножаться и синтезировать спе цифические иммуноглобулины. Подготовительные этапы перед проведением слияния Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы : я иммуниз аци я животных ; я подготовка кле ток к слиянию ; я слияние ; я отбор индуциру ющих специфические антитела клонов ; я клонирование и реклонирование ; я массовая нараб отка гибридомных клеток ; я получение куль туральной жидкости или асцита , содержащих ант итела ; я выделение анти тел. Обычно вся проц едура от момента начала иммунизации до вы деления антител занимает 3-4 месяца. Организация работы и оборудован ие . Для работы по получению гибридом желательно выделить отдельное помещение . Эксперимент можно проводить и в ча сти большой комнаты , максимально удаленной от входной двери . Это помещение надо оснасти ть следующим оборудованием : 1. Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного воздуха . Стерильность обеспечивается наличием фильтров , задержи вающих частицы крупнее 0,3 мкм. 2. Инкубатор , в котором автоматически поддерживается влажность , температура и концентрация СО 2 . 3. Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами , желательн о с охлаждением. 4. Обычный и инвертированный микроскопы с фаз ово-констра стным устройством. 5. Холодильник на +4 и на – 20 0 С. 6. Водяная баня на +37 и +56 0 С. Помимо это го в отдельном помещении желательно иметь морозильник на – 70 0 С и сосуд Дьюара с жидким азотом дл я хранения клеток . Для получения гибридом нужно пр иобрести также специальную пласти ковую посуду для культуры клеток : 96-луночные планшеты с плоским дном , 24-луночные планшеты , флаконы с площадью роста 25, 75 см 2 и др ., пластиковую посуд у для проведения иммуноферментного и радиоимм унологического анализов , среды для культивир ования , необходимые реактивы , сыворотку плода коровы (СПК ). Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования . Основ ными средами , употребляемыми для получения ги бридом , являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дуль бекко . Применяются и другие среды , в частности , среда Дульбек ко в модификации Иксова . Среды выпускаются в виде готовых растворов , 10-кратных концентр атов и сухих порошков . Лучшие результаты п олучаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков , од нако при этом важное значение имеет качес тво воды . Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кв арцевой посуде вода. Выбор экспериментального животного . Обычно для иммунизации использ уют мышей и крыс . Это связано с тем , что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и , кроме э того , не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных . Другие животных практически не используют ся. При иммунизации животных иммунный о твет вырабатывается на все антигенные детерми нанты всех компонентов вводимого материала . Э то значительно осложняет отбор клонов , продуц ирующих антитела к интересующей антигенной де терминанте , так как их доля может быть крайне незначительной . Поэтому по в о зможности для иммунизации применяют очище нные антигены , по крайней мере на последни х этапах иммунизации . Одним из основных до стоинств гибридомной техники и является как раз то обстоятельство , что специфические антитела против данного антигена можно получи т ь , взяв для иммунизации неочищенн ый препарат антигена , и употребив впоследстви и эти антитела для очистки антигена. Способы иммунизации . Назначение процесса иммунизации состоит в том , чтобы увеличить долю клеток , продуци рующих антитела заданной специфичност и , и перевести эти клетки в функциональное со стояние , при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные кл етки . Экспериментально установлено , что для ги бридизации необходимы выделять селезеночные клет ки животных через 3-4 суто к после последнего введения антигена , то есть тогда , когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток. Конкретная схема иммунизации сильно завис ит от природы антигена и его иммуногеннос ти . Антигены клеточной поверхности являются с ильными имму ногенами , тогда как большинст во растворимых белков – слабые иммуногены . В последнем случае необходимо применять ра зличные адъюванты , усиливающие иммунный ответ . Среди адъювантов наибольшее распространение полу чил полный адъювант Фрейнда (ПАФ ). Помимо э тог о , используют введение антигена , п реципитированного на квасцах , и введение вмес те с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis . Обычно антиген вводят неоднократно , что необходимо для развития сильного иммунного ответа , хотя чрезмерная иммунизация может и м еть обратный эффект – отмечено , что иногда у клеток гипериммунизированных животн ых снижается способность образовывать гибридомы . В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации. По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену ( титр антит ел – величина , обратная разведению сыворотки , при которой степень иммунологической реакци и снижается в два раза по сравнению с максимальной ). Обычно это делают перед по следней иммунизацией . В опыт набирают животны х с высоким титром антител . Не с л едует ожидать хороших результатов гибриди зации , если при иммунизации животных нет о бразования антител или они образуются в н изком титре . Для большинства растворимых антигенов мож но использовать следующую схему иммунизации. 1. Вводят 1-100 мкг антигена в ПАФ или в виде преци питата на квасцах внутрибрюшинно . Если есть возможность , то одновременно вводят 2*10 9 убитых клеток B. Pertussis . 2. Через 2-3 недел и вводят антиген на физиологическом растворе внутрибрюшинно или внутривенно . Эту процедур у можно повтор ять до появления высоко го титра антител. 3. Последнюю им мунизацию делают внутривенно , через 3 суток жив отные забиваются , и готовится суспензия клето к для гибридизации. При примен ении в качестве иммуногена различных клеток (опухолевые клетки , чужеродные кл етки крови , бактерии , паразиты и т.д .) делают нес колько инъекций без адъюванта внутрибрюшинно с интервалом в 2-3 недели по (1-5)*10 7 клеток . Последнюю инъекцию делают внутривенно и через 3 дня выделяют клетки селезенки для гибридизации. В последнее время а ктивно развива ются методы полной иммунизации вне организма с целью получения гибридомы . Иммунизация in vitro имеет ряд су щественных преимуществ : a) укорачивается период иммунизации до 4-5 суток ; b) требуется с ущественно меньшее количество антигена ; c) ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный ответ (частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии ); d) повышается процент отвечающих клеток ; e) легко прове рять факторы , влияющие на эффективность иммун изации. Современные метод ы иммунизации in vitro основаны на двух системах культ ивирования лимфоцитов , разработанных в конце 1960-х годов . Метод суспензионного культивирования был первым методом , в котором иммунизация полностью проходила вне организма . Критическими факторами в данн ом методе были н изкая концентрация кислорода в атмосфере (7%), вы сокая плотность клеток , легкое покачивание ку льтуры , ежедневное добавление свежей среды и выбор подходящей партии СПК и антигена (использовали эритроциты барана ). Другой основной системой имм унизации in vitro является мет од Д . Марбрука . Клетки культивируют в мале нькой камере на диализной мембране , через которую идет обмен средой из большого рез ервуара. Одним из основных недостатков иммунизации in vitro является дол я IgM-образующих клонов . Это связано с тем , что при иммунизации in vivo клетки берут во время вторично го иммунного ответа , при котором образуются в основном антитела IgG класса , тогда как in vitro реакция идет по первичному типу , для которого характерна продукция IgM антител . Эта проб лема може т быть преодолена после отработки способов получения вторичного иммунного ответа in vitro . Слияние Существуют два основных варианта добавления ПЭГ , используемых в настоящее время . Первый метода заключаетс я в следующем . В течение 1 мин добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ при 37 0 С с постоянным перемешив анием . Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки , после чего клетки центрифуги руют и ресуспендируют в среде культивировани я. Во втором методе использу ют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ . К осадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре . Клетки центрифугируют 2 мин , затем их оставляют при комнатной темпера туре еще на 5-7 мин . Затем их разводят в большом объеме среды с сыво р откой , обмывают и культивируют. Клонирование гибридомных клеток Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток . Для н едавно образованных гибридомных клеток характерн а высокая нестабильность , связанная с утратой хромосом . При культивировании могут поя вляться клетки , потерявшие способность продуциров ать антитела и они могут перерастать анти телообразующие гибридные клетки. К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих ра зведений , клонирова ние в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора – проточного цитофлуориметра. Клонирование методом лимитирующих разведений . Если клетки посеяны в 96-луночные планшеты очень редко , то до ля лунок , в которой наблюдается рост клето к , подчиняется распре делению Пуассона : где f (0) – фракция лунок , в которых отсутствует рост ; – среднее число кл еток на лунку. При = 1 f (0) = 0,37. Для того , ч тобы получить разумную вероятность только одн ого клона в лунке , в более 37% лунок не должно наблюдаться роста клеток . Поскольку эффективность клонирования редко бывает равной 100%, клетки необходимо засеват ь при плотно сти 10, 3 и 0,5 клеток на лунку . В тех планше тах , на которых наблюдается рост в половин е лунок , содержатся изолированные клоны. При первом клонировании активной может оказаться только небольшая часть клонов . Не обходимо всегда производить повтор ное кло нирование , при котором доля положительных кло нов будет возрастать. Для клонирования надо применять клетки питающего слоя . Используются те же виды клеток , что и для начального роста гибр идом. Клонирование в полужидком агар-а гаре . Для клонирования гиб ри дом можно применять полужидкий агар . Обычно берется система , состоящая из двух слоев . Нижний (твердый ) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования . Ему дают затвердеть . Затем добавляют второй слой – мягкий , содержащий 0,3% агар-агара , в которы й вк лючаются клонируемые клетки . При использовании клеток питающего слоя их засевают в ча шку Петри до заливки агар-агара , и среду культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя агара. Колонии становятся видимыми через 7-14 суток , их переносят на жидкую культуру . Клонирование с помощью проточно го цитофлуориметра . Приготавливают ф луоресцентные микрошарики из латекса и покрыв ают их антигеном . Такие шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных клетках , что позволяет выделять их на этом п риборе. После выделения тем или иным способом положительных клонов , клетки этих клонов размножают в достаточном количестве и образцы их замораживаются. Массовая наработка моноклональных антител После отбора гибридомных клеток , синтезир ующих и нтересующие исследователя антитела , можно приступить к их массовому наращивани ю с целью получения больших количеств мон оклональных антител . В начале культивирования гибридомные клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плотность посева . В связ и с этим при пересеве к леток их надо разводить не более чем в 3-5 раз . Ускорению роста клеток может спосо бствовать добавление клеток питающего слоя . Г ибридомные клетки необходимо поддерживать в л огарифмической фазе роста и избегать повышени я концентрации к л еток выше 0,5 млн /мл . Клетки можно культивировать как в с тационарной культуре , так и в роллерной , а также в различного рода культиваторах (фе рментерах ). Для получения максимальной продукции моно клональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотн ости . В такой культур е через определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток . Надосадочная жидкость со бирается , а клеточный осадок отбрасывается , то есть не пытаются культивировать дальше о ставшиеся живые клетки. Для получения больших количеств ан тител вводят гибридомные живые клетки в организм животных и получают от них асцитную жидкость . Предварительно животным в водят агенты , повышающие способность гибридом расти в брюшной полости . В качестве таког о агента чаще всего выступает пристан – 0,5 мл з а 10-14 суток до введения клеток. Очистка антител Для многи х целей не требуется очистка антител , и они используются в виде культуральных жидк остей или асцитных жидкостей . Грубую иммуногл обулиновую фракцию можно получить высаливанием белков сульфатом аммон ия с последующим диализом . Если антитела необходимо выделить в чистом виде , то предварительно определя ют их класс и подкласс , так как способ ы очистки различаются для антител разных классов . Это можно сделать с помощью метод а иммунодиффузии по Ухтерлони . В ыделение чистых антител лучше вс его проводить на иммуносорбентах . При этом методе , однако , есть опасность , что при ф иксации изменяется антигенная структура клеточно й поверхности . Если не удается выделить антитела пря мым способом , то получают иммуноглобули но вую фракцию с помощью различных методов а ффинной и ионообменной хроматографии на сефар озес пришитым ковалентно белком А. Заключение Одна из задач клеточной инженерии сос тоит в создании клеточных систем с новыми свойствами на основе клеточных взаимодейс твий . В настоящее время совершенствуются методы иммунизации вне организма и изуча ются механизмы активации В-лимфоцитов . Это осо бенно важно для получения моноклональных анти тел человека . Одним из условий дальнейших успехов н а пути получения клеток и клеточ ных систем с новыми свойствами является углубл ение знаний , касающихся фундаментальных основ биологии : механизмов регуляции процесса клеточной дифференциации , физиологии протопластов как объекта биологической трансформации клеток , взаим оотношений клеточных органелл . Следователь но , прогресс в развитии клеточной инженерии будет в значительной степени определяться успехами в области клеточной биологии и к леточной физиологии .